Caracterización de estructuras amiloideas en el envejecimiento C. Elegans usando imágenes de por vida de fluorescencia

Resumen

La fluorescencia de por vida de los monitores de imágenes, cuantifica y distingue las tendencias de agregación de las proteínas en los modelos de enfermedad de C. elegans, vivos, envejecidos y estresados.

Resumen

Las fibrillas amiloideas están asociadas con una serie de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Huntington, Parkinson o la enfermedad de Alzheimer. Estas fibrillas amiloideas pueden secuestrar proteínas metasógenas endógenas, así como componentes de la red de proteostasis (PN) y así exacerbar el desdoblamiento de proteínas en la célula. Hay un número limitado de herramientas disponibles para evaluar el proceso de agregación de proteínas amiloideas dentro de un animal. Presentamos un protocolo para la microscopía de por vida fluorescencia (FLIM) que permite la monitorización, así como la cuantificación de la fibrilización amiloide en células específicas, como las neuronas, de manera no invasiva y con la progresión del envejecimiento y la perturbación de el PN. FLIM es independiente de los niveles de expresión del fluoróforo y permite un análisis del proceso de agregación sin más tinción o blanqueo. Los fluoróforos se calman cuando se encuentran cerca de estructuras amiloide, lo que resulta en una disminución de la vida útil de la fluorescencia. El temple se correlaciona directamente con la agregación de la proteína amiloide. FLIM es una técnica versátil que se puede aplicar para comparar el proceso de fibrilización de diferentes proteínas amiloideas, estímulos ambientales o fondos genéticos in vivo de una manera no invasiva.

Introducción

La agregación de proteínas ocurre tanto en el envejecimiento como en la enfermedad. Los caminos que conducen a la formación y deposición de grandes amiloides o inclusiones amorfas son difíciles de seguir y su cinética es igualmente difícil de desentrañar. Las proteínas pueden doblarse en sí debido a mutaciones intrínsecas dentro de sus secuencias de codificación, como en el caso de las enfermedades genéticas. Las proteínas también se multiplican por error porque la red de proteostasis (PN) que las mantiene solubles y correctamente plegadas se deteriora, como sucede durante el envejecimiento. El PN incluye chaperones moleculares y maquinarias de degradación y es responsable de la biogénesis, plegado, tráfico y degradación de proteínas¹.

C. elegans ha surgido como un modelo para estudiar el envejecimiento y la enfermedad debido a su corta vida útil, naturaleza isogénica y facilidad de manipulación genética. Se han creado varias cepas transgénicas de C. elegans que expresan proteínas causantes de enfermedades humanas en tejidos vulnerables. Es importante destacar que muchas de las cepas que contienen proteínas propensas a la agregación recapitulan el sello distintivo de los trastornos amiloide, la formación de grandes inclusiones. Gracias al cuerpo transparente de C. elegans, estos agregados se pueden visualizar in vivo, no invasiva y no destructivamente². Generar cualquier proteína de interés (POI) en fusión con un fluoróforo permite investigar sus ubicaciones, tráfico, red de interacción y destino general.

Presentamos un protocolo para monitorear la agregación de proteínas causantes de enfermedades en C. elegans vivo y envejecimiento a través de la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM). FLIM es una técnica poderosa basada en la vida útil de un fluoróforo, en lugar de sus espectros de emisión. La vida útil (tau, ) se define como el tiempo promedio requerido por un fotón para decaer desde su estado excitado hasta su estado de suelo. La vida útil de una molécula dada se calcula con la técnica de dominio del tiempo del recuento de fotones individuales correlacionados por el tiempo (TCSPC). En TCSPC-FLIM, la función de descomposición fluorescente se obtiene excitando el fluoróforo con pulsos láser cortos y de alta frecuencia y midiendo los tiempos de llegada del fotón emitido a un detector con respecto a los pulsos. Al escanear una muestra, se crea una matriz de datos tridimensional para cada píxel: la matriz incluye información sobre la distribución de los fotones en sus coordenadas espaciales x,y y su curva de decaimiento temporal. Por lo tanto, una muestra determinada se convierte en un mapa de vidas útiles que revela información sobre la estructura, la unión y el entorno^dela proteína^3,4. Cada proteína fluorescente posee una vida útil intrínseca y definida con precisión, generalmente de unos pocos nanosegundos (ns), dependiendo de sus propiedades fisioquímicas. Es importante destacar que la vida útil de un fluoróforo es independiente de su concentración, intensidad fluorescente y de la metodología de imagen. Sin embargo, dentro de un sistema biológico, puede verse afectado por factores ambientales como el pH, la temperatura, las concentraciones ióndas, la saturación de oxígeno y sus socios de interacción. La vida útil también es sensible a los cambios estructurales internos y la orientación. La fusión de un fluoróforo en un PDI da lugar a un cambio en su vida útil y, en consecuencia, a información sobre el comportamiento de la proteína fusionada. Cuando un fluoróforo está rodeado o encapsulado en un entorno estrechamente unido, como las hojas beta antiparalelas de una estructura amiloide, pierde energía de forma no radiativa, un proceso conocido como temple^5. El enfriamiento del fluoróforo da como resultado un acortamiento de su vida útil aparente. Cuando es soluble, la vida útil de una proteína se mantendrá más cerca de su valor original y más alto. Por el contrario, cuando una proteína comienza a acumularse, su vida útil inevitablemente cambiará a un valor más bajo^6,7. Por lo tanto, se hace posible monitorear la propensión a la agregación de cualquier proteína formador de amiloide a diferentes edades en C. elegans vivos.

Aquí describimos un protocolo para analizar la agregación de una proteína de fusión que comprende diferentes estiramientos de poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 y Q85). Ilustramos cómo la técnica se puede aplicar por igual a diferentes fluoróforos, como la proteína fluorescente cian (CFP), la proteína fluorescente amarilla (YFP) y la proteína fluorescente roja monomérica (mRFP); y en todos los tejidos de C. elegans,incluyendo las neuronas, los músculos y el intestino. Además, en el contexto de la proteostasis, FLIM es una herramienta muy útil para observar los cambios en el agotamiento de los chaperones moleculares. Derribar uno de los chaperones moleculares clave, la proteína de choque térmico 1 (hsp-1), a través de la interferencia de ARN produce un desdoblamiento prematuro de las proteínas. El aumento de la carga de agregación como resultado del envejecimiento, la enfermedad o los chaperones deficientes, se mide entonces como una disminución en la vida útil de la fluorescencia.

Protocolo

1. Sincronización de C. elegans

1. Sincronizar C. elegans ya sea a través de un tratamiento de solución de hipoclorito alcalino o mediante una simple puesta de huevos durante 4 h a 20 oC⁸.
2. Cultivar y mantener nematodos a 20oC en placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con OP50 E. coli según los procedimientos estándar⁹. Envejecer los nematodos hasta la etapa o día de desarrollo deseado.
   NOTA: En este protocolo, los adultos jóvenes son imágenes el día 4 y los nematodos viejos se imágen el día 8 de la vida.

2. Derribo mediado por ARAi de maquinaria de chaperón a través de la alimentación

NOTA: Realice el derribo de la proteína de choque térmico 1 (hsp-1) chaperona alimentando el vector RNAi correspondiente a los nematodos¹⁰. El plásmido hsp-1 RNAi se obtuvo de la biblioteca Ahringer (ID de clon: F26D10.3).

