JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف ونفصل استخدام نظام الحكم الذاتي عبرلامينار. يستخدم هذا النظام الجزء الخلفي البشري لتنظيم الضغط داخل الجزء (داخل العين) المحيط بالعصب البصري (داخل الجمجمة) بشكل مستقل لتوليد تدرج ضغط عبرلامينار يحاكي ميزات الاعتلال العصبي البصري الجلوكوماتو.

Abstract

هناك حاجة حالية غير ملباة لنموذج بشري جديد قبل السريري يمكنه استهداف مسببات الأمراض في الجسم الحي باستخدام الضغط داخل الجمجمة (ICP) والضغط داخل العين (IOP) الذي يمكنه تحديد النماذج المسببة للأمراض المختلفة المتعلقة بمسببات الأمراض الزرق. وقد سبق أن استخدمت نماذج ثقافة الأعضاء التشوية البشرية الحية بشكل ناجح وطبقت كتكنولوجيات فعالة لاكتشاف مسببات الأمراض الزرق واختبار العلاجات. يمكن أن يكون فحص الأدوية قبل السريرية والأبحاث التي أجريت على أجهزة الأعضاء البشرية السابقة للحيوية أكثر قابلية للترجمة إلى الأبحاث السريرية. تصف هذه المقالة بالتفصيل جيل وتشغيل نموذج ضغط عبرlaminar الإنسان الجديد في الجسم الحي يسمى النظام المستقل عبرlaminar (TAS). ويمكن لنموذج TAS أن ينظم بشكل مستقل برنامج المقارنات الدولية والمؤتمر الدولي للبراءات باستخدام شرائح بشرية من المانحين الخلفيين. يسمح النموذج لدراسة الإمراض بطريقة ما قبل السريرية. يمكن أن تقلل من استخدام الحيوانات الحية في أبحاث العيون. على النقيض من النماذج التجريبية في المختبر ، يمكن أيضا الحفاظ على بنية أنسجة رأس العصب البصري (ONH) وتعقيدها وسلامتها داخل نموذج EX vivo TAS.

Introduction

وتشير التقديرات العالمية في الدراسات الاستقصائية الأخيرة إلى أن 285 مليون شخص يعانون من ضعف البصر، بمن فيهم 39 مليون شخص مصابون بالعمى1. في عام 2010، وثقت منظمة الصحة العالمية أن ثلاثة من الأسباب الرئيسية التسعة المذكورة للعمى تحدث في الجزء الخلفي من العين1. أمراض العين الجزء الخلفي تنطوي على شبكية العين، المشيمية، والعصب البصري2. الشبكية والعصب البصري هما امتدادات الجهاز العصبي المركزي (CNS) للدماغ. تكون محاور عصبية خلية العقدة الشبكية (RGC) عرضة للتلف لأنها تخرج من العين من خلال رأس العصب البصري (ONH) لتشكيل العصب البصري3. يبقى ONH النقطة الأكثر عرضة للمكونات RGC بسبب شبكة ثلاثية الأبعاد من حزم الأنسجة الضامة تسمى cribrosa الصفيحة (LC)4. وONH هو الموقع الأولي للإهانة إلى محاور RGC في الزرق5,6,7, وقد درست التغيرات التعبير الجيني داخل ONH في ارتفاع ضغط الدم العيني والزرق models8,9,10. محاور RGC عرضة في ONH بسبب فروق الضغط بين المقصورة داخل العين، وتسمى الضغط داخل العين (IOP)، وداخل الفضاء الخارجي تحت العنكبوتية المحيطة بالبطانية، ودعا الضغط داخل الجمجمة (ICP)11. تفصل منطقة LC كلا المنطقتين، وتحافظ على فروق الضغط الطبيعية، حيث يتراوح معدل IOP بين 10-21 مم زئبق و ICP من 5 إلى 15 مم زئبق12. ويسمى فرق الضغط من خلال الصفيحة بين الغرفتين تدرج الضغط عبرلامينار (TLPG)13. عامل الخطر الرئيسي للزرق هو ارتفاع IOP14.

زيادة IOP يزيد من سلالة داخل وعبر المنطقة صفح6,15,16. تقدم الملاحظات التجريبية في البشر والنماذج الحيوانية ONH كموقع أولي للتلف المحوري17,18. النموذج الميكانيكي الحيوي للإجهاد والإجهاد المرتبط ب IOP الذي يسبب تلف الزرق في ONH يؤثر أيضا على الفيزيولوجيا المرضية للجلوكوما19،20،21. على الرغم من أن التغيرات الناجمة عن الضغط على البشر تلحق ضررا ميكانيكيا بمكونات RGC22 ، إلا أن القوارض التي تفتقر إلى الصفائح الكولاجينية داخل الصفيحة يمكن أن تتطور أيضا إلى الزرق 7،23. بالإضافة إلى ذلك ، لا يزال ارتفاع IOP عامل الخطر الأبرز في مرضى الزرق في الزاوية المفتوحة الأولية ، في حين أن مرضى الجلوكوما التوتر الطبيعي يصابون باعتلال الأعصاب البصرية الزرقاء حتى بدون IOP مرتفعة. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا مجموعة فرعية من مرضى ارتفاع ضغط الدم العيني التي تظهر أي تلف الأعصاب البصرية. وقد اقترح أيضا أن ضغط السائل النخاعي (CSFp) قد تلعب دورا في مسببات الأمراض الزرق. وتشير الأدلة إلى أن برنامج المقارنات الدولية يخفض إلى ~5 ملم زئبق في مرضى الزرق مقارنة بالأفراد العاديين، مما يسبب زيادة الضغط عبر اللمينر ويلعب دورا حاسما في المرض24,25. في السابق ، كان من الواضح في نموذج ال ، أنه من خلال التحكم في تغييرات IOP و CSFp ، يمكن أن يكون هناك إزاحات كبيرة من القرص البصري26. كما أظهر رفع CSFp في عيون البورسين زيادة السلالة الرئيسية داخل منطقة LC والأنسجة العصبية retrolaminar. وتساهم زيادة الضغط على RGCs ومنطقة LC في انسداد النقل المحوري وفقدان RGCs27. وقد ارتبط الانحطاط التدريجي ل RGCs بفقدان الدعم الغذائي28,29، وتحفيز العمليات الالتهابية/التنظيم المناعي30,31، والمؤثرات المبرمج29,32,33,34,35. بالإضافة إلى ذلك، تسبب الإصابة المحورية (الشكل 3) آثارا ضارة على RGCs، مما يؤدي إلى فشل تجديدي36,37,38,39. على الرغم من أن آثار IOP قد درست بشكل جيد، وقد أجريت الحد الأدنى من البحوث على تغيرات ضغط عبرlaminar غير طبيعية. تركز معظم علاجات الزرق على تثبيت IOP. ومع ذلك ، على الرغم من أن خفض IOP يبطئ تطور المرض ، فإنه لا يعكس فقدان المجال البصري ويمنع الخسارة الكاملة ل RGCs. سيكون فهم التغيرات العصبية المرتبطة بالضغط في الزرق أمرا حاسما لمنع وفاة RGC.

تشير الأدلة الحالية إلى أن تعديل الضغط عبرلامينار بسبب التغيرات الميكانيكية أو البيولوجية أو الفسيولوجية المختلفة في المرضى الذين يعانون من إعاقات بصرية مؤلمة أو عصبية يمكن أن يسبب فقدانا كبيرا للرؤية. حاليا، لا يوجد نموذج حقيقي الجزء الخلفي البشري قبل السريرية التي يمكن أن تسمح لدراسة الضرر الميكانيكا الحيوية الزرقاء داخل ONH الإنسان السابق فيفو. مراقبة وعلاج الجزء الخلفي من العين هو تحد كبير في طب العيون27. هناك حواجز جسدية وبيولوجية لاستهداف العين الخلفية، بما في ذلك ارتفاع معدلات الإزالة، حاجز الدم الشبكية، والاستجابات المناعية المحتملة40. يتم إنجاز معظم اختبارات الفعالية والسلامة لأهداف الأدوية الجديدة باستخدام النماذج الخلوية المختبرية وفي النماذج الحيوانية الحية41. تشريح العين معقد، والدراسات المختبرية لا تحاكي بدقة الحواجز التشريحية والفسيولوجية التي تقدمها أنظمة نموذج الأنسجة. على الرغم من أن النماذج الحيوانية هي ضرورة للدراسات الدوائية، قد تختلف فسيولوجيا العين بالعين الخلفية البشرية بين أنواع الحيوانات المختلفة، بما في ذلك التشريح الخلوي للشبكية، الأوعية الدموية، و ONH41،42.

يتطلب استخدام الحيوانات الحية لوائح أخلاقية مكثفة ومفصلة ، والتزاما ماليا عاليا ، وقابلية فعالة لإعادة الإنتاج43. وفي الآونة الأخيرة، تلت ذلك مبادئ توجيهية أخرى متعددة للاستخدام الأخلاقي للحيوانات في البحوث التجريبية44,45,46. البديل لاختبار الحيوانات هو استخدام نماذج العين البشرية في الجسم الحي السابق للتحقيق في مسببات الأمراض والتحليل المحتمل للأدوية لحماية أضرار ONH. الأنسجة البشرية بعد الوفاة هي مورد قيم لدراسة نماذج الأمراض البشرية ، خاصة في حالة الأمراض العصبية البشرية ، لأن تحديد الأدوية المحتملة التي تم تطويرها في النماذج الحيوانية يتطلب الحاجة إلى أن تكون قابلة للترجمة إلى humans47. وقد استخدمت الأنسجة المانحة البشرية في الجسم الحي على نطاق واسع لدراسة الاضطرابات البشرية47,48,49، وقد قدمت نظم زراعة الأعضاء الأمامية البشرية نموذج ا فريدا من نوعه لدراسة الفيزيولوجيا المرضية ل IOP50,51,52 المرتفعة.

لدراسة الضغط عبرlaminar المتعلقة IOP و ICP في عيون الإنسان، ونحن بنجاح تصميم وتطوير نظام مستقل عبرlaminar غرفتين (TAS) التي يمكن أن تنظم بشكل مستقل IOP و ICP باستخدام شرائح الخلفي من عيون المانحين الإنسان. هذا هو أول نموذج الإنسان في الجسم الحي لدراسة الضغط عبرlaminar واستغلال الآثار الميكانيكية الحيوية من TLPG على ONH.

يمكن استخدام هذا النموذج TAS الإنسان السابق فيفو لاكتشاف وتصنيف التعديلات الخلوية والوظيفية التي تحدث بسبب الارتفاع المزمن لل IOP أو ICP. في هذا التقرير، نقوم بتفصيل بروتوكول تشريح وإعداد ومراقبة نموذج الجزء الخلفي البشري TAS. سيسمح البروتوكول للباحثين الآخرين بإعادة إنتاج نموذج الجزء الخلفي البشري المضغوط الجديد بشكل فعال لدراسة مسببات الأمراض الميكانيكية الحيوية.

Protocol

تم الحصول على العيون وفقا لأحكام إعلان هلسنكي للبحوث التي تنطوي على الأنسجة البشرية.

ملاحظة: تم حصاد عيون من بنوك العيون ذات السمعة الطيبة (على سبيل المثال، معهد ليونز للعيون للزراعة والبحوث وتامبا فلوريدا) في غضون 6-12 ساعة من الوفاة وتم اختبار مصل المتبرع لالتهاب الكبد B والتهاب الكبد C وفيروس نقص المناعة البشرية 1 و 2. وبمجرد استلامها، تم تشريح العينين وإقامة في نموذج TAS في غضون 24 ساعة. وشملت معايير الاستبعاد أي أمراض العين. لم يتم استبعاد العيون على أساس العمر أو العرق أو الجنس. ولضمان بقاء الشبكية عند استلامها، تم حصاد النباتات الشبكية من المتبرعين بالأنسجة وزرعت لمدة 7 أيام و 14 يوما (الشكل التكميلي 1). كما تم فصل هذه الشبكية ونمت RGCs صحية في الثقافة لمدة 7 أيام مع تلطيخ إيجابي لعلامة RGC، بروتين الحمض النووي الريبي ملزمة مع الربط متعددة (RBPMS)، فضلا عن سلسلة ضوء العصبية الإيجابية (NEFL) تلطيخ في الخيوط العصبية (الشكل التكميلي 2). .

1. إعداد وتعقيم المعدات واللوازم

  1. راجع جدول المواد للحصول على قائمة كاملة بالإمدادات المطلوبة بالإضافة إلى أرقام الموردين والفهارس.
  2. قبل الاستخدام، قم بتعقيم جميع المعدات والأدوات عن طريق الالاستعباد التلقائي أو استخدام أمبولات أكسيد الإيثيلين.

2. إعداد وسيطة التغلغل

  1. إضافة 1٪ ستريبتوميسين البنسلين (10،000 U/mL البنسلين، 10،000 ميكروغرام / مل ستريبتومايسين في 0.85٪ NaCl) و 1٪ L-الجلوتامين (200 mM) إلى 1،000 مل عالية الجلوكوز Dulbecco المعدلة النسر المتوسطة (DMEM).
  2. تعقيم وسيط التغلغل عن طريق المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر.

3. نظام مستقل Translaminar (TAS) الإعداد

  1. إعداد المحاقن الداخلة (خزانات IOP و ICP).
    1. أضف 30 مل من وسيط التشوه (القسم 2) إلى حقنة سعة 30 مل. إرفاق stopcock 3-الاتجاه إلى حقنة 30 مل. إرفاق مرشح هيدروفيلي 0.22 ميكرومتر إلى stopcock 3-way. قم بتوصيل محول كعب روتين 15 G Luer بتصفية هيدروفيلية 0.22 ميكرومتر.
    2. إزالة فقاعات الهواء من إعداد حقنة. قم بتوصيل الأنابيب إلى محول كعب روتين 15 G Luer. أغلق المنفذ الجانبي للتوقف باستخدام غطاء قفل عالمي غير مفنن. كرر ما مجموعه اثنين من الاجهزة.
    3. تسمية حقنة واحدة على أنها ضغط داخل الجمجمة القناة 1 (CH1 ICP) والمحاقن الأخرى كضغط داخل العين القناة 2 (CH2 IOP).
  2. إعداد المحاقن الخارجة (خزانات IOP و ICP).
    1. إرفاق stopcock 3-الاتجاه إلى حقنة 30 مل. إرفاق محول كعب روتين 15 G Luer إلى stopcock ثلاثية الاتجاه. قم بتوصيل الأنابيب إلى محول كعب روتين 15 G Luer.
    2. أغلق المنفذ الجانبي للتوقف باستخدام غطاء قفل عالمي غير مفنن. كرر ما مجموعه اثنين من الاجهزة. تسمية حقنة واحدة باسم CH1 ICP والمحاقن الأخرى باسم CH2 IOP.

4. إعداد الإنسان الكرة الأرضية العين كله

ملاحظة: إذا تم تلقي عيون كاملة، اتبع الإجراء أدناه لفصل الجزء الأمامي من الجزء الخلفي من العين. إذا تم استلام العينين إلى قسمين، فابدأ من الخطوة 4.4.

  1. ضع العين بالكامل في محلول بوفيدوني اليود لمدة دقيقتين.
  2. شطف العين في محلول الفوسفات المعقم العازلة (PBS) لشطف قبالة بوفيدوني اليود. كرر 2 مرات.
  3. إزالة adnexa من الكرة الأرضية العين كله باستخدام ملقط ومقص. اقسم العين عند خط الاستواء لفصل الأجزاء الأمامية والخلفية للعين.
  4. إزالة غمد العصب البصري. إزالة الفكاهة الزجاجية من الجزء الخلفي.
  5. تقليم الصلبة إضافية من الجزء الخلفي، إذا لزم الأمر، لضمان تناسب جيد على القبة المستديرة للغرفة IOP (أسفل). باستخدام ملقط، تأكد من أن الشبكية تنتشر بالتساوي على الجزء الخلفي من الجزء.
  6. إعداد غرفة IOP (أسفل)
    1. ضع الجزء الخلفي البشري في غرفة IOP (السفلية) في TAS فوق القبة المستديرة مع العصب البصري المواجه للقمة.
    2. ختم الجزء الخلفي باستخدام الراتنج الايبوكسي O-حلقة مع أربعة مسامير، وضمان ختم ضيق.
    3. أدخل الأنابيب في منافذ IN و OUT في غرفة IOP (السفلي). يتم إدخال حقنة تدفق IOP مع أنابيب تحتوي على وسيطة في منفذ IN ويتم إدخال حقنة تدفق IOP الفارغة مع الأنابيب في منفذ OUT.
    4. استخدام طريقة الدفع / السحب لبث ببطء وسيطة التغلغل في ميناء التدفق لملء كأس العين الخلفية في حين سحب في وقت واحد ببطء وسيطة التغلغل من خلال حقنة تدفق لإزالة أي فقاعات الهواء من الخطوط. التوقف عن غرس المتوسطة مرة واحدة في كل من أنابيب IN و OUT خالية من فقاعات الهواء.
    5. قفل stopcocks في موقف قبالة. إزالة حقنة 30 مل من IOP IN ميناء تصفية التجمع وإعادة ملء مع ما مجموعه 30 مل من المتوسطة. استبدل المحاقن التي سعة 30 مل في تجميع الفلتر.
  7. برنامج المقارنات الدولية (الأعلى) إعداد الغرفة
    1. ضع غرفة/غطاء ICP (العلوي) على الجزء الخلفي من الجزء الخلفي. تأكد من أن العصب البصري داخل الغرفة العليا. ختم الغرفة العلوية مع أربعة مسامير.
    2. أدخل الأنابيب في منافذ IN و OUT في غرفة ICP (العلوية). يتم إدخال حقنة تدفق برنامج المقارنات الدولية مع أنابيب تحتوي على وسيطة في منفذ IN ويتم إدخال حقنة تدفق برنامج المقارنات الدولية الفارغة مع أنابيب في منفذ OUT.
    3. غرس بلطف وببطء المتوسطة في منفذ IN لملء غرفة برنامج المقارنات الدولية وإزالة فقاعات الهواء من خطوط باستخدام طريقة دفع / سحب. التوقف عن غرس المتوسطة مرة واحدة في غرفة برنامج المقارنات الدولية، فضلا عن كل من أنابيب IN و OUT خالية من فقاعات الهواء.
    4. قفل stopcocks في موقف قبالة. إزالة حقنة 30 مل من برنامج المقارنات الدولية في تجميع مرشح الميناء وإعادة تعبئة مع ما مجموعه 30 مل من المتوسطة. استبدل المحاقن التي سعة 30 مل في تجميع الفلتر.

5. إعداد نظام تسجيل البيانات

ملاحظة: يتكون نظام تسجيل البيانات من مصدر طاقة مكون من 8 قنوات ومضخم جسور متعدد القنوات ومحولات الضغط الهيدروستاتيكي وكمبيوتر مزود ببرنامج الحصول على البيانات (انظر جدول المواد). يصف التالي كيفية إعداد ومعايرة النظام.

  1. قم بتوصيل سلك الطاقة بظهر مصدر الطاقة المكون من 8 قنوات وقم بتوصيل جهاز احتياطية للبطارية.
  2. قم بتوصيل كبل USB من مصدر الطاقة ذو القنوات ال 8 بظهر الكمبيوتر.
  3. قم بتوصيل مصدر الطاقة ذو القنوات ال 8 بمضخم جسر متعدد القنوات باستخدام سلك I2C المزود.
  4. قم بتوصيل كابلات Bayonet Neill-Concelman (BNC) بمدخلات القناة أمام مصدر الطاقة ذو القنوات ال 8 ونهاية الكابلات في القنوات المقابلة في الجزء الخلفي من مكبر الصوت متعدد القنوات.
  5. قم بتوصيل كبلات محول إلى الجزء الأمامي من مكبر للصوت متعدد القنوات.
  6. تثبيت برنامج الحصول على البيانات على الكمبيوتر.
    1. تشغيل مثبت إعداد برنامج الحصول على البيانات من القرص المضغوط للبرامج المتوفرة.
    2. اتبع الإرشادات الموجودة على شاشة الكمبيوتر.
    3. عند اكتمال التثبيت، حدد إنهاء.
  7. قم بتشغيل مصدر الطاقة ذو القنوات ال 8.
  8. قم بتشغيل الكمبيوتر وبدء برنامج الحصول على البيانات.
    1. تحديد | الملف الجديد.
    2. تحديد | الإعداد إعدادات القناة. حدد ثلاث قنوات (أسفل يسار الشاشة). في العمود عنوان القناة إعادة تسمية القنوات كما يلي: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. حدد 2 mV للنطاق على جميع القنوات. في العمود الحساب حدد لا حساب للمقنيتين 1 و2.
    4. في العمود الحساب حدد الحساب للقناة 3. في المقطع الصيغة : حدد قنوات/CH2; حدد حسابي "-"; حدد قنوات/CH1. في قسم الإخراج حدد مم زئبق. حدد موافق. حدد موافق مرة أخرى.
  9. إعداد ومعايرة محولات الضغط الهيدروستاتيكي.
    ملاحظة: يجب معايرة محولات الضغط الهيدروستاتيكي قبل إجراء التجارب باستخدام الطريقة التالية.
    1. قم بتوصيل محولات الضغط الهيدروستاتيكي بخطوط محولات متصلة بمضخم الجسر متعدد القنوات.
    2. إرفاق حقنة 30 مل مليئة بالهواء إلى المنفذ الجانبي للمحول ضغط CH1 (ICP). إرفاق مقياس ضغط الدم إلى الجزء السفلي من محول ضغط CH1 (ICP).
    3. على المخطط، عرض صفحة برنامج الحصول على البيانات، تعيين سرعة أخذ العينات عن طريق النقر على السهم إلى جانب وقت أخذ العينات وحدد 100. ثم انقر بزر الماوس الأيمن في منطقة CH1 (ICP) من الصفحة.
    4. حدد بريدج أمبير. حدد عامل تصفية التيار الكهربائي. حدد صفر وانتظر النظام إلى الصفر، مع الحرص على عدم تحريك محول الضغط.
    5. قرصة علامات التبويب البيضاء من محول الضغط ودفع الهواء من خلال محول حتى يتم الحصول على 40 ملم زئبق على مقياس الاختناق. حرر علامات التبويب البيضاء وأزل الحقنة ومقياس الاختزال.
    6. في صفحة تحويل الوحدات ، حدد علامة 'ناقص (-)'. تسليط الضوء على أعلى هضبة للإشارة إلى 40 ملم زئبق. انقر فوق السهم للنقطة 1 وأدخل 40.
    7. تسليط الضوء على أدنى هضبة للإشارة إلى 0 مم زئبق. انقر فوق السهم للنقطة 2 وأدخل 0. حدد مم زئبق للوحدات. حدد موافق.
    8. حدد موافق (صفحة جسر أمبير). كرر الخطوات 9.1-9.7 ل CH2 (IOP) باستخدام 100 مم زئبق لأعلى هضبة و0 لأدنى هضبة.
  10. قم بتوصيل وحدة المقطع الخلفي/TAS بنظام الحصول على البيانات.
    1. ضع وحدة الجزء الخلفي من TAS في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). إرفاق أنابيب برنامج المقارنات الدولية من منفذ OUT إلى محول ضغط CH1 (ICP).
    2. إرفاق أنابيب IOP من منفذ OUT إلى محول ضغط CH2 (IOP).
    3. إرفاق الإعداد syringe (ICP و IOP) مع وسيطة من منافذ IN إلى الحامل الحلقي.
    4. في الصفحة عرض المخطط حدد بدء أخذ العينات. تعيين سرعة أخذ العينات عن طريق اليسار النقر على السهم بجانب وقت أخذ العينات وحدد بطيئة و 1 دقيقة.
    5. ضبط المحاقن على الحلبة الوقوف أو أسفل لتنظيم برنامج المقارنات الدولية و IOP الضغوط لمتطلبات البروتوكول.
    6. إجراء تجديد نظامي للوسط في النظام كل 48-72 ساعة من خلال طريقة الدفع والسحب.

6. استرجاع البيانات وتحليلها

  1. افتح ملف البيانات في برنامج الحصول على البيانات.
  2. في المقطع لوحة البيانات ، انقر فوق رمز إضافة متعددة إلى لوحة البيانات . ستظهر نافذة جديدة.
    1. في المقطع بحث عن استخدام حدد الوقت من القائمة المنسدلة.
    2. في القسم تحديد حدد ساعة واحدة كل ساعة واحدة من القوائم المنسدلة.
    3. في المقطع الخطوة من خلال حدد ملف كامل ثم انقر فوق إضافة.
  3. في المقطع لوحة البيانات انقر فوق رمز عرض لوحة البيانات . تمييز كافة البيانات ونسخ / لصق في جدول بيانات.
  4. حساب متوسط والانحرافات المعيارية ل IOP، ICP، و TLPG لكل 24 ساعة. قم بتجميع البيانات باستخدام خيار الجدول المحوري في برنامج جدول بيانات ورسم بياني.

7. الكيمياء المناعية والهيماتوكسيلين وتلطيخ اليوسين من الشرائح الخلفية

  1. إزالة شرائح العين الخلفية بعد نقاط زمنية مختلفة من نموذج TAS وإصلاح في الفورماليين قبل paraffinizing.
  2. قسم العينين لإنتاج طائرات الأنسجة القوسية.
  3. إزالة البارافين الأجزاء المضمنة مع 100٪ xylene، 95٪ الإيثانول، 50٪ حل الإيثانول.
  4. غسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة وكتلة مع عازلة حجب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  5. أقسام التسمية مع الأجسام المضادة الأولية: مكافحة الكولاجين الرابع (مصفوفة خارج الخلية (ECM) علامة، NB120-6586، 1:100) ومكافحة النعناع (علامة ECM، NB300-144، 1:100، المضادة RBPMS (علامة RGC)، GTX118619، 1:50).
  6. الكشف عن الأجسام المضادة الأولية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور (اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للأرانب، A11008، 1:500).
  7. مكافحةالطازان نواة الخلية باستخدام DAPI المضادة للتلاشي الحل.
  8. التقط صورا للأقسام الملطخة وصور المرحلة باستخدام عدسات 4x و10x الموضوعية باستخدام مجهر مضان (انظر جدول المواد).
  9. للهيماتوكسيلين وeosin (H &؛ E) تلطيخ، معالجة المقاطع في نظام تلطيخ الآلي (انظر جدول المواد) لإزالة البارافينين باستخدام 100٪، xylene 95٪ الإيثانول، 50٪ محلول الإيثانول وصمة عار مع H &؛ E.
  10. التقط صورا باستخدام العدسات ذات العدسات ذات ال4x و10x باستخدام المجهر مع مصدر ضوء حقل ساطع.

النتائج

تصميم وإنشاء نظام مستقل عبرلامينار
فرق ضغط عبرlaminar هو آلية رئيسية محتملة في الإمراض من الأمراض المختلفة، بما في ذلك الزرق. وتشمل استخدامات النموذج الموصوف، على سبيل المثال لا الحصر، دراسة الزرق (ارتفاع IOP، وربما انخفاض برنامج المقارنات الدولية)، وإصابات الدماغ الرضية (ICP مرتفعة...

Discussion

الأنسجة البشرية بعد الوفاة هي مورد قيم بشكل خاص لدراسة الأمراض العصبية البشرية لأن تحديد الأدوية المحتملة التي تم تطويرها في النماذج الحيوانية يجب أن تكون قابلة للترجمة إلى humans47. آثار ارتفاع IOP الإنسان راسخة، ولكن تم إجراء الحد الأدنى من البحوث على تغييرات غير طبيعية في الضغ?...

Disclosures

لا يوجد لدى مؤلفي المخطوطة أي تضارب محتمل في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

وكان تمويل هذا المشروع من خلال الأموال التقديرية للدكتورة كولين م. ماكدويل. وقد دعم هذا العمل جزئيا بمنحة غير مقيدة من مؤسسة البحوث لمنع العمى، إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية في جامعة ويسكونسن ماديسون. نشكر الدكتورين أبوت ف. كلارك ووايمينغ ماو على مساعدتهما التقنية في نموذج ثقافة الأعضاء التغلغلية. نشكر معهد ليونز للعيون لزراعة الأعضاء والبحوث (تامبا، فلوريدا) على توفير عيون المتبرعين البشريين.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack		AmazonB07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100)AmazonB000FMYRHK
30 mL Syringes without NeedleVitality Medical302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented CapQOSINA2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriverBrikksen Stainless Steel FastnersPPMSSSCH4C.5 
ANPROLENE 16 LARGE AMPULEFisher ScientificNC9085343 
BetadinePurduePUR1815001EACH 
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167-100EA 
Corning L-glutamine SolutionFisher ScientificMT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CSMed Plus Medical SupplyCOV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated)KatenaK5-4010
Dumont #5 - Fine ForcepsF.S.T.11254-20
Eye Scissors Standard CurvedKatenaK4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri DishesCapitol Scientific351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen ContainersFisher Scientific16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles MediumFisher ScientificSH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X SolutionFisher ScientificSV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and ClearQosina28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rateAD instrumentsDPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/BoxJenson GlobalJG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscopeKeyenceB2-X710
LabChart 8AD instrumentsLabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainerLeicaST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, WhiteQOSINA65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)AD instrumentsFE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)AD instrumentsPL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermoFisherP36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT MaleMcMAster-Carr7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 PipeMcMAster-Carr51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft.Fisher Scientific14-171-268
Superblock T20Fisher ScientificPI37536
Surgical Scissors - Sharp-BluntF.S.T.14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth CurvedKatenaK5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)University of North Texas Health Science CenterN/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		Marco Rubber & PlasticsB1000-030

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. . Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

158

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved