Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos

Resumen

Describimos y detallamos el uso del sistema autónomo translaminar. Este sistema utiliza el segmento posterior humano para regular independientemente la presión dentro del segmento (intraocular) y que rodea el nervio óptico (intracraneal) para generar un gradiente de presión translaminar que imita las características de la neuropatía óptica glaucomatosa.

Resumen

Existe una necesidad insatisfecha actual de un nuevo modelo humano preclínico que pueda dirigirse a la etiología de la enfermedad ex vivo utilizando la presión intracraneal (PIC) y la presión intraocular (PIO) que pueda identificar varios paradigmas patógenos relacionados con la patogénesis del glaucoma. Los modelos de cultivo de órganos de perfusión del segmento anterior humano ex vivo se han utilizado y aplicado con éxito como tecnologías efectivas para el descubrimiento de la patogénesis del glaucoma y las pruebas terapéuticas. El cribado preclínico de fármacos y la investigación realizada en sistemas de órganos humanos ex vivo pueden ser más traducibles a la investigación clínica. Este artículo describe en detalle la generación y el funcionamiento de un nuevo modelo de presión translaminar humana ex vivo llamado sistema autónomo translaminar (TAS). El modelo TAS puede regular de forma independiente la PIC y la PIO utilizando segmentos posteriores de donantes humanos. El modelo permite estudiar la patogénesis de manera preclínica. Puede reducir el uso de animales vivos en la investigación oftálmica. A diferencia de los modelos experimentales in vitro, la estructura, complejidad e integridad del tejido de la cabeza del nervio óptico (ONH) también se pueden mantener dentro del modelo TAS ex vivo.

Introducción

Las estimaciones mundiales en encuestas recientes sugieren que 285 millones de personas viven con discapacidad visual, incluidos 39 millones que son ^ciegos1. En 2010, la Organización Mundial de la Salud documentó que tres de las nueve principales causas de ceguera enumeradas ocurren en el segmento posterior del ^ojo1. Las enfermedades oculares del segmento posterior involucran la retina, la coroides y el nervio ^óptico2. La retina y el nervio óptico son extensiones del sistema nervioso central (SNC) del cerebro. Los axones de células ganglionares de la retina (RGC) son vulnerables al daño porque salen del ojo a través de la cabeza del nervio óptico (ONH) para formar el nervio ^óptico3. El ONH sigue siendo el punto más vulnerable para los axones RGC debido a la malla 3D de haces de tejido conectivo llamada lámina cribrosa (LC)⁴. La ONH es el sitio inicial de insulto a los axones RGC en ^{glaucoma5,6,7}, y se han estudiado cambios en la expresión génica dentro de la ONH en modelos de hipertensión ocular y glaucoma8,9,10. Los axones RGC son susceptibles en la ONH debido a los diferenciales de presión entre el compartimento intraocular, llamado presión intraocular (PIO), y dentro del espacio subaracnoideo perióptico externo, llamado presión intracraneal (ICP)¹¹. La región LC separa ambas áreas, manteniendo diferenciales de presión normales, con PIO que oscila entre 10 y 21 mmHg y PIC desde 5-15 ^mmHg12. La diferencia de presión a través de la lámina entre las dos cámaras se denomina gradiente de presión translaminar (TLPG)¹³. Un factor de riesgo importante del glaucoma es la ^PIO14 elevada.