1. Cultivar el HT115 (DE3) E. coli expresando el plásmido hsp-1 RNAi durante 6 horas hasta la noche en el medio luria Bertani (LB) que contiene 50 g/ml de ampicilina.
2. Preparar placas frescas de agar NGM que contengan isopropilo-D-1-tiogalactopiranoside (IPTG; 1 mM) y ampicilina (25 g/ml) y semilla con la bacteria hsp-1 RNAi. Deje que las placas se sequen e induzcan a temperatura ambiente durante 1-3 días.
3. Colocar los huevos sincronizados en una placa de siRNA y dejar eclosionar, o colocar nematodos gravid y dejar poner los huevos durante 4 h a 20 oC antes de retirarlos. Cultivar los nematodos hasta la edad o etapa deseada.
   NOTA: La segunda generación de nematodos podría presentar un fenotipo más fuerte del derribo. El protocolo siRNA y las condiciones descritas aquí son generales y se adaptan a hsp1. La interferencia de ARN a través de siRNA de un clon/gen específico debe ser establecida y optimizada por el usuario final. Es importante tener en cuenta que no todos los siRNA tienen la misma eficiencia, por lo que se recomienda probar la eficacia del derribo mediante la cuantificación mediante la reacción en cadena cuantitativa de la transcripción inversa de la polimerasa (RT-qPCR) o la mancha occidental.

3. Preparación de diapositivas de microscopía

1. El día de la toma de imágenes, comience por preparar las diapositivas de imágenes. Derretir agarosa en ddH₂O a una concentración de 3% (p/v) y dejar enfriar ligeramente.
2. Corte la punta de una punta de pipeta de 1 ml y tome aproximadamente 200 ml de agarosa derretida. Pipetear la agarosa sobre un tobogán de vidrio limpio e inmediatamente colocar una segunda en la parte superior, evitando la formación de cualquier burbuja. Dejar secar y retirar suavemente el portaobjetos superior de vidrio. El resultado es un portaobjetos de vidrio con una superficie de agarosa uniforme donde se colocarán los nematodos.
   NOTA: Cada diapositiva se utilizará para crear imágenes entre 5-10 nematodos. Las diapositivas se pueden preparar y almacenar durante unas horas en una caja humificada para evitar que la agarosa se seque.

4. Montaje de nematodos en diapositivas de microscopía

NOTA: FLIM requiere que los nematodos sean inmovilizados. Realice este paso una vez que la configuración de imágenes (por ejemplo, microscopios, láseres, detectores) esté lista para su uso.

1. Usando un pico de alambre de platino, coloque los nematodos de la edad deseada en una placa fresca sin sembrar y déjelos gatear para eliminar el exceso de bacterias OP50 de sus cuerpos.
2. Preparar el compuesto anestésico (azida sódica o levamisol) para inmovilizar el nematodo. Mantener un stock de 500 mM NaN₃ en la oscuridad a 4oC y diluir en ddH₂2 O fresco a una concentración final de 250 mM. Si utiliza levamisol, diluir un stock de 20 mM a una solución de trabajo de 2 mM en ddH₂O.
   ADVERTENCIA: El azida sódica (NaN₃) es altamente tóxico. Use guantes y gafas protectoras y trabaje bajo una capucha ventilada.
3. Trabajando bajo un estereomicroscopio, coloque una gota de 10 s de compuesto anestésico en una almohadilla de agarosa y transfiera suavemente 5-10 nematodos en ella. Usa una punta de pestañas para separar los nematodos. Manténgalos unidos pero sin tocar para permitir una localización más fácil de los nematodos durante la adquisición de la imagen.
4. Superponga cuidadosamente los nematodos con un cubreobjetos. Tome medidas dentro de 1 h después del montaje.
   NOTA: Ambos anestésicos acabarán matando a C. elegans. Los nematodos deben estar completamente inmóviles durante la toma de imágenes, ya que el mapa de la vida útil se registra desde cada píxel. Cualquier movimiento de los parámetros x,y impide la lectura de la vida útil en el mismo píxel excitado.

5. Adquisición de datos FLIM

NOTA: En este protocolo, la vida útil del fluoróforo se adquiere mediante el método TCSPC de dominio temporal. FLIM requiere que el láser genere un pulso de luz a un ajuste y una tasa de repetición constante. La tasa de repetición varía según el tipo de láser y debe ser conocida por el usuario. Las mediciones de por vida se logran mediante detectores y equipos electrónicos instalados junto con un microscopio convencional. En este protocolo, las mediciones se realizan en tres microscopios confocales de escaneo láser diferentes con detectores y software proporcionados por dos empresas diferentes (Tabla de Materiales)para la adquisición de vidas de mRFP, CFP y YFP, respectivamente. Compruebe que los filtros correctos de emisión/excitación están en su lugar y minimice cualquier fondo o monitor de retroiluminación antes de comenzar. Antes de comenzar cualquier experimento, establezca la fotoestabilidad del fluoróforo elegido. Si el fluoróforo se blanquea en poco tiempo dentro de los tejidos de nematodos, no es adecuado para las mediciones de FLIM en C. elegans.

1. Abra el software de adquisición FLIM. El software FLIM también permite el control del microscopio confocal. Busque la pestaña/botón para permitir que se activen las salidas del detector y pulse Activar salidas.
2. Adquirir la función de respuesta del instrumento (IRF), que describe la precisión de temporización de la configuración instrumental.
   NOTA: Este paso debe realizarse preferentemente antes de montar los nematodos.
   1. Si está disponible, retire los filtros de excitación/emisión.
   2. Coloque una cubierta vacía por encima del objetivo y encuentre su superficie. Registre la señal de dispersión obtenida de la cubierta durante un mínimo de 30 s.
      NOTA: Para una vida útil de varios nanosegundos, el software de adquisición puede estimar automáticamente el desplazamiento IRF. Siempre se recomienda adquirir un IRF.
3. Coloque el portaobjetos con los C. elegans montados en el escenario. Usando una lente de aumento de 10x en modo de transmisión y localizando la posición de los nematodos en la diapositiva.
4. Retire la corredera, cambie el objetivo a una lente de aumento de 63x y aplique el medio de inmersión requerido (por ejemplo, aceite). Sustituya la diapositiva en el escenario y localice los nematodos.
5. Localice Pinhole Manager en el software de adquisición y ábralo al máximo. Comience a escanear la muestra, seleccione una región de interés (por ejemplo, cabeza, cuerpo superior) y concéntrese en su plano de proyección máximo.
6. Supervise la frecuencia de pulso láser y los otros tres valores presentes en la interfaz del software: el discriminador de fracción constante (CFD), el tiempo de amplitud (TAC) y el convertidor analógico a digital (ADC).
   NOTA: El láser debe tener una puerta máxima de 1 x 10⁸ recuentos de fotones individuales. Este número representa el número máximo de fotones suministrados por el láser. El CFD proporciona información sobre la recepción del pulso de fotón único en referencia al pulso láser por el detector. Este valor debe ser aproximadamente 1 x 10⁵. El TAC discrimina entre el momento en que se detectó un fotón y el siguiente pulso láser. Finalmente, el ADC convierte el voltaje TAC en una señal de memoria almacenable^11. El CFD, TAC y ADC deben tener valores similares para asegurarse de que los fotones emitidos por el fluoróforo no se pierdan. La evaluación correcta de estos parámetros garantiza que se recopilen suficientes fotones para crear un mapa de duración preciso.
7. En la interfaz del software FLIM, previsualice el número de fotones detectados: el valor ADC debe estar entre 1 x 10⁴ y 1 x 10⁵. Si es necesario, cambie el foco en un plano diferente o aumente la potencia del láser para recoger más fotones.
   NOTA: En general, el número de fotones grabados por segundo no debe exceder el 1% de la tasa de repetición del láser.
8. En la barra de menús, seleccione la pestaña para establecer los parámetros de adquisición. Seleccione Scan sync in (Sincronización de escaneo) para permitir la detección de fotones individuales.
9. Establezca la adquisición en una cantidad fija de tiempo o un número fijo de fotones. Por ejemplo, adquiera una curva de decaimiento de por vida durante 2 minutos o hasta que un solo píxel alcance un recuento de fotones de 2.000 eventos individuales. Pulse Iniciar para iniciar la adquisición.
   NOTA: Diferentes fluoróforos requerirán diferentes láseres y filtros de excitación y emisión. De acuerdo con el brillo de la muestra, la potencia del láser también se puede ajustar, lo que no interferirá con la vida útil. Estos protocolos utilizan los siguientes ajustes de excitación/emisión: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Se empleó un láser pulsado de dos fotones para mediciones de CFP utilizando ex800/em440 nm. La cantidad de tiempo y el recuento de fotones necesarios para la adquisición de un mapa FLIM tendrá que establecerse empíricamente para cada configuración y cada propósito experimental.

6. Análisis de datos FLIM utilizando el software FLIMfit

NOTA: Realice análisis de datos utilizando la herramienta de software FLIMfit desarrollada en el Imperial College London¹² (consulte la figura 1).

1. Abra el software e importe los archivos de datos FLIM a través de Archivo . Cargar datos FLIM. Cargar todas las muestras de una sola condición, incluso si se obtienen en diferentes sesiones y de diferentes repeticiones biológicas.
2. Si es necesario, segmente un solo nematodo de cualquier imagen FLIM a través de Segmentación . Administrador de segmentación. Arrastre la herramienta de recorte alrededor del área de interés hasta que se resalte. Una vez completado, pulse OK.
   NOTA: La segmentación debe realizarse para todas las imágenes.
3. Seleccione una pequeña región donde aparezca la imagen basada en intensidad de un C. elegans (Figura 1,Flechas 1). La curva de descomposición de esa región aparecerá en la ventana de descomposición grande en el lado derecho de la interfaz(Figura 1,Flecha 2).
   NOTA: La descomposición se puede mostrar lineal o lógicamente.
4. Establezca los parámetros correctos para extrapolar la duración a través del algoritmo del software como se describe en los pasos 6.5-6.8.
5. En la lengueta de los datos (figura 1,flecha 3):
   1. Establezca un valor mínimo integrado arbitrario para excluir los píxeles demasiado tenues para producir un buen ajuste. Dependiendo de la muestra de C. elegans este valor varía de 40-300. Introduzca valores diferentes hasta que se logre una vista previa satisfactoria.
   2. Seleccione un número de tiempo mínimo y un número de tiempo máximo para limitar la señal FLIM a estos valores. Se excluirán todos los eventos que aparezcan antes y después de este umbral.
      NOTA: Por ejemplo, para el análisis de mRFP, se excluyeron los eventos anteriores a 800 ps y después de 4.000 ps. Estos valores dependen de la duración del fluoróforo y deben ser determinados por el usuario final.
   3. No cambie los recuentos/fotones predefinidos de 1.
   4. Introduzca la tasa de repetición, en MHz, del láser utilizado durante la adquisición.
      NOTA: Para el protocolo actual, se utilizaron diferentes láseres con varias tasas de repetición. El láser de dos fotones utilizado para la adquisición de vidas de CFP posee una tasa de repetición de 80 MHz, para YFP el láser se repite a 40 MHz, y para mRFP el valor es de 78,01 MHz. Estos valores se introdujeron en FLIMfit de acuerdo con la muestra analizada.
   5. Introduzca un valor de Gate Max para excluir todos los píxeles saturados.
      NOTA: Para las mediciones de por vida en C. elegans, este valor se establece en cualquier número grande (por ejemplo, 1 x 10⁸).
6. En la ficha Duración, seleccione un empalme global que se utilizará (por ejemplo, un ajuste en píxel). Vea el cuadro 1,la flecha 4.
   NOTA: Un ajuste en píxeles producirá una descomposición ajustada a cada píxel individual. Un ajuste de imagen producirá un ajuste global de cada imagen individual y mostrará un único valor de duración por imagen. Un ajuste global producirá un único ajuste en todo el dataset. Se proporciona un único valor de duración para todas las imágenes.
7. No cambie ningún otro parámetro excepto el No. Exp selección si se sabe que la decadencia de fluorescencia elegida es multiexponencial y exhibe más de una sola vida útil.
   NOTA: En el protocolo actual, esta función se utilizó para calcular la duración del fluoróforo CFP biexponencial.
8. Cargue el IRF a través del menú IRF: IRF Cargar IRF. Para estimar el desplazamiento de IRF, seleccione IRF ( IRF) Estimar desplazamiento IRF. Un conjunto de valores aparecerá automáticamente en la pestaña IRF. Una vez que esto se establece, no cambie ningún otro parámetro de esta pestaña.
9. Una vez establecidos todos los parámetros, presione Ajustar conjunto de datos (Figura 1, Flecha 5). El algoritmo producirá un ajuste para la curva de decaimiento y establecerá un valor de duración para cada imagen.
   NOTA: El ajuste resultante, resaltado en una línea azul, debe superponerse con todos los eventos. Se obtiene un buen ajuste cuando todos los eventos están alineados a lo largo del ajuste.
10. Haga clic la lengueta de los parámetros (figura 1,flecha 6), situada dentro de los menús superiores derecho de la interfaz del software, y seleccione la estadística: w_mean (media ponderada) y marque que el valor chi2 está tan cerca como sea posible a 1.
    NOTA: Un chi2 cerca de uno garantiza la precisión del ajuste. De este modo, el valor de duración de la imagen seleccionada se revela como tau_1.
11. Exportar cualquier información de interés: Archivo ? Exportar imágenes de intensidad/Ajustar tabla de resultados/Imágenes/Histogramas. Guardar la configuración de datos que se utiliza para calcular la duración: Archivo ? Guardar configuración de datos.
    NOTA: Los parámetros empleados se guardarán para un análisis futuro de las muestras seleccionadas.

7. Representaciones gráficas de los datos FLIM

NOTA: Las vidas recogidas de diferentes muestras se pueden representar visualmente de varias maneras. Seleccione esta opción para denotar los valores de duración en nanosegundos o picosegundos.

1. Muestre la calidad del ajuste y la precisión de la curva exportando la curva de descomposición directamente desde FLIMfit.
2. Representar la distribución de los fotones trazando la frecuencia del recuento de fotones frente al valor de duración en un histograma.
3. Por último, para la comparación estadística, si compara dos o más muestras, coloque valores de vida útil más la desviación estándar de la media en un gráfico de barras de gráfico de dispersión. Realice cualquier análisis estadístico deseado.

Resultados

El protocolo muestra cómo monitorear con precisión la formación de especies agregadas en C. elegans vivos,tanto durante su envejecimiento natural como cuando se somete al estrés. Seleccionamos cuatro cepas diferentes de nematodos transgénicos que expresan proteínas de poliglutamina de repeticiones 40Q, 44Q o 85Q. Estas proteínas se sintetizan en diferentes tejidos y se fusionaron a diferentes fluoróforos. Las cepas de C. elegans expresaron Q40-mRFP en los múscul...

Discusión

El protocolo presentado aquí describe una técnica basada en microscopía para identificar especies agregadas en el sistema modelo C. elegans. FLIM puede caracterizar con precisión la presencia de especies agregadas y solubles fusionadas a un fluoróforo a través de la medición de sus desintegraciones de vida útil de fluorescencia. Cuando una proteína de fusión comienza a agregar su vida útil promedio registrada cambiará de un valor más alto a un valor más bajo¹⁶. La propensió...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
Ampicillin	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC Image	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
C. elegans iQ44-YFP	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OG412
C. elegans iQ85-YFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP			Kind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	Leica Camera AG		Mounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5	Leica Camera AG		Confocal Microscope
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM Aquisition software
Sodium Azide	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	Anesthetic
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
Universal Agarose	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLO	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope