Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

Özet

Floresan yaşam boyu görüntüleme, proteinlerin yaşam, yaşlanma ve stresli C. elegans hastalık modellerinde toplama eğilimlerini ölçer, ölçer ve ayırt eder.

Özet

Amiloid fibrils Huntington gibi nörodejeneratif hastalıkların bir dizi ile ilişkilidir, Parkinson, veya Alzheimer hastalığı. Bu amiloid fibrils endojen metastabil proteinlerin yanı sıra proteostaz ağı bileşenleri (PN) sequester ve bu nedenle hücrede protein misfolding şiddetlendirebilir. Bir hayvan içinde amiloid proteinlerin toplama sürecini değerlendirmek için araçlar sınırlı sayıda vardır. Floresan yaşam boyu mikroskopi (FLIM) için nöronlar gibi belirli hücrelerde amiloid fibrilizasyonun izlenmesine ve ölçülmesine olanak tanıyan bir protokol sayılarak, yaşlanmanın ilerlemesi ve PN. FLIM florofor ifade düzeylerinden bağımsızdır ve daha fazla boyama veya ağartma olmadan toplama işleminin analizini sağlar. Florofororlar amiloid yapıların yakın çevresinde olduklarında söndürülürler, bu da floresan ömrün azalmasına neden olur. Söndürme doğrudan amiloid proteininin agregasyonu ile ilişkilidir. FLIM, farklı amiloid proteinlerin fibrilizasyon sürecini karşılaştırmak için uygulanabilen çok yönlü bir tekniktir, çevresel uyaranlar, ya da in vivo genetik arka planlar non-invaziv bir şekilde.

Giriş

Protein toplama hem yaşlanma da hem de hastalıkta görülür. Büyük amiloidlerin veya amorf inklütiflerin oluşumuna ve birikmesine yol açan yolları takip etmek zordur ve kinetiklerinin çözülmesi de benzer şekilde zordur. Proteinler genetik hastalıklarda olduğu gibi kodlama sekanslarındaki içsel mutasyonlara bağlı olarak yanlış katlanabilirler. Proteinler de yanlış çünkü proteostaz ağ (PN) onları çözünür ve düzgün katlanmış tutar bozulmuş, yaşlanma sırasında olur. PN moleküler şaperonlar ve bozulma makineleri içerir ve biyogenez sorumludur, katlama, ticareti, ve proteinlerin bozulması^1.

C. elegans kısa ömrü nedeniyle yaşlanma ve hastalık çalışma modeli olarak ortaya çıkmıştır, izojenik doğa, ve genetik manipülasyon kolaylığı. Hassas dokularda insan hastalığına neden olan proteinleri ifade eden çeşitli C. elegans transgenik suşları oluşturulmuştur. Daha da önemlisi, agregasyona eğilimli proteinler içeren suşların çoğu amiloid bozukluklarının damgasını, büyük inklütiflerin oluşumunu özetler. C. elegans 'şeffaf vücut sayesinde, bu agregalar invivo görselleştirilmiş olabilir, noninvaziv ve nondestructively². Bir florofor ile füzyon ilgi herhangi bir protein (POI) üreten yerleri, kaçakçılık, etkileşim ağı ve genel kaderi araştırmak için izin verir.

