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要約

トランスラミナー自律システムの使用について説明し、詳細を説明する。このシステムは、ヒト後部セグメントを利用して、セグメント内の圧力(眼内)および周囲の視神経(頭蓋内)を独立して調節し、緑内障視神経障害の特徴を模倣する経層圧勾配を生成する。

要約

緑内障病原性に関連する様々な病原性パラダイムを同定できる頭蓋内圧(ICP)および眼内圧(IOP)を用いて、疾患の病因を標的とすることができる新しい前臨床ヒトモデルに対する現在のアンメットニーズがある。エキビボヒト前部灌流器官培養モデルは、緑内障の病態の発見および治療薬の試験に有効な技術として、これまで利用され、応用されてきた。前臨床薬物スクリーニングおよびヒト臓器系の前臨床研究は、臨床研究により翻訳可能である。本稿では、トランスラミナー自律システム(TAS)と呼ばれる新しいex vivoヒト経層圧モデルの生成と動作について詳細に説明する。TASモデルは、ヒトドナー後部セグメントを使用して、ICPとIOPを独立して規制することができます。このモデルは、前臨床的な方法で病因を研究することを可能にする。それは眼科の研究で生きている動物の使用を減らすことができます。.インビトロ実験モデルとは対照的に、視神経ヘッド(ONH)組織構造、複雑性、完全性もex vivo TASモデル内で維持することができます。

概要

最近の調査の世界的な推計によると、2億8,500万人が視覚障害を持ち、そのうち3,900万人が視覚障害を持っています1。2010年、世界保健機関(WHO)は、目の後部セグメントに記載されている9つの主要な失明原因のうちの3つが発生することを文書化しました。後部眼疾患は、レチナ、脈絡膜、視神経2を含む。レティナと視神経は脳の中枢神経系(CNS)の拡張である。眼球神経節細胞(RGC)軸索は視神経を通って眼を出て視神経を形成するため損傷を受けやすい3。ONHは、ラミネラクリプロサ(LC)4と呼ばれる結合組織ビームの3Dメッシュワークのために、RGC軸索にとって最も脆弱な点であり続けます。ONHは緑内障5,6,7のRGC軸索に対する侮辱の初期部位であり、ONH内の遺伝子発現変化は眼圧および緑内障モデル8,9,10で研究されている。RGC軸索は、眼内圧(IOP)と呼ばれる眼内区画間の圧力差と、頭蓋内圧(ICP)11と呼ばれる眼内膜膜下腔内の圧力差のためにONHで感受性を有する。LC領域は両方の領域を分離し、通常の圧力差を維持し、IOPは10~21mmHg、ICPは5~15mmHg12の範囲です。2つのチャンバー間の層間の圧力差は、経層圧勾配(TLPG)13と呼ばれる。緑内障の主な危険因子は、IOP14の上昇である。

IOPが増加すると、層内および層領域全体の歪が増加する6,15,16。ヒトおよび動物モデルにおける実験的観測は、軸索損傷の初期部位であるONHを17,18個としている。ONHで緑内障損傷を引き起こすIOP関連ストレスおよびひずみの生体力学的パラダイムは、緑内障19,20,21の病態生理学にも影響を及ぼす。ヒトの圧力誘発変化が機械的にRGC軸索22に損傷を与えるにもかかわらず、薄層内にコラーゲン状のプレートを欠いているげっ歯類も緑内障7,23を発症する可能性がある。さらに、IOPの上昇は、一次開放的な角緑内障患者の最も顕著な危険因子であり、正常な緊張緑内障患者はIOPが上昇しなくても緑内障の視神経障害を発症する。さらに、視神経損傷を示さない眼圧症患者のサブセットもあります。また、脳脊髄液圧(CSFp)が緑内障の病態に役割を果たす可能性も示唆されている。この証拠は、緑内障患者では正常な個体に比べてICPが〜5mmHgに低下し、それによって経層圧の上昇を引き起こし、疾患24,25において重要な役割を果たすことを示している。以前は、イヌモデルで、IOPおよびCSFpの変化を制御することによって、視ディスク26の大きな変位が存在することが実証された。ブタの目にCSFpを上昇させることはまた、LC領域およびレトロ層神経組織内の増加した主な緊張を示している。RgcsとLC領域への負担の増加は、軸索輸送の閉塞およびRGCs27の損失に寄与します。RGCの進行性変性は、栄養性サポート28,29の喪失、炎症過程/免疫調節30,31の刺激、およびアポトーシスエフェクター29,32,33,34,35と関連している。さらに、軸索損傷(図3)は、RGCに有害な影響を及ぼし、回生障害36,37,38,39を引き起こします。IOPの効果はよく研究されているにもかかわらず、異常な経層圧変化に対して最小限の研究が行われてきた。緑内障のほとんどの治療法は、IOPの安定化に焦点を当てています。しかし、IOPの低下は病気の進行を遅らせるが、視野の喪失を逆転させ、RGCの完全な喪失を防ぐものではない。

現在の証拠は、外傷性または神経変性視覚障害に苦しむ患者の様々な機械的、生物学的、または生理学的変化による経層圧調節が重大な視力低下を引き起こす可能性があることを示している。現在、元生体内ヒトONH内の緑内生体損傷の研究を可能にする真の前臨床ヒト後部セグメントモデルは存在しない。眼科27では眼の後部の観察と治療は大きな課題です。後眼を標的とする物理的および生物学的障壁は、高い排除率、血液性バリア、および潜在的な免疫学的応答40を含む。新しい薬剤標的に対するほとんどの有効性および安全性試験は、生体外細胞および生体内動物モデル41を利用して達成される。眼の解剖学は複雑であり、インビトロ研究は組織モデルシステムによって提示される解剖学的および生理的障壁を正確に模倣しない。動物モデルは薬物動態学的研究の必需品ですが、ヒト後眼の眼生理は、眼の細胞構造、脈管系、ONH41,42など様々な動物種によって異なる可能性があります。

生きている動物の使用は、集中的かつ詳細な倫理規則、高い財政的コミットメント、および効果的な再現性43を必要とします。最近、実験研究における動物の倫理的使用に関する他のガイドライン44,45,46が制定されました。動物実験の代わりに、病気の病因を調査し、ONHの損傷を保護するための薬物の潜在的な分析を調査するために、ex vivoヒトの目のモデルを使用しています。ヒト死後組織は、ヒト疾患パラダイム、特にヒト神経変性疾患の場合、動物モデルで開発された潜在的な薬物の同定にはヒト47に翻訳可能である必要があるため、ヒト疾患パラダイムを研究するための貴重なリソースである。このエクスビボヒトドナー組織は、ヒト障害47,48,49の研究に広く利用されており、ヒト前セグメント灌流器官培養系は以前、IOP50,51,52の上昇の病態生理学を研究するユニークなex vivoモデルを提供してきました。

ヒトの目のIOPとICPに関連する経層圧を研究するために、我々は、ヒトドナーの眼の後部セグメントを用いてIOPとICPを独立して調節できる2室のトランスラミナー自律システム(TAS)の設計と開発に成功した。これは、経層圧を研究し、ONHに対するTLPGの生体力学的効果を利用する最初のex vivoヒトモデルです。

このex vivoヒトTASモデルは、IOPまたはICPの慢性的な上昇のために起こる細胞および機能性の修飾を発見し、分類するために使用することができる。本レポートでは、TASヒト後部セグメントモデルの解剖、設定、モニタリングのステップバイステップのプロトコルについて詳述する。このプロトコルは、他の研究者が生体機械疾患の病因を研究するために、この新しいex vivo加圧ヒト後部セグメントモデルを効果的に再現することを可能にする。

プロトコル

ヒト組織を含む研究のためにヘルシンキ宣言の規定に従って目を得た。

注:評判の良い眼球バンク(例えば、ライオンズ眼移植研究所、研究センター、タンパFL)からの目は死亡の6〜12時間以内に収穫され、ドナー血清はB型肝炎、C型肝炎、およびヒト免疫不全ウイルス1および2について試験された。彼らが受け取られたら、目は解剖され、24時間以内にTASモデルに設定されました。除外基準には、眼病理学が含まれていた。年齢、人種、性別に基づいて目が除外されませんでした。レティナの生存率を確認するために、組織ドナーからレチンの外植物を採取し、7日および14日間培養した(補足図1)。これらのレチナはまた解光し、RGCマーカー、多発スプライシングを有するRNA結合タンパク質(RBPMS)、ならびにそれらの神経フィラメントにおける正のニューロフィラメント軽鎖(NEFL)染色を有する培養中の健康なGLCを7日間成長させた(補足図2)。.

1. 設備・消耗品の製造・殺菌

  1. 必要な供給の完全なリスト、サプライヤー番号、カタログ番号については、 資料表 をご覧ください。
  2. 使用する前に、オートクレーブまたはエチレンオキシドアンプルを使用して、すべての機器や器具を殺菌してください。

2. 灌流媒体の調製

  1. 1%ペニシリンストレプトマイシン(10,000 U/mLペニシリン、0.85%NaClで10,000 μg/mLレンサプトマイシン)、1%L-グルタミン(200mM)を1,000 mLの高グルコースダルベックコのイーグル改変のミディアム(DM)に加えます。
  2. 0.22 μmフィルターを通過して、灌流媒体を殺菌します。

3. トランスラミナー自律システム(TAS)の設定

  1. 流入シリンジ(IOP および ICP リザーバ)を設定します。
    1. 30 mL のシリンジに、30 mL の灌流媒体(セクション 2)を加えます。30 mLのシリンジに3ウェイストップコックを取り付けます。3ウェイストップコックに0.22 μmの親水性フィルターを取り付けます。15 G Luer スタブ アダプターを 0.22 μm 親水性フィルターに取り付けます。
    2. シリンジの設定から気泡を取り除く。15 G Luer スタブ アダプタにチューブを取り付けます。未発明のユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。合計 2 つの設定について、この手順を繰り返します。
    3. 1つのシリンジをチャネル1頭蓋内圧(CH1 ICP)、もう一方のシリンジをチャネル2眼圧(CH2 IOP)としてラベル付けする。
  2. 流出シリンジ(IOP および ICP リザーバ)を設定します。
    1. 30 mL のシリンジに3ウェイストップコックを取り付けます。3ウェイストップコックに15 G Luerスタブアダプタを取り付けます。15 G Luer スタブ アダプタにチューブを取り付けます。
    2. 未発明のユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。合計 2 つの設定について、この手順を繰り返します。1 つのシリンジを CH1 ICP、もう 1 つのシリンジを CH2 IOP とラベル付けします。

4. 人間の目全体の地球儀の準備

注:目全体が受け取られた場合は、以下の手順に従って、前部セグメントと眼の後部セグメントを分離します。目が二分された場合は、ステップ4.4から始めます。

  1. ポビドネ-ヨウ素溶液に目全体を2分間入れる。
  2. ステリン酸緩衝液(PBS)で目をすすいで、ポビドネヨウ素をすすい取ります。2回繰り返します。
  3. 鉗子とはさみを使用して、目の地球全体からアドナキサを取り除きます。赤道で目を二分して、眼の前部と後部のセグメントを分離する。
  4. 視神経鞘を取り外します。後部セグメントからビトレウス・ユーモアを除去します。
  5. 必要に応じて後部セグメントから追加のスクレラをトリムし、IOP(下部)チャンバーの円形ドームに適しています。鉗子を使用して、レチナがセグメントの後部に均等に広がっていることを確認します。
  6. IOP (下部) チャンバーのセットアップ
    1. 視神経が上に向いている円形ドームの上に、TASのIOP(下)室に人間の後部セグメントを置きます。
    2. エポキシ樹脂Oリングを4本のネジで使用して後部セグメントをシールし、密閉を確保します。
    3. チューブを IOP (下部) チャンバの IN ポートと OUT ポートに挿入します。チューブを含む媒体を持つIOP流入シリンジがINポートに挿入され、チューブ付きの空のIOP流出シリンジがOUTポートに挿入されます。
    4. プッシュ/プル方式を使用して、灌流媒体を流入口にゆっくりと注入して後部アイカップを満たす一方で、流出注射器を通して灌流媒体をゆっくりと引き出してラインから気泡を取り除きます。INチューブとOUTチューブの両方が気泡を空隙したら、培地を注入しないでください。
    5. オフの位置にストップコックをロックします。IOP INポートフィルタアセンブリから30 mLのシリンジを取り出し、合計30 mLの培地で補充します。30 mLのシリンジをフィルターアセンブリに交換します。
  7. ICP(上)チャンバーのセットアップ
    1. ICP(上)のチャンバー/蓋を後部セグメントの背面に置きます。視神経が最上部の部屋の中にあることを確認します。4本のネジで上部チャンバーをシールします。
    2. チューブを ICP(上部)チャンバーの IN ポートと OUT ポートに挿入します。チューブを含む ICP インフロー シリンジは、イン ポートに挿入され、チューブ付きの空の ICP 流出シリンジが OUT ポートに挿入されます。
    3. ICPチャンバーを充填するために、INポートにゆっくりとゆっくりと注入し、プッシュ/プル法を使用してラインから気泡を除去します。ICPチャンバーとINとOUTの両方のチューブが気泡の空隙になったら、媒体を注入しないでください。
    4. オフの位置にストップコックをロックします。ポートフィルターアセンブリのICPから30 mLのシリンジを取り出し、合計30 mLの媒体で補充します。30 mLのシリンジをフィルターアセンブリに交換します。

5. データ記録システムのセットアップ

注:データ記録システムは、8チャンネル電源、マルチチャンネルブリッジアンプ、静水圧トランスデューサ、およびデータ取得ソフトウェアを搭載したコンピュータで構成されています( 材料表を参照)。以下は、システムの設定および調整の方法を説明します。

  1. 電源コードを8チャンネル電源の背面に接続し、バッテリバックアップデバイスに接続します。
  2. 8 チャンネルの電源からコンピュータの背面に USB ケーブルを接続します。
  3. 付属のI2Cコードを使用して、8チャンネルの電源をマルチチャンネルブリッジアンプに接続します。
  4. 8 チャンネル電源の前のチャネル入力に、ケーブルの端部にバイオレット ニール・コンセルマン(BNC)ケーブルをマルチチャンネルアンプの背面にある対応するチャネルに接続します。
  5. トランスデューサケーブルをマルチチャンネルアンプの前面に接続します。
  6. コンピュータにデータ収集ソフトウェアをインストールします。
    1. 提供されたソフトウェア CD からデータ収集ソフトウェアセットアップインストーラを実行します。
    2. コンピュータの画面の指示に従います。
    3. インストールが完了したら、[ 完了] を選択します。
  7. 8チャンネルの電源をオンにします。
  8. コンピュータの電源を入れ、データ収集ソフトウェアを起動します。
    1. ファイル |の選択新機能。
    2. セットアップ |の選択チャンネル設定。3 つのチャンネルを選択します (画面の左下)。チャネルタイトル列で、チャネルの名前を次のように変更します。CH2 IOP;CH3 TLPG (IOP-ICP)。
    3. すべてのチャンネルの 範囲 として 2 mV を選択します。[ 計算 ]列で、チャンネル1と2の 計算なし を選択します。
    4. [ 計算 ] 列で、チャネル 3 の [算術] を選択します。[ 式 ] セクションで、 チャネル/CH2 を選択します。 算術 "-" を選択します。 チャンネル/CH1を選択します。 出力 セクションで mmHg を選択します。[ OK] を選択します。もう一度 [OK] を選択します 。
  9. 静水圧トランスデューサを設定し、較正します。
    注:静水圧トランスデューサは、次の方法を使用して実験する前に較正する必要があります。
    1. 静水圧トランスデューサをマルチチャンネルブリッジアンプに接続されたトランスデューサラインに接続します。
    2. 空気で満たされた30 mLのシリンジをCH1(ICP)圧力トランスデューサの側面ポートに取り付けます。CH1(ICP)圧力トランスデューサの底部にスフィモマノメーターを取り付けます。
    3. グラフで、データ取得ソフトウェアのページを表示し、サンプリング時間の横にある矢印を左クリックしてサンプリング速度を設定し、 100 を選択します。次に、ページの CH1 (ICP) 領域を右クリックします。
    4. ブリッジアンプを選択します。[メイン フィルタ] を選択します。ゼロを選択し、圧力トランスデューサを動かさないためにシステムがゼロになるまで待ちます。
    5. 圧力トランスデューサの白いタブをつまみ、40 mmHgが血圧計で得られるまでトランスデューサを通して空気を押します。白いタブを放し、注射器と血圧計を取り外します。
    6. [ 単位変換] ページで、[マイナス (-)] 記号を選択します。40 mmHg を示す最も高い高原を強調表示します。点 1 の 矢印 をクリックし、40 と入力します。
    7. 0 mmHg を示す最下層をハイライトします。点 2 の 矢印 をクリックし、0 と入力します。単位として mmHg を選択します。[ OK] を選択します。
    8. [OK](ブリッジアンプページ)を選択します。最高の高原では 100 mmHg、最下層部では 0 を使用して、CH2 (IOP) の場合は手順 9.1 ~ 9.7 を繰り返します。
  10. TAS/後部セグメントユニットをデータ収集システムに接続します。
    1. TAS/後部セグメントユニットをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れる。OUT ポートから CH1(ICP)圧力トランスデューサに ICP チューブを取り付けます。
    2. OUT ポートから CH2(IOP)圧力トランスデューサに IOP チューブを取り付けます。
    3. インポートからリングスタンドに、インディアを使用してシリンジのセットアップ(ICPおよびIOP)を取り付けます。
    4. [ チャート ビュー ] ページで、[ サンプリングの開始] を選択します。サンプリング時間の横にある矢印を左クリックしてサンプリング速度を設定し、[ 低速 ] および [ 1 分] を選択します。
    5. リングスタンドのシリンジを上下に調整して、プロトコル要件に合わせてICPおよびIOP圧力を調整します。
    6. プッシュとプル方式を使用して、システム内の培地の全身補充を48~72時間ごとに行います。

6. データの取得と分析

  1. データ取得ソフトウェアでデータファイルを開きます。
  2. [ データ パッド] セクションで、[ データ パッドに複数 追加] アイコンをクリックします。新しいウィンドウが表示されます。
    1. [ 検索方法 ] セクションで、ドロップダウン メニューから [時間 ] を選択します。
    2. [ 選択 ] セクションで、ドロップダウン メニューから 1 時間 ごとに 1 時間 を選択します。
    3. [ ステップスルー ] セクションで[ ファイル全体 ]を選択し、[ 追加]をクリックします。
  3. [データ パッド] セクションで、[データ パッド表示] アイコンをクリックします。すべてのデータをハイライト表示し、スプレッドシートにコピー/ペーストします。
  4. 24 時間ごとに IOP、ICP、および TLPG の平均と標準偏差を計算します。スプレッドシート プログラムおよびグラフでピボットテーブル オプションを使用してデータを照合します。

7. 後部セグメントの免疫染色とヘマトキシリンとエオシン染色

  1. TASモデルから様々なタイムポイントに続く後眼部を取り除き、パラフィンをする前にホルマリンで固定します。
  2. 目を切って矢状組織面を作り出す。
  3. パラフィン埋め込みセグメントを100%キシレン、95%エタノール、50%エタノール溶液でデパラフィン化します。
  4. PBSでスライドを10分間洗浄し、1時間室温でブロッキングバッファでブロックします。
  5. 一次抗体を有する標識切片:抗コラーゲンIV(細胞外マトリックス(ECM)マーカー、NB120-6586、1:100)および抗ラミニン(ECMマーカー、NB300-144、1:100、抗RBPMS(RGCマーカー)、GTX118619、1:50)。
  6. Alexa Fluor二次抗体を用いて一次抗体を検出する(アレクサフルオール488ヤギ抗ウサギ、A11008、1:500)。
  7. DAPI抗フェード溶液を用いて細胞核に対抗する。
  8. 蛍光顕微鏡を使用して、4xおよび10x対物レンズで染色されたセクションと位相画像の画像をキャプチャします( 材料表を参照)。
  9. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の場合、100%、キシレン95%エタノール、50%エタノール溶液およびH&Eとの染色を使用して、デパラフィン化のための自動染色システム( 材料表を参照)でセクションを処理します。
  10. 明視野光源を持つ顕微鏡を使用して、4xと10x対物レンズで画像をキャプチャします。

結果

トランスラミナー自律システムの設計と作成
トランスラミナー圧差は、緑内障を含む様々な疾患の病因における潜在的な重要なメカニズムである。記載されたモデルの用途には、緑内障(IOPの上昇、ICPの低下)、外傷性脳損傷(高いICP)、微小重力関連視覚障害(ICPの上昇、IOPの上昇)への長期暴露の研究が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトの眼の経層圧を標的とする分子?...

ディスカッション

ヒト死後組織は、動物モデルで開発された潜在的な薬物の同定がヒト47に翻訳可能である必要があるため、ヒト神経変性疾患を研究するための特に貴重なリソースである。ヒトIOP上昇の効果は確立されているが、異常なONH経層圧変化に対して最小限の研究が行われている。複数の動物モデルとヒトONHの有限モデリングが存在するにもかかわらず、経層圧変化41,54,55,56,57を研究...

開示事項

原稿の著者は、開示する潜在的な利益相反を持っていません。

謝辞

このプロジェクトの資金は、コリーン・M・マクダウェル博士の裁量的資金を通じて行われました。この研究は、失明を防ぐための研究からUWマディソン眼科視覚科学科への無制限の助成金によって部分的に支えられた。アボット・F・クラーク博士とワイミング・マオ博士が灌流器官培養モデルに関する技術支援をしてくれたことに感謝します。ライオンズ・アイ移植・研究研究所(フロリダ州タンパ)が、人間のドナーの目を提供してくれたことに感謝します。

資料

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参考文献

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