El aumento de la PIO aumenta la tensión dentro y a través de la región laminar6,15,16. Observaciones experimentales en humanos y modelos animales presentan la ONH como el sitio inicial del daño ^axonal17,18. El paradigma biomecánico del estrés y la tensión relacionados con la PIO que causan daños glaucomatosos en la ONH también influye en la fisiopatología del glaucoma19,20,21. Aunque en humanos los cambios inducidos por la presión dañan mecánicamente los axones ^RGC22, los roedores que carecen de placas colágenas dentro de la lámina también pueden desarrollar ^glaucoma7,23. Además, la PIO elevada sigue siendo el factor de riesgo más prominente en los pacientes con glaucoma primario de ángulo abierto, mientras que los pacientes con glaucoma de tensión normal desarrollan neuropatía óptica glaucomatosa incluso sin PIO elevada. Además, también hay un subconjunto de pacientes hipertensos oculares que no muestran daño en el nervio óptico. También se ha sugerido que la presión del líquido cefalorraquídeo (CSFp) puede desempeñar un papel en la patogénesis del glaucoma. La evidencia indica que la PIC se reduce a ~5 mmHg en pacientes con glaucoma en comparación con individuos normales, lo que provoca un aumento de la presión translaminar y juega un papel crucial en la ^{enfermedad24,25}. Anteriormente, se demostró en un modelo canino, que al controlar los cambios de IOP y CSFp, puede haber grandes desplazamientos del disco ^óptico26. La elevación de la CSFp en los ojos porcinos también ha mostrado un aumento de la tensión principal dentro de la región LC y el tejido neural retrolaminar. El aumento de la tensión en los RGC y la región LC contribuye al bloqueo del transporte axonal y a la pérdida de ^RGC27. La degeneración progresiva de las RGC se ha asociado con pérdida de soporte ^{trófico28,29}, estimulación de procesos inflamatorios/regulación ^inmune30,31 y efectores apoptóticos29,32,33,34,35. Además, la lesión axonal (Figura 3) causa efectos perjudiciales sobre las RGC, desencadenando el fracaso regenerativo36,37,38,39. A pesar de que los efectos de la PIO han sido bien estudiados, se han realizado investigaciones mínimas sobre los cambios anormales de presión translaminar. La mayoría de los tratamientos para el glaucoma se centran en estabilizar la PIO. Sin embargo, a pesar de que la disminución de la PIO ralentiza la progresión de la enfermedad, no revierte la pérdida del campo visual y previene la pérdida completa de RGC. Comprender los cambios neurodegenerativos relacionados con la presión en el glaucoma será crucial para prevenir la muerte por RGC.

La evidencia actual indica que las modulaciones de presión translaminar debido a diversos cambios mecánicos, biológicos o fisiológicos en pacientes que sufren de discapacidades visuales traumáticas o neurodegenerativas pueden causar una pérdida significativa de la visión. Actualmente, no existe un verdadero modelo preclínico del segmento posterior humano que pueda permitir el estudio del daño biomecánico glaucomatoso dentro de la ONH humana ex vivo. La observación y el tratamiento del segmento posterior del ojo es un gran reto en ^{oftalmología27}. Existen barreras físicas y biológicas para atacar el ojo posterior, incluyendo altas tasas de eliminación, barrera sangre-retina y posibles respuestas inmunológicas40. La mayoría de las pruebas de eficacia y seguridad para nuevos objetivos farmacológicos se realizan utilizando modelos celulares e in vivo in ^vitro41. La anatomía ocular es compleja, y los estudios in vitro no imitan con precisión las barreras anatómicas y fisiológicas presentadas por los sistemas de modelos de tejidos. A pesar de que los modelos animales son una necesidad para los estudios farmacocinéticos, la fisiología ocular del ojo posterior humano puede variar entre varias especies animales, incluida la anatomía celular de la retina, la vasculatura y la ^ONH41,42.

El uso de animales vivos requiere regulaciones éticas intensivas y detalladas, un alto compromiso financiero y una reproducibilidad ^efectiva43. Recientemente, se han seguido muchas otras directrices para el uso ético de animales en la investigación experimental44,45,46. Una alternativa a las pruebas con animales es el uso de modelos de ojo humano ex vivo para investigar la patogénesis de la enfermedad y el análisis potencial de medicamentos para proteger el daño de LA ONH. El tejido postmortem humano es un recurso valioso para el estudio de los paradigmas de las enfermedades humanas, especialmente en el caso de las enfermedades neurodegenerativas humanas, porque la identificación de fármacos potenciales desarrollados en modelos animales requiere la necesidad de ser traducibles a los ^humanos47. El tejido donante humano ex vivo se ha utilizado ampliamente para el estudio de trastornos humanos47,48,49, y los sistemas de cultivo de órganos de perfusión del segmento anterior humano han proporcionado previamente un modelo ex vivo único para estudiar la fisiopatología de la PIO ^{elevada50,51,52}.