Floresan yaşam boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) ile yaşayan ve yaşlanan C. elegans'de hastalığa neden olan proteinlerin toplanması nın izlenmesi için bir protokol sokulmaktadır. FLIM, emisyon spektrumlarından ziyade florofor ömrüne dayanan güçlü bir tekniktir. Yaşam süresi (tau, τ) bir fotonun heyecanlı durumundan yer durumuna geri çürümek için gerekli ortalama süre olarak tanımlanır. Belirli bir molekülün ömrü zaman-ilişkili tek foton sayma (TCSPC) zaman-etki alanı tekniği ile hesaplanır. TCSPC-FLIM'de floresan bozunma fonksiyonu, kısa, yüksek frekanslı lazer darbeleri ile floroforheyecan verici ve yayılan fotonun varış sürelerinin darbelerle ilgili olarak bir dedektöre göre ölçülmesi ile elde edilir. Bir örnek tararken, her piksel için üç boyutlu bir veri dizisi oluşturulur: dizi, x,y uzamsal koordinatlarındaki fotonların dağılımı ve zamansal bozunma eğrisi hakkında bilgiler içerir. Bu nedenle verilen bir örnek, proteinin yapısı, bağlanması ve çevre^3,4. Her floresan protein, genellikle birkaç nanosaniye (ns) olan, fiziksel özelliklerine bağlı olarak içsel ve tam olarak tanımlanmış bir yaşam süresine sahiptir. Daha da önemlisi, bir florofor ömrü konsantrasyonu, floresan yoğunluğu ve görüntüleme metodolojisi bağımsızdır. Ancak, biyolojik bir sistem içinde, pH, sıcaklık, iyon konsantrasyonları, oksijen doygunluğu ve etkileşim ortakları gibi çevresel faktörlerden etkilenebilir. Yaşam ömürleri iç yapısal değişikliklere ve oryantasyona karşı da hassastır. Bir poi için bir florofor eritme ömrü nde bir değişiklik ve dolayısıyla erimiş proteinin davranışı hakkında bilgi sonuçlanır. Bir florofor, amiloid yapının antiparalel beta sayfaları gibi sıkıca bağlanmış bir ortamda çevrili veya kapsüllendiğinde, 5.⁵ Florofor un söndürülme, görünür ömrünün kısalmasıyla sonuçlanır. Çözündüğünde, bir proteinin ömrü orijinal, daha yüksek değerine daha yakın kalır. Buna karşılık, bir protein toplambaşlar, ömrü kaçınılmaz olarak daha düşük bir^değerekayacak 6^,7. Bu nedenle, yaşayan C. elegansfarklı yaşlarda herhangi bir amiloid oluşturan proteinin toplama eğilimini izlemek mümkün olur.

Burada farklı poliglutamin (CAG, Q) uzanır (Q40, Q44 ve Q85) oluşan bir füzyon proteininin agregasyon analiz etmek için bir protokol açıklar. Tekniğin siyan floresan protein (CFP), sarı floresan protein (YFP) ve monomerik kırmızı floresan protein (mRFP) gibi farklı floroforlara nasıl eşit olarak uygulanabileceğini gösteriyoruz; ve C. eleganstüm dokularda , nöronlar da dahil olmak üzere, kaslar, ve bağırsak. Ayrıca, proteostaz bağlamında, FLIM moleküler şaperonların tükenmesi üzerine değişiklikleri gözlemlemek için çok yararlı bir araçtır. RNA girişim yoluyla önemli moleküler şaperon, ısı şok proteini 1(hsp-1)yıkmak proteinlerin erken yanlış bağlanmasına neden olur. Yaşlanma, hastalık veya eksik şaperonların bir sonucu olarak toplama yükündeki artış, daha sonra floresan yaşam süresinde bir azalma olarak ölçülür.

Protokol

1. C. eleganların senkronizasyonu

1. Senkronize C. elegans ya alkali nhipoklorit çözeltisi tedavisi ile ya da basit yumurtlama yoluyla 4 saat 20 °C⁸.
2. Standart prosedürlere göre OP50 E. coli ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM)^plakalarıüzerinde 20 °C'de nematodyetiştirin ve bakımını yap. Yaş nematodlar istenilen gelişim aşaması veya güne kadar.
   NOT: Bu protokolde genç yetişkinler 4.

2. RNAi aracılı refakat makineleri besleme yoluyla nakavt

NOT: Nematodlar¹⁰ilgili RNAi vektörbe besleyerek ısı şok proteini 1(hsp-1) şaperon knockdown gerçekleştirin. HSP-1 RNAi plazmidahringer kütüphanesinden elde edildi (klon kimliği: F26D10.3).

1. 50 g/mL ampisilin içeren Luria Bertani (LB) ortamında 6 saat boyunca hsp-1 RNAi plazmidini ifade eden HT115 (DE3) E. coli'yi büyütün.
2. İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) ve ampisilin (25 g/mL) içeren taze NGM agar plakaları ve hsp-1 RNAi bakterisi ile tohum hazırlayın. Tabakları kurumaya bırakın ve oda sıcaklığında 1-3 gün bekletin.
3. Senkronize yumurtaları bir siRNA plakasına yerleştirin ve yumurtadan çıkmaya bırakın veya gravid nematodları yerleştirin ve çıkarmadan önce 20 °C'de 4 saat yumurtlayın. İstenilen yaş veya aşamaya kadar nematodlar büyümek.
   NOT: İkinci nesil nematodlar nakavtın daha güçlü bir fenotipini ortaya çıkabilir. Burada açıklanan siRNA protokolü ve koşulları geneldir ve hsp1'euyarlanmıştır. Belirli bir klonun/genin siRNA ile RNA girişimlerinin son kullanıcı tarafından kurulması ve optimize edilmesi gerekir. Tüm siRNA'nın aynı verime sahip olmadığını ve bu nedenle de kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) veya Batı lekeleri ile darbenin etkinliğini nicel olarak test edilmesi tavsiye edilir.

3. Mikroskopi slaytlarının hazırlanması

1. Görüntüleme gününde, görüntüleme slaytları hazırlayarak başlayın. % 3 (w / v) bir konsantrasyonda ddH₂O eriyen agarose ve biraz soğumaya bırakın.
2. 1 mL pipet ucunu kesin ve yaklaşık 200 μL erimiş agarose alın. Pipet temiz bir cam slayt üzerine agarose ve hemen üstüne ikinci bir yerleştirin, herhangi bir kabarcıkoluşumukaçınarak. Kurumaya bırakın ve üst teki cam kaydırağı nazikçe çıkarın. Sonuç nematodlar konumlandırılmış olacak eşit bir agarose yüzeyi ile bir cam slayt.
   NOT: Her slayt 5-10 nematodlar arasında görüntü için kullanılacaktır. Slaytlar, agarose'un kurumasını önlemek için humified bir kutuda birkaç saat hazırlanabilir ve saklanabilir.

4. Nematodların mikroskopi slaytlarına montajı

NOT: FLIM nematodların hareketsiz hale getirilmesigerekir. Görüntüleme kurulumu (örn. mikroskoplar, lazerler, dedektörler) kullanıma hazır olduğunda bu adımı gerçekleştirin.

1. Platin tel pick kullanarak, taze tohumsuz plaka üzerine istenilen yaş nematodları yerleştirin ve onları vücutlarından fazla OP50 bakteri kaldırmak için tarama izin.
2. Nematod'u hareketsiz hale getirmek için anestezik bileşiği (sodyum azitveya levamisole) hazırlayın. 500 mM NaN₃ stoğunu 4 °C'de karanlıkta tutun ve taze ddH₂O'da 250 mM'lik son konsantrasyona seyreltin. Levamisole kullanıyorsanız, ddH₂O'da 20 mM'lik bir stoğu 2 mM çalışma çözeltisine seyreltin.
   DİkKAT: Sodyum azit (NaN₃₎son derece zehirlidir. Eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ve havalandırmalı bir başlık altında çalışın.
3. Stereomikroskop altında çalışarak, bir agarose ped üzerine 10 μL'lik bir anestezik bileşiği yerleştirin ve 5-10 nematod'u yavaşça içine aktarın. Nematodları ayırmak için kirpik ucu kullanın. Görüntü edinimi sırasında nematodların daha kolay yerelleştirilmesine olanak sağlamak için onları birbirine yakın tutun, ancak dokunmadan tutun.
4. Dikkatle bir coverslip ile nematodlar bindirme. Montajdan sonra 1 saat içinde ölçümler alın.
   NOT: Her iki anestezi sonunda C. elegansöldürecek . Nematodlar görüntüleme sırasında tamamen hareketsiz olmalıdır, çünkü yaşam süresinin haritası her pikselden kaydedilir. x,y parametrelerinin herhangi bir hareketi aynı heyecanlı pikselde ömür boyu okunmasını engeller.

5. FLIM verilerinin elde edilmesi

NOT: Bu protokolde florofor ömrü zaman alan TCSPC yöntemi ile elde edilir. FLIM bir dizi ve sabit tekrarlama hızında lazer tarafından oluşturulacak bir ışık darbesi gerektirir. Tekrarlama oranı lazer türüne göre değişir ve kullanıcı tarafından bilinmesi gerekir. Ömür boyu ölçümler, konvansiyonel mikroskopun yanına monte edilen dedektörler ve elektronik ekipmanlar la gerçekleştirilir. Bu protokolde, mRFP, CFP ve YFP ömürlerinin elde edilmesi için iki farklı şirket(Malzeme Tablosu)tarafından sağlanan dedektörler ve yazılımlarla üç farklı lazer tarama konfokal mikroskopüzerinde ölçümler yapılmaktadır. Emisyon/uyarma doğru filtreler yerinde olup olmadığını kontrol edin ve başlamadan önce herhangi bir arka plan veya monitör arka ışık en aza indirmek. Herhangi bir deneye başlamadan önce, seçilen florofor fotostabilitesi kurmak. Florofor nematod dokuları içinde kısa bir süre içinde beyazlıyorsa, C. elegans'taFLIM ölçümleri için uygun değildir.

1. FLIM satın alma yazılımını açın. FLIM yazılımı aynı zamanda konfokal mikroskobun kontrolünü de sağlar. Dedektörün çıktılarının etkinleştirilmesiiçin sekmeyi/düğmeyi bulun ve Çıkışları Etkinleştir'ebasın.
2. Enstrümantal kurulumun zamanlama hassasiyetini açıklayan enstrüman yanıt işlevini (IRF) edinin.
   NOT: Bu adım nematodları monte etmeden önce tercihen yapılmalıdır.
   1. Varsa, uyarma/emisyon filtrelerini çıkarın.
   2. Hedefin üzerine boş bir kapak kaydırıcını yerleştirin ve yüzeyini bulun. Kapak tan elde edilen dağılım sinyalini en az 30 s olarak kaydedin.
      NOT: Birkaç nanosaniyelik ömürler boyunca, satın alma yazılımı Otomatik olarak IRF kaydırma tahmin edebilirsiniz. Bir IRF edinme her zaman önerilir.
3. Slaytı monte edilmiş C. elegans ile sahneye yerleştirin. Şanzıman modunda 10x büyütme lensi kullanmak ve slayttaki nematodların konumunu yerelleştirin.
4. Slaytı çıkarın, hedefi 63x büyütme merceği ile değiştirin ve gerekli daldırma ortamını (örn. yağ) uygulayın. Sahnedeki slaytı değiştirin ve nematodları yerelleştirin.
5. Satın alma yazılımında Pinhole Yöneticisi'ni bulun ve Maksimum'aaçın. Numuneyi taramaya başlayın, ilgi çekici bir bölge seçin (örn. kafa, üst gövde) ve maksimum projeksiyon düzlemine odaklanın.
6. Lazer darbe hızını ve yazılımın arabiriminde bulunan diğer üç değeri izleyin: Sabit Kesir Ayırıcı (CFD), Zaman-To-Genlik (TAC) ve Analog-to-Dijital Dönüştürücü (ADC).
   NOT: Lazer 1 x 10⁸ tek foton sayısı maksimum kapısı olmalıdır. Bu sayı lazer tarafından sağlanan en fazla foton sayısını temsil eder. CFD dedektör tarafından lazer darbe referans tek foton darbe alınması hakkında bilgi sağlar. Bu değer kabaca 1 x 10⁵olmalıdır. TAC, bir fotonun tespit edildiği zaman ile bir sonraki lazer darbesi arasında ayrım yapıyor. Son olarak, ADC, TAC voltajını storable bellek sinyaline dönüştürür^11. CFD, TAC ve ADC, florofor tarafından yayılan fotonların kaybolmamasını sağlamak için benzer değerlere sahip olmalıdır. Bu parametrelerin doğru değerlendirilmesi, doğru bir yaşam boyu haritası oluşturmak için yeterli sayıda foton toplanmasını sağlar.
7. FLIM yazılımının arabiriminde, algılanan fotonların sayısını önizleme: ADC değeri 1 x 10⁴ ve 1 x 10⁵arasında olmalıdır. Gerekirse, farklı bir düzlemde odak kayması veya daha fazla foton toplamak için lazer gücünü artırmak.
   NOT: Genel olarak, saniyede kaydedilen foton sayısı lazerin tekrarlama oranının %1'ini geçmemelidir.
8. Menü çubuğunda, edinme parametrelerini ayarlamak için sekmeyi seçin. Tek bir foton algılamasına izin vermek için scan eşitle'yi seçin.
9. Edinmeyi sabit bir zaman miktarına veya sabit sayıda fotona ayarlayın. Örneğin, 2 dakika boyunca veya tek bir piksel 2.000 tek olaydan oluşan bir foton sayısına ulaşana kadar ömür boyu çürüme eğrisi edinin. Satın almaya başlamak için Başlat'a basın.
   NOT: Farklı floroforlar farklı uyarma ve emisyon lazerleri ve filtreler igerektirecektir. Örneğin parlaklığına göre lazer gücü de ayarlanabilir, bu da kullanım ömrünü etkilemez. Bu protokoller aşağıdaki uyarma/emisyon ayarlarını kullanır: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Ex800/em440 nm kullanılarak CFP ölçümleri için darbeli iki foton lazer kullanılmıştır. Bir FLIM haritasının edinimi için gereken süre ve foton sayısının her kurulum ve her deneysel amaç için ampirik olarak belirlenmesi gerekir.

6. FLIMfit yazılımı kullanılarak FLIM verilerinin analizi

NOT: Imperial College London^12'de geliştirilen FLIMfit yazılım aracını kullanarak veri analizi yapın (Bkz. Şekil 1).

1. Dosya üzerinden yazılım açın ve FLIM veri dosyalarını içe aktarma | FLIM Verilerini Yükleyin. Farklı seanslarda ve farklı biyolojik tekrarlardan elde edilebilse bile, tüm numuneleri tek bir koşuldan yükleyin.
2. Gerekirse, Segmentasyon üzerinden herhangi bir FLIM resimden tek bir nematod segment | Segmentasyon Yöneticisi. Kırpma aracını vurgulanana kadar ilgi alanının etrafına sürükleyin. Tamamlandıktan sonra Tamam'abasın.
   NOT: Tüm görüntüler için segmentasyon yapılmalıdır.
3. C. elegans'ın yoğunluk tabanlı görüntüsünün göründüğü küçük bir bölge seçin(Şekil 1, Oklar 1). Bu bölgenin bozunma eğrisi arabirimin sağ tarafındaki büyük bozunma penceresinde görünür(Şekil 1, Ok 2).
   NOT: Bozunma doğrusal veya logaritma tiksintisi olarak görüntülenebilir.
4. 6.5-6.8 adımlarında açıklandığı gibi, yazılımın algoritması aracılığıyla kullanım ömrünü tahmin etmek için doğru parametreleri ayarlayın.
5. Veri sekmesinde (Şekil 1, Ok 3):
   1. İyi bir uyum sağlamak için çok loş pikselleri hariç tutmak için rasgele bir Tümleşik Minimum değer ayarlayın. C. elegans örneğine bağlı olarak bu değer 40-300 arasında değişir. Tatmin edici bir önizleme elde edilene kadar farklı değerler girişi.
   2. FLIM sinyalini bu değerlerle sınırlamak için bir Time Min ve Time Max numarasını seçin. Bu eşikten önce ve sonra görünen tüm olaylar hariç tutulur.
      NOT: Örneğin, mRFP analizi için, 800 ps önce ve 4.000 ps sonra olaylar hariç tutuldu. Bu değerler floroforun ömrüne bağlıdır ve son kullanıcı tarafından belirlenmelidir.
   3. Önceden ayarlanmış Counts/Photon 1'i değiştirmeyin.
   4. Satın alma sırasında kullanılan lazerin MHz cinsinden TekrarLama Oranınıgirdi.
      NOT: Mevcut protokol için farklı lazerler çeşitli tekrarlama oranları ile kullanılmıştır. CFP yaşam sürelerinin elde edilmesinde kullanılan iki foton lazer, 80 MHz tekrarlama oranına sahip, YFP için lazer 40 MHz'de tekrarlanır ve mRFP için değeri 78,01 MHz'dir. Bu değerler analiz edilen örneğe göre FLIMfit'e girilmiştir.
   5. Tüm doymuş pikselleri hariç tutmak için Bir Gate Max değeri giriş kurun.
      NOT: C. elegansyaşam boyu ölçümler için, bu değer herhangi bir büyük sayı (örneğin, 1 x 10⁸⁾olarak ayarlanır.
6. Ömür Boyu sekmesinde, kullanılacak genel bir montaj (örn. piksel açısından uygun bir montaj) seçin. Bkz. Şekil 1, Ok 4.
   NOT: Piksel açısından bir montaj, her bir piksele monte edilmiş bir bozunma üretir. Görüntü açısından bir montaj, her bir görüntünün küresel bir şekilde takılması sağlar ve görüntü başına tek bir ömür boyu değer görüntüler. Küresel-bilge uydurma tüm veri seti boyunca tek bir uydurma üretecektir. Tüm görüntüler için tek bir yaşam boyu değer sağlanır.
7. No dışında başka bir parametre değiştirmeyin. Exp seçimi seçilen floresan çürüme multikonsonential olduğu ve tek bir ömürden daha fazla sergiler olduğu biliniyorsa.
   NOT: Bu protokolde, bu işlev biexponential CFP florofor ömürleri hesaplamak için kullanılmıştır.
8. IRF menüsü üzerinden IRF yükleyin: IRF | Yük IRF. IRF değişimini tahmin etmek için IRF | Tahmin IRF Shift. IRF sekmesinde bir değer kümesi otomatik olarak görünür. Bu kurulduktan sonra, bu sekmenin diğer parametrelerini değiştirmeyin.
9. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, Fit Dataset (Şekil 1, Ok 5) tuşuna basın. Algoritma bozunma eğrisi için bir uyum üretecek ve her görüntü için bir ömür boyu değer oluşturacak.
   NOT: Mavi bir çizgide vurgulanan ortaya çıkan sığması, tüm olaylarla çakışmalıdır. Tüm olaylar uyum boyunca hizalandığında iyi bir uyum elde edilir.
10. Yazılımın arabiriminin sağ üst menülerinde bulunan Parametreler sekmesini(Şekil 1, Ok 6) tıklatın ve İstatistik'i seçin: w_mean (ağırlıklı ortalama) ve chi2 değerinin mümkün olduğunca yakın olup olmadığını 1'e kontrol edin.
    NOT: Bir yakın bir chi2 uyum doğruluğunu sağlar. Böylece seçilen görüntünün yaşam boyu değeri tau_1olarak ortaya edilir.
11. İlgi ni çeken herhangi bir bilgiyi dışa aktarma: Dosya | İhracat Yoğunluk Görüntüler / Fit Sonuç Tablosu / Görüntüler / Histogramlar. Kullanım ömrünü hesaplamak için kullanılan veri ayarlarını kaydetme: Dosya | Veri Ayarlarını Kaydet.
    NOT: Kullanılan parametreler, seçili örneklerin gelecekteki analizi için kaydedilir.