Para estudiar la presión translaminar relacionada con la PIO y la PIC en los ojos humanos, diseñamos y desarrollamos con éxito un sistema autónomo translaminar (TAS) de dos cámaras que puede regular de forma independiente la PIO y la PIC utilizando segmentos posteriores de los ojos de donantes humanos. Es el primer modelo humano ex vivo que estudia la presión translaminar y explota los efectos biomecánicos del TLPG en la ONH.

Este modelo de TAS humano ex vivo se puede utilizar para descubrir y clasificar las modificaciones celulares y funcionales que ocurren debido a la elevación crónica de la PIO o ICP. En este informe, detallamos el protocolo paso a paso de disección, configuración y monitoreo del modelo de segmento posterior humano TAS. El protocolo permitirá a otros investigadores reproducir eficazmente este nuevo modelo de segmento posterior humano presurizado ex vivo para estudiar la patogénesis de enfermedades biomecánicas.

Protocolo

Los ojos se obtuvieron de acuerdo con las disposiciones de la Declaración de Helsinki para la investigación con tejidos humanos.

NOTA: Los ojos de bancos de ojos de buena reputación (por ejemplo, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) se recolectaron dentro de las 6-12 h posteriores a la muerte y el suero del donante se analizó para detectar hepatitis B, hepatitis C y virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2. Una vez recibidos, los ojos fueron diseccionados y configurados en el modelo TAS dentro de las 24 h. Los criterios de exclusión incluyeron cualquier patología ocular. Los ojos no se excluyeron en función de la edad, la raza o el género. Para asegurar la viabilidad de la retina al recibirla, se recolectaron explantes de retina de los donantes de tejido y se cultivaron durante 7 y 14 días (Figura suplementaria 1). Estas retinas también se disociaron y crecieron RGC sanas en cultivo durante 7 días con tinción positiva para el marcador RGC, proteína de unión a ARN con empalme múltiple (RBPMS), así como tinción positiva de cadena ligera de neurofilamentos (NEFL) en sus neurofilamentos (Figura suplementaria 2). .

1. Preparación y esterilización de equipos y suministros

1. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista completa de los suministros requeridos, así como los números de proveedor y catálogo.
2. Antes de su uso, esterilice todos los equipos e instrumentos en autoclave o utilizando ampollas de óxido de etileno.

2. Preparación del medio de perfusión

1. Agregue estreptomicina de penicilina al 1% (10,000 U/mL de penicilina, 10,000 μg/mL de estreptomicina en 0.85% de NaCl) y 1% de L-glutamina (200 mM) a 1,000 mL de glucosa alta en el medio modificado de Eagle (DMEM) de Dulbecco.
2. Esterilizar el medio de perfusión pasando por un filtro de 0,22 μm.

3. Configuración del sistema autónomo translaminar (TAS)

1. Instale jeringas de entrada (depósitos de PIO e ICP).
   1. Añadir 30 ml del medio de perfusión (sección 2) a una jeringa de 30 ml. Coloque una llave de paso de 3 vías a la jeringa de 30 ml. Conecte un filtro hidrófilo de 0,22 μm a la llave de paso de 3 vías. Conecte un adaptador de talón Luer de 15 G al filtro hidrófilo de 0,22 μm.
   2. Retire las burbujas de aire de la configuración de la jeringa. Conecte el tubo al adaptador de talón Luer de 15 G. Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita el proceso para un total de dos configuraciones.
   3. Etiquete una jeringa como presión intracraneal del canal 1 (CH1 ICP) y la otra jeringa como presión intraocular del canal 2 (CH2 IOP).
2. Instale jeringas de salida (depósitos de PIO e ICP).
   1. Coloque una llave de paso de 3 vías a una jeringa de 30 ml. Conecte un adaptador de talón Luer de 15 G a la llave de paso de 3 vías. Conecte el tubo al adaptador de talón Luer de 15 G.
   2. Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita el proceso para un total de dos configuraciones. Etiquete una jeringa como CH1 ICP y la otra jeringa como CH2 IOP.

4. Preparación del globo ocular completo humano

NOTA: Si se reciben ojos enteros, siga el procedimiento a continuación para separar el segmento anterior del segmento posterior del ojo. Si los ojos se reciben divididos en dos, comience en el paso 4.4.

1. Coloque un ojo entero en la solución de povidona yodada durante 2 min.
2. Enjuague el ojo en una solución tamponada con fosfato estéril (PBS) para enjuagar la povidona yodada. Repetir 2 veces.
3. Retire los anexos de todo el globo ocular con fórceps y tijeras. Dividir el ojo en el ecuador para separar los segmentos anterior y posterior del ojo.
4. Retire la vaina del nervio óptico. Retire el humor vítreo del segmento posterior.
5. Recorte la esclerótica adicional del segmento posterior, si es necesario, para garantizar un buen ajuste en la cúpula redonda de la cámara IOP (inferior). Usando fórceps, asegúrese de que la retina se extienda uniformemente sobre la parte posterior del segmento.
6. Configuración de la cámara IOP (inferior)
   1. Coloque el segmento posterior humano en la cámara IOP (inferior) del TAS sobre la cúpula redonda con el nervio óptico mirando hacia la parte superior.
   2. Selle el segmento posterior utilizando la junta tórica de resina epoxi con cuatro tornillos, asegurando un sellado hermético.
   3. Inserte el tubo en los puertos de entrada y salida de la cámara IOP (inferior). La jeringa de entrada IOP con tubo que contiene medio se inserta en el puerto IN y la jeringa de salida IOP vacía con tubo se inserta en el puerto OUT.
   4. Utilice el método push/pull para infundir lentamente el medio de perfusión en el puerto de entrada para llenar la copa del ojo posterior mientras que simultáneamente tira lentamente del medio de perfusión a través de la jeringa de salida para eliminar cualquier burbuja de aire de las líneas. Deje de infundir el medio una vez que los tubos DE ENTRADA y SALIDA estén vacíos de burbujas de aire.
   5. Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del conjunto del filtro del puerto IOP IN y vuelva a llenarla con un total de 30 ml de medio. Reemplace la jeringa de 30 ml en el conjunto del filtro.
7. Configuración de la cámara ICP (superior)
   1. Coloque la cámara/tapa ICP (superior) sobre la parte posterior del segmento posterior. Asegúrese de que el nervio óptico esté dentro de la cámara superior. Selle la cámara superior con cuatro tornillos.
   2. Inserte el tubo en los puertos DE ENTRADA y SALIDA de la cámara ICP (superior). La jeringa de entrada ICP con medio que contiene tubos se inserta en el puerto IN y la jeringa de salida ICP vacía con tubos se inserta en el puerto OUT.
   3. Infunda suave y lentamente el medio en el puerto IN para llenar la cámara ICP y eliminar las burbujas de aire de las líneas utilizando el método push/pull. Deje de infundir el medio una vez que la cámara ICP, así como el tubo IN y OUT, estén vacíos de burbujas de aire.
   4. Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del ICP en el conjunto del filtro de puerto y vuelva a llenarla con un total de 30 ml de medio. Reemplace la jeringa de 30 ml en el conjunto del filtro.

5. Configuración del sistema de registro de datos

NOTA: El sistema de registro de datos se compone de una fuente de alimentación de 8 canales, un amplificador de puente multicanal, transductores de presión hidrostática y una computadora con software de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales). A continuación se describe cómo configurar y calibrar el sistema.

1. Conecte el cable de alimentación a la parte posterior de la fuente de alimentación de 8 canales y conéctelo a un dispositivo de respaldo de batería.
2. Conecte el cable USB de la fuente de alimentación de 8 canales a la parte posterior del ordenador.
3. Conecte la fuente de alimentación de 8 canales al amplificador de puente multicanal mediante el cable I2C suministrado.
4. Conecte los cables Bayonet Neill-Concelman (BNC) a las entradas de canal frente a la fuente de alimentación de 8 canales y el extremo de los cables a los canales correspondientes en la parte posterior del amplificador multicanal.
5. Conecte los cables del transductor a la parte frontal del amplificador multicanal.
6. Instale el software de adquisición de datos en el equipo.
   1. Ejecute el instalador de configuración del software de adquisición de datos desde el CD de software suministrado.
   2. Siga las instrucciones en la pantalla de la computadora.
   3. Cuando se complete la instalación, seleccione Finalizar.
7. Encienda la fuente de alimentación de 8 canales.
8. Encienda la computadora e inicie el software de adquisición de datos.
   1. Seleccione archivo | Nuevo.
   2. Seleccione configuración | Configuración del canal. Seleccione tres canales (abajo a la izquierda de la pantalla). En la columna Título del canal , cambie el nombre de los canales de la siguiente manera: CH1 ICP; PIO CH2; CH3 TLPG (IOP-ICP).
   3. Seleccione 2 mV para el rango en todos los canales. En la columna Cálculo , seleccione Sin cálculo para los canales 1 y 2.
   4. En la columna Cálculo , seleccione Aritmética para el canal 3. En la sección Fórmula : Seleccionar canales/CH2; Seleccione aritmética "-"; Seleccione canales/CH1. En la sección Salida , seleccione mmHg. Seleccione Aceptar. Vuelva a seleccionar Aceptar .
9. Configure y calibre los transductores de presión hidrostática.
   NOTA: Los transductores de presión hidrostática deben calibrarse antes de los experimentos utilizando el siguiente método.
   1. Conecte los transductores de presión hidrostática a las líneas de transductores conectadas al amplificador de puente multicanal.
   2. Conecte una jeringa de 30 ml llena de aire al puerto lateral del transductor de presión CH1 (ICP). Conecte el esfigmomanómetro a la parte inferior del transductor de presión CH1 (ICP).
   3. En el gráfico, vea la página del software de adquisición de datos, establezca la velocidad de muestreo haciendo clic con el botón izquierdo en la flecha junto al tiempo de muestreo y seleccione 100. A continuación, haga clic con el botón derecho en el área CH1 (ICP) de la página.
   4. Seleccione Amplificador de puente. Seleccione Filtro de red. Seleccione Cero y espere a que el sistema se ponga a cero, teniendo cuidado de no mover el transductor de presión.
   5. Pellizque las pestañas blancas del transductor de presión y empuje el aire a través del transductor hasta obtener 40 mmHg en el esfigmomanómetro. Suelte las pestañas blancas y retire la jeringa y el esfigmomanómetro.
   6. En la página Conversión de unidades , seleccione el signo 'menos (-)'. Resalte la meseta más alta para indicar 40 mmHg. Haga clic en la flecha del punto 1 e introduzca 40.
   7. Resalte la meseta más baja para indicar 0 mmHg. Haga clic en la flecha del punto 2 e introduzca 0. Seleccione mmHg para las unidades. Seleccione Aceptar.
   8. Seleccione Aceptar (página Amplificador de puente). Repita los pasos 9.1–9.7 para CH2 (IOP) usando 100 mmHg para la meseta más alta y 0 para la meseta más baja.
10. Conecte la unidad de segmento TAS/posterior al sistema de adquisición de datos.
    1. Coloque la unidad TAS/segmento posterior en una incubadora (37 °C, 5% _co2). Conecte el tubo ICP desde el puerto OUT al transductor de presión CH1 (ICP).
    2. Conecte el tubo IOP del puerto OUT al transductor de presión CH2 (IOP).
    3. Conecte las configuraciones de la jeringa (ICP e IOP) con medio desde los puertos IN hasta el soporte del anillo.
    4. En la página Vista de gráfico , seleccione Iniciar muestreo. Establezca la velocidad de muestreo haciendo clic con el botón izquierdo en la flecha junto al tiempo de muestreo y seleccione Lento y 1 min.
    5. Ajuste las jeringas en el soporte del anillo hacia arriba o hacia abajo para regular las presiones ICP e IOP según los requisitos del protocolo.
    6. Realice la reposición sistémica del medio en el sistema cada 48-72 h a través del método push and pull.

6. Recuperación y análisis de datos

1. Abra el archivo de datos en el software de adquisición de datos.
2. En la sección Data Pad , haga clic en el icono Agregar múltiples al DataPad . Aparecerá una nueva ventana.
   1. En la sección Buscar usando , seleccione Hora en el menú desplegable.
   2. En la sección Seleccionar , seleccione 1 hora cada 1 hora en los menús desplegables.
   3. En la sección Paso a paso , seleccione Todo el archivo y, a continuación, haga clic en Agregar.
3. En la sección Data Pad , haga clic en el icono Data Pad View . Resalte todos los datos y copie / pegue en una hoja de cálculo.
4. Calcule la media y las desviaciones estándar para IOP, ICP y TLPG cada 24 h. Recopile los datos utilizando la opción de tabla dinámica en un programa de hoja de cálculo y un gráfico.

7. Inmunohistoquímica y tinción de hematoxilina y eosina de segmentos posteriores

1. Retire los segmentos oculares posteriores siguiendo varios puntos de tiempo del modelo TAS y fije la formalina antes de parafinar.
2. Seccionar los ojos para producir planos de tejido sagital.
3. Desparafinar los segmentos incrustados en parafina con una solución 100% xileno, 95% etanol, 50% etanol.
4. Lave los portaobjetos con PBS durante 10 minutos y bloquee con un tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h.
5. Etiquete las secciones con anticuerpos primarios: anticolágeno IV (marcador de matriz extracelular (ECM), NB120-6586, 1:100) y antilaminina (marcador ECM, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (marcador RGC), GTX118619, 1:50).
6. Detectar los anticuerpos primarios utilizando anticuerpos secundarios Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo, A11008, 1:500).
7. Contramante los núcleos celulares utilizando la solución antidesvanecimiento DAPI.
8. Capture imágenes de las secciones teñidas e imágenes de fase con lentes de objetivo 4x y 10x utilizando un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).
9. Para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E), procese las secciones en un sistema de tinción automatizado (consulte la Tabla de materiales) para la desparafinación utilizando una solución de etanol 100%, xileno al 95%, etanol al 50% y manche con H&E.
10. Capture imágenes con las lentes de objetivos 4x y 10x utilizando un microscopio con una fuente de luz de campo brillante.

Resultados

Diseño y creación del sistema autónomo translaminar
El diferencial de presión translaminar es un mecanismo clave potencial en la patogénesis de diversas enfermedades, incluido el glaucoma. Los usos para el modelo descrito incluyen, pero no se limitan a, el estudio del glaucoma (PIO elevada, tal vez disminución de la PIC), lesión cerebral traumática (PIC elevada) y exposición a largo plazo a la discapacidad visual asociada a la microgravedad (PIC elevada, PIO elevada). Para ayudar a descubrir ...

Discusión

Los tejidos postmortem humanos son un recurso especialmente valioso para el estudio de las enfermedades neurodegenerativas humanas porque la identificación de posibles fármacos desarrollados en modelos animales debe ser traducible a ^humanos47. Los efectos de la elevación de la PIO humana están bien establecidos, pero se ha realizado una investigación mínima sobre los cambios anormales de presión translaminar de ONH. A pesar de que existen múltiples modelos animales y modelos finitos de ONH...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack	Amazon	B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100)	Amazon	B000FMYRHK
30 mL Syringes without Needle	Vitality Medical	302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap	QOSINA	2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver	Brikksen Stainless Steel Fastners	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE	Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-glutamine Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps	F.S.T.	11254-20
Eye Scissors Standard Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers	Fisher Scientific	16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution	Fisher Scientific	SV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear	Qosina	28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate	AD instruments	DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscope	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White	QOSINA	65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)	AD instruments	FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male	McMAster-Carr	7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe	McMAster-Carr	51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft.	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T.	14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved	Katena	K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)	University of North Texas Health Science Center	N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030