7. FLIM verilerinin grafik gösterimleri

NOT: Farklı örneklerden toplanan yaşam ömürleri görsel olarak çeşitli şekillerde temsil edilebilir. Nanosaniye veya pikosaniye cinsinden yaşam boyu değerlerini belirtmek için seçin.

1. Çürüme eğrisini doğrudan FLIMfit'ten dışa aktararak eğrinin kalitesini ve doğruluğunu gösterin.
2. Foton sayısının sıklığını histogramdaki yaşam boyu değerine göre çizerek fotonların dağılımını temsil edin.
3. Son olarak, istatistiksel karşılaştırma için, iki veya daha fazla örneği karşılaştırıyorsanız, yaşam boyu değerleri artı bir dağılım çizimi çubuğu grafiğine ortalamanın standart sapması yerleştirin. İstenilen istatistiksel analizleri yapın.

Sonuçlar

Protokol, hem doğal yaşlanma sırasında hem de strese maruz kaldığında, yaşayan C. elegans'tatoplanan türlerin oluşumunun nasıl doğru bir şekilde izlendiğini göstermektedir. 40Q, 44Q veya 85Q tekrarpoliglutamin proteinlerini ifade eden dört farklı transgenik nematod suşları seçtik. Bu proteinler farklı dokularda sentezlenir ve farklı floroforlara kaynaşır. C. elegans suşları ya vücut duvarı kaslarında Q40-mRFP ifade (mQ40-RFP), Sinir sistemind...

Tartışmalar

Burada sunulan protokol, C. elegans model sistemindeki birleştirilmiş türleri tanımlamak için mikroskopi tabanlı bir tekniği tanımlar. FLIM, floresan yaşam larındaki çürümelerinin ölçümü yoluyla bir florofora kaynaşmış hem birakadar hem de çözünen türlerin varlığını doğru bir şekilde karakterize edebilir. Bir füzyon proteini toplama başladığında, kayıtlı ortalama ömrü daha yüksek bir değerden daha düşük bir değere kayacaktır^16. Toplama eğilim...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
Ampicillin	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC Image	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
C. elegans iQ44-YFP	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OG412
C. elegans iQ85-YFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP			Kind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	Leica Camera AG		Mounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5	Leica Camera AG		Confocal Microscope
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM Aquisition software
Sodium Azide	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	Anesthetic
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
Universal Agarose	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLO	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope