تيراهيرتز التصوير وبروتوكول التوصيف لأورام سرطان الثدي المكوس حديثا

Summary

تتميز أورام سرطان الثدي البشري المكوس حديثًا بالتحليل الطيفي والتصوير التياهيرتزي بعد بروتوكولات معالجة الأنسجة الطازجة. يؤخذ وضع الأنسجة في الاعتبار لتمكين التوصيف الفعال مع توفير التحليل في الوقت المناسب للتطبيقات المستقبلية داخل العملية.

Abstract

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولًا للتعامل مع أورام الثدي البشرية المكوس حديثًا وتوصيفها وتصويرها باستخدام تقنيات التصوير والتنظير الطيفي النبضية. يتضمن البروتوكول وضع انتقال تيراهيرتز عند الحدوث العادي ووضع انعكاس تيراهيرتز بزاوية مائلة قدرها 30 درجة. تمثل البيانات التجريبية التي تم جمعها نبضات المجال الزمني للحقل الكهربائي. تتم معالجة إشارة الحقل الكهربائي تيراهيرتز المرسلة من خلال نقطة ثابتة على الأنسجة المكوسة ، من خلال نموذج تحليلي ، لاستخراج مؤشر الانكسار ومعامل امتصاص الأنسجة. باستخدام ماسح ضوئي للسيارات السائر، وينعكس نبض تياهيرتز المنبعث من كل بكسل على الورم توفير صورة بلازار من مناطق الأنسجة المختلفة. يمكن تقديم الصورة في مجال الوقت أو التردد. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام البيانات المستخرجة من مؤشر الانكسار ومعامل الامتصاص في كل بكسل لتوفير صورة تاهيرتز توموغرافية للورم. يوضح البروتوكول وجود تمييز واضح بين الأنسجة السرطانية والسليمة. من ناحية أخرى ، لا يمكن أن يؤدي عدم الالتزام بالبروتوكول إلى صور صاخبة أو غير دقيقة بسبب وجود فقاعات هوائية وبقايا سوائل على سطح الورم. يوفر البروتوكول طريقة لتقييم الهوامش الجراحية لأورام الثدي.

Introduction

كان التصوير والتحليل الطيفي تيراهيرتز (THz) مجالًا سريع النمو للبحث في العقد الماضي. أدى التطوير المستمر لباعثات THz الأكثر كفاءة واتساق في نطاق 0.1-4 THz إلى زيادة تطبيقاتها بشكل كبير¹. أحد المجالات التي أظهرت فيها THz وعدًا ونموًا كبيرًا هو المجال الطبي الحيوي². وقد ثبت أن الإشعاع THz غير المؤين وآمن بيولوجيا على مستويات الطاقة المستخدمة عموما لتحليل الأنسجة الثابتة³. ونتيجة لذلك، تم استخدام التصوير THz والتحليل الطيفي لتصنيف وتمييز ميزات الأنسجة المختلفة مثل محتوى المياه للإشارة إلى تلف الحرق والشفاء⁴، تليف الكبد⁵، والسرطان في الأنسجة المكوسة^6،7. يغطي تقييم السرطان على وجه الخصوص مجموعة واسعة من التطبيقات السريرية والجراحية المحتملة ، وتم التحقيق في سرطانات الدماغ⁸، الكبد⁹، المبيضين¹⁰، الجهاز الهضمي¹¹، والثدي^{7،12،13،14،15،16،17،18،19}.

تركز تطبيقات THz لسرطان الثدي في المقام الأول على دعم جراحة حفظ الثدي، أو استئصال الورم، من خلال تقييم الهامش. الهدف من استئصال الورم هو إزالة الورم وطبقة صغيرة من الأنسجة السليمة المحيطة ، على النقيض من استئصال الثدي الكامل ، والذي يزيل الثدي بأكمله. ثم يتم تقييم الهامش الجراحي للأنسجة المكوسة عن طريق علم الأمراض بمجرد إصلاح العينة في الفورماتين، مقطعة، مضمنة في البارافين، ومثبتة في 4 ميكرومتر-5 ميكرومتر شرائح على شرائح المجهر. يمكن أن تستغرق هذه العملية وقتًا طويلاً وتتطلب إجراءً جراحيًا ثانويًا في وقت لاحق إذا لوحظ وجود هامش إيجابي^20. المبادئ التوجيهية الحالية من قبل الجمعية الأمريكية للأورام الإشعاعية تعريف هذا الهامش الإيجابي وجود الخلايا السرطانية الاتصال على مستوى سطح الحبر هامش²¹. يقتصر التصوير بتردد عالٍ للأنسجة المرطبة عالية الامتصاص في المقام الأول على التصوير السطحي مع بعض التغلغل المختلف استنادًا إلى نوع الأنسجة ، وهو ما يكفي لتلبية الاحتياجات الجراحية لتقييم الهامش السريع. ومن شأن إجراء تحليل سريع لظروف الهامش أثناء الإعداد الجراحي أن يقلل إلى حد كبير من التكاليف الجراحية ومعدل إجراءات المتابعة. حتى الآن، وقد أثبتت THz فعالة في التمييز بين السرطان والأنسجة السليمة في الأنسجة الرسمية الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) ، ولكن هناك حاجة إلى تحقيق إضافي لتوفير الكشف موثوق بها من السرطان في الأنسجة المكوس حديثا⁷.

ويفصّل هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإجراء التصوير بتقنية THz والتنظير الطيفي على عينات الأنسجة البشرية المكوس حديثاً التي تم الحصول عليها من مصرف حيوي. THz التطبيقات المبنية على حديثا استئصال أنسجة سرطان الثدي البشري نادرا ما استخدمت في البحوث المنشورة^7,18,22,23, وخاصة من قبل مجموعات بحثية غير متكاملة مع مستشفى. استخدام الأنسجة الطازجة هو أيضا نادرة لتطبيقات السرطان الأخرى, مع معظم الأمثلة سرطان الثدي غير الإنسان التي يتم الإبلاغ عنها لسرطان القولون^24,,25. أحد أسباب ذلك هو أن كتل أنسجة FFPE أسهل بكثير للوصول إليها والتعامل معها من الأنسجة المكوسة الطازجة ما لم يكن نظام THz المستخدم للدراسة جزءًا من سير العمل الجراحي. وبالمثل، فإن معظم أنظمة THz المختبرية التجارية غير مستعدة للتعامل مع الأنسجة الطازجة، وتلك التي لا تزال في مراحل استخدام نمو خط الخلية أو أنها بدأت فقط في النظر إلى الأنسجة المكوسة من النماذج الحيوانية. لتطبيق THz على الإعداد داخل العملية يتطلب أن يتم تطوير خطوات التصوير والتوصيف للأنسجة الطازجة مقدما بحيث لا يتداخل التحليل مع القدرة على إجراء علم الأمراض القياسية. بالنسبة للتطبيقات التي لا يقصد بها بطبيعتها أن تكون داخل العملية ، لا يزال توصيف الأنسجة الطازجة خطوة صعبة يجب معالجتها للعمل من أجل تطبيقات الحي والتمايز.

والهدف من هذا العمل هو توفير مبادئ توجيهية لتطبيق THz للأنسجة المكوسة حديثاً باستخدام نظام THz تجاري. تم تطوير البروتوكول على نظام التصوير والتنظير الطيفي THz²⁶ لأورام سرطان الثدي الماتورين^13،17،19 وتم توسيعه إلى الأنسجة الجراحية البشرية التي تم الحصول عليها من البنوك الحيوية^7،18. في حين تم إنشاء البروتوكول لسرطان الثدي ، يمكن تطبيق نفس المفاهيم على أنظمة التصوير THz المماثلة وأنواع أخرى من سرطانات الأورام الصلبة التي يتم علاجها مع الجراحة حيث يعتمد النجاح على تقييم الهامش^27. بسبب كمية صغيرة إلى حد ما من نتائج THz المنشورة على الأنسجة المكوسة حديثا، وهذا هو أول عمل لمعرفة المؤلفين للتركيز على بروتوكول مناولة الأنسجة الطازجة للتصوير THz والتوصيف.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول جميع المتطلبات التي حددها قسم الصحة والسلامة البيئية في جامعة أركنساس.

1. إعداد منطقة مناولة الأنسجة

1. خذ صينية معدنية من الفولاذ المقاوم للصدأ وغطيها بكيس الخطر الحيوي كما هو موضح في الشكل 1. سيتم إجراء أي مناولة الأنسجة البيولوجية داخل منطقة الدرج (أي منطقة مناولة الأنسجة).
2. إعداد ملاقط المختبر، مناديل الأنسجة، المناشف الورقية، حزمة ورقة تصفية، زجاجات صبغ الأنسجة، زجاجة التبييض، وزجاجة الإيثانول حول صينية لسهولة الوصول إليها عند الحاجة. احتفظ بأي أنسجة مستعملة ومناديل وقفازات على سطح مادة الخطر الحيوي للتخلص منها في نهاية البروتوكول.
3. املأ أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل بسعة تصل إلى 45 مل من الفورمينين المحايد بنسبة 10% ووضعه في علبة تخزين الطرد المركزي بالقرب من صينية مناولة الأنسجة.

الشكل 1: إعداد منطقة مناولة الأنسجة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. التعامل مع سرطان الثدي الطازج ورم لTHz الطيفي انتقال

تنبيه: قبل التعامل مع أي أنسجة حية، وضعت على قفازات اليد النتريل، نظارات حماية العين، قناع الوجه، ومعطف المختبر. دائما استخدام ملاقط المختبر للتعامل مع الأنسجة وتجنب لمسها مباشرة مع اليدين. يجب إجراء جميع الأعمال مع الأنسجة الطازجة خارج حاوية مختومة أو مرحلة المسح الضوئي في منطقة مناولة الأنسجة المنشأة في الخطوة 1.1.

ملاحظة: تم شحن جميع الأنسجة التي تم التعامل معها في هذا العمل في وسيط جلالنسر المعدلة في دولبيككو (DMEM) وحل المضادات الحيوية من البنك الحيوي.

1. إزالة الورم السائبة من محلول DMEM ووضعه في طبق بيتري على منطقة مناولة الأنسجة (انظر الشكل 2A).
2. من التفتيش الإجمالي، حدد مناطق الورم المتميزة التي شريحة قطع صغيرة لتوصيف انتقال العدوى. قطع شريحة سميكة 0.5 مم من الورم من النقاط المحددة باستخدام شفرة الفولاذ المقاوم للصدأ منخفضة المنوال، كما هو مبين في الشكل 2B. ضع هذا القسم المقطع المقطع بين نافذتين كوارتز مع فاصل سمك 0.1 مم في حامل عينة سائلة ، كما هو موضح في الشكل 2C.

الشكل 2: أقسام الورم لقياسات التحليل الطيفي لناقل الحركة THz. (أ)صورة للورم السائب. (ب)صورة فوتوغرافية للأقسام الصغيرة (0.5 مم) من الورم المقطوع من الورم السائب. (ج)مقطع الورم المقطع الموضوع في حامل العينة السائلة بين نافذتي الكوارتز مع فاصل البولي ترافلوروإيثيلين عيار 0.1 مم لقياس الطيف. أعيد نشر الشكل من T. بومان وآخرون¹⁸ بإذن من SPIE. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. THz قياسات الطيف الإرسال

1. تعيين وحدة التحليل الطيفي الإرسال داخل الغرفة الأساسية THz عن طريق محاذاة مقابض وحدة على المشاركات المتصاعدة في النظام الأساسي وانزلاق المرحلة إلى أسفل إلى النظام. تشديد مسامير تصاعد اثنين في الزوايا اليسرى اليمنى العليا والسفلى من وحدة كما هو مبين في الشكل 3A.
2. تطهير النظام مع غاز النيتروجين الجاف في 5 لتر / دقيقة (LPM) خلال إجراء التحليل الطيفي بأكمله لإزالة بخار الماء من مساحة العينة.
3. افتح برنامج قياس الطيف الإرسالي THz من سطح المكتب المتصل بنظام THz. ستفتح النافذة الرئيسية
4. انقر على علامة التبويب المسح الضوئي في الجزء العلوي من النافذة. ستظهر نافذة إعداد مسح الأطياف. من القائمة المنسدلة لعلامة التبويب وضع القياس في أعلى يمين النافذة، حدد الإرسال لإعداد التحليل الطيفي للإرسال. إذا لم تكن الذروة مرئية تلقائيًا، فتحقق من خيار تمكين ضمن علامة التبويب "بحث الذروة اليدوية" وخطوة التأخير البصري يدويًا لعرض الذروة.
5. بعد 30 دقيقة من التطهير، قم بتسجيل إشارة مرجعية جوية باتباع الخطوات التالية.
   1. ضمن علامة التبويب إعدادات المسح الضوئي في إطار إعداد مسح الأطياف، أدخل اسمًا مناسبًا للملف المرجعي، وحدّد مسح Num إلى 1800، وتعيين تأخير البدء (s)إلى 0. اترك الإعدادات الأخرى كقيم افتراضية لها.
   2. انقر على قياس المرجع في إطار إعداد المسح الضوئي لاتخاذ قياس مرجع الهواء. ثم انقر على قياس عينة لقياس إشارة الإرسال من خلال الهواء كعينة متوسط 1800 إشارة على مدى ~ 1 دقيقة.

الشكل 3: إعداد وحدة التحليل الطيفي لناقل الإرسال THz. (A)THz الغرفة الأساسية مع وحدة الإرسال التي شنت عليها. (ب)صورة لحامل العينة السائلة. (ج)حامل العينة الموضوع داخل الغرفة الأساسية للقياسات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. قياس نافذتي الكوارتز في حامل العينة السائلة كما هو موضح في الشكل 3B.
   1. ضع نافذتي الكوارتز في حامل العينة السائلة دون فاصل بينهما.
   2. افتح الغرفة الأساسية THz. قم بتركيب حامل العينة السائلة على وحدة التحليل الطيفي للإرسال، كما هو موضح في الشكل 3C. أغلق الغرفة
   3. انقر على علامة التبويب المسح الضوئي على النافذة الرئيسية. كرر الخطوات 3.5.1-3.5.2 لعينة الكوارتز، ولكن تحديث تأخير البدء (s)إلى 900. وهذا يسمح الوقت لتطهير أي بخار الماء قبل القياس.
   4. إذا كان الكوارتز مطلوبًا كمرجع لعينات إضافية، فانقر على علامة التبويب مسح المرجع تحت إعدادات المسح الضوئي. هذا يخلي مرجع الهواء. ثم انقر على علامة التبويب قياس مرجع لتسجيل قياسات الكوارتز كمرجع جديد.
7. ضع قسم الورم المقطّع بين نافذتي الكوارتز داخل حامل العينة السائلة ووضع الحامل داخل الغرفة لقياس انتقال نقطة واحدة للأنسجة. لتسجيل القياس، كرر الخطوة 3.6.3.
8. أخرج حامل العينة السائلة من الغرفة عند الانتهاء من القياسات وإحضارها إلى المنطقة المخصصة للتعامل مع الأنسجة. تفكيك حامل العينة السائلة، ومسح قسم الورم من نوافذ الكوارتز مع مناديل الأنسجة، ووضع مناديل الأنسجة المستخدمة في نفس الدرج للتخلص في كيس الخطر الحيوي جنبا إلى جنب مع النفايات الأخرى الخطرة بيولوجيا.
9. كرر الخطوات 2.2 و 3.7 و 3.8 حسب الضرورة لتوصيف شرائح أورام إضافية. عند اكتمال القياسات، انتقل إلى النافذة الرئيسية وانقر على علامة التبويب "ملف" لحفظ بيانات القياس. أغلق نافذة البرنامج.

4. التعامل مع سرطان الثدي الطازج ورم لTHz وضع انعكاس التصوير

1. قم بإزالة عينة الورم الطازج من محلول DMEM والمضادات الحيوية ووضعها على طبق بيتري. باستخدام الفحص الإجمالي، حدد جانبًا من الورم ليتم صورته بشكل مسطح بما فيه الكفاية ويحتوي على القليل من الدم والأوعية الدموية القليلة. تجنب تصوير الأنسجة بالدم أو الأوعية الدموية إذا كان ذلك ممكناً.
2. وضع الورم مع الجانب ليتم تصورها على ورقة تصفية الصف 1 لتجفيف DMEM الزائدة ومسح أنسجة السوائل أو إفرازات من الورم، كما هو مبين في الشكل 4A. إعادة وضع الورم على ورقة التصفية إلى بقعة جافة كما تشبع الورق. تجفيف الورم لمدة ~ 5 دقيقة.

الشكل 4: إعداد عينة الورم الطازج للتصوير THz. (أ)ورم وضعت على ورقة مرشح لتجف. (ب)ورم يوضع على لوحة البوليسترين فوق نافذة التصوير مع منصات مسح الأنسجة لامتصاص السوائل الزائدة. (C)الورم ينظر إليه من أسفل لتتبع التوجه والتحقق من فقاعات الهواء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إلغاء تحميل وحدة التحليل الطيفي الإرسال وتعيين وحدة تصوير انعكاس (RIM) قاعدة مرآة على النظام الأساسي THz كما هو مبين في الشكل 5A. عند وضع المرايا، قم بتركيب مرحلة المسح الضوئي لـ RIM فوق قاعدة المرآة والمسمار في النظام الأساسي (انظر الشكل 5B).
4. تطهير النظام مع غاز النيتروجين الجاف في 5 LPM لمدة 30 دقيقة قبل إجراء التصوير لإزالة بخار الماء من مقصورة العينة. بعد 30 دقيقة، تقليل كمية غاز النيتروجين الجاف إلى 3 LPM لبقية الوقت النظام هو في الاستخدام.
5. ضع لوحة البوليسترين ذات السماكة ~ 1.2 مم على نافذة المسح الضوئي ذات القطر ~ 37 مم. مركز نافذة المسح الضوئي جنبا إلى جنب مع لوحة البوليسترين على مرحلة العينة.

الشكل 5: إعداد النظام لتصوير الانعكاس. (أ)انعكاس نموذج التصوير قاعدة المرآة. (ب)مرحلة المسح الضوئي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: سمك أخرى ومواد لوحة مناسبة للخطوة 4.5 ولكن ينبغي أن يكون سمك موحدة وتكون منخفضة بما فيه الكفاية لاستيعاب لا تعوق إشارة THz.

6. افتح برنامج قياس تصوير انعكاس THz من سطح المكتب المتصل بنظام THz. ستظهر نافذة تظهر العديد من رموز الحوار لوظائف محددة ونافذتين فرعيتين لمؤامرات حقل THz (وحدات عشوائية) مقابل الوقت والتردد، على التوالي.
7. لتعيين المعلمات لإعداد RIM، انقر على رمز حوار معلمة الصورة في أعلى النافذة. ستظهر نافذة معلمات اكتساب الصور. حدد RIM من القائمة المنسدلة لعلامة التبويب القالب لإعداد تصوير الانعكاس. ضرب موافق والعودة إلى النافذة الرئيسية للبرنامج.
8. في النافذة الرئيسية، انقر على رمز المسح الضوئي الثابت. وهذا سوف تنشيط هوائيات THz لبدء إرسال إشارة THz الحادث وتلقي إشارة THz المنعكسة من نقطة واحدة على لوحة البوليسترين.
9. انقر على رمز حوار المرحلة الحركية في الجزء العلوي من النافذة الرئيسية. نافذة التحكم في المحرك ستفتح. ضبط محور التأخير البصري عن طريق النقر على الأسهم الاتجاه إلى الأمام / عكس مركز النبض المنعكس من البوليسترين في النافذة الرئيسية.
   ملاحظة: بعد ضبط محور التأخير البصري ، يجب أن تظهر نبضتان على النافذة ، كما هو موضح في الشكل 6: واحدة من الواجهة السفلية للوحة البوليسترين (الانعكاس الأساسي) ، وواحدة من الواجهة العليا للوحة البوليسترين (انعكاس ثانوي).
10. نافذة من الانعكاس الأساسي من لوحة البوليسترين والحفاظ على الانعكاس الثانوي في النافذة ، مما سيساهم في الانعكاسات من الأنسجة أثناء إجراء التصوير. ويتم ذلك في خطوتين.
    1. أولاً، انقر على زر إعدادات DAQ في أعلى النافذة الرئيسية لفتح نافذة حوار إعدادات DAQ. تغيير قيمة التأخير البصري من 5 V (افتراضي) إلى 4 V.
    2. ثانياً، قم بضبط الوضع الرأسي لمرحلة المسح الضوئي بمقياس الميكرومتر على مرحلة المسح الضوئي حتى تكون المينيما للنبض الثانوي هي الأقوى. ضبط التأخير البصري للمحور في نافذة التحكم الحركي لوضع الانعكاس الأساسي خارج نطاق الإشارة المنعكسة التي يتم قياسها.
       ملاحظة: بالنسبة للوحة البوليسترين السميكة مقاس 1.2 مم، يتم وضع انعكاس أساسي عندما تكون ذروة الانعكاس الثانوي الدنيا -0.3 مم تقريبًا على محور التأخير البصري لإطار المجال الزمني.

الشكل 6: انعكاسات THz من الواجهات السفلية والعليا لصفيحة البوليسترين. (أ)THz إشارة الحادث إلى وينعكس من لوحة البوليسترين سميكة 1.2 مم. (B)قياس إشارات المجال الزمني THz الأولية والثانوية من البوليسترين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

11. مستوى مرحلة العينة وتسجيل الإشارة المرجعية.
    1. حدد نقطتين على كل محور (المحور A وB-المحور) التي تشير إلى المواقع على لوحة البوليسترين بالقرب من حافة إطار العينة. على سبيل المثال، بالنسبة للمحور A الذي يتراوح بين -15 مم-15 مم، يمكن أن تكون نقطتا الموضع -10 مم و10 مم. وبالنسبة للمحور B التي تتراوح بين -15 مم-15 ملم، يمكن أن تكون نقطتا الموضع -10 مم و10 مم.
    2. انقر على زر حوار التحكم في المحرك لفتح نافذة التحكم في المحرك. إعادة وضع إطار التحكم في المحرك ونافذة البرنامج الرئيسية بحيث تكون إشارة المجال الزمني مرئية أثناء ضبط مواضع المحرك. تعيين كل من المحور A و المحور B إلى 0 مم.
    3. تسوية المحور A باستخدام الخطوات التالية. يتم استخدام نطاق -10 مم-10 مم كمثال.
    4. في إطار التحكمفي المحرك ، قم بتغيير قيمة المحور A من 0 إلى -10 وضرب أدخل. المرحلة ينتقل إلى موقف -10 مم على المحور A ويلاحظ تحول في موقف الإشارة على النافذة الرئيسية.
    5. استخدم مقياس الميكرومتر القابل للتعديل في مرحلة المسح الضوئي الموضحة في الشكل 5B لنقل الحد الأدنى لذروة الإشارة مرة أخرى إلى الموضع المحدد في الخطوة 4.10.2.
    6. تغيير قيمة المحور A إلى +10 وضرب إدخال. ستتحرك المرحلة الآن من موضع -10 مم إلى موضع +10 مم على المحور A ويلاحظ حدوث تحول في الإشارة مرة أخرى. لاحظ الاتجاه والمسافة التي تحولت الإشارة من موضعها السابق وتغيير قيمة المحور A مرة أخرى إلى -10. ستعود الإشارة إلى الموضع المحدد في الخطوة 4.11.5.
    7. تدوير المسمار التسوية على المحور A من مرحلة المسح الضوئي، كما هو مبين في الشكل 5B وتحويل إشارة لمضاعفة المسافة في نفس الاتجاه الذي انتقلت من الموقف الأصلي. استخدم الميكرومتر على مرحلة المسح الضوئي لتحويل الإشارة مرة أخرى إلى الموضع الأصلي (-0.3 مم لـ 1.2 مم من البوليسترين).
    8. كرر الخطوات 4.11.6-4.11.7 حتى تكون الإشارة عند +10 و-10 متساوية وتركز الذروة لكلا الموضعين في الموضع الأصلي (-0.3 مم على المحور البصري).
12. بمجرد تحقيق تسوية المحور A، قم بتغيير قيمة المحور A إلى 0 وكرر نفس الإجراء للمحور B. ابدأ بتغيير قيمة المحور B على إطار التحكم الحركي من 0 إلى القيمة الأكثر إيجابية (على سبيل المثال +10 مم). أيضا، أثناء التسوية، استخدم المسمار التسوية على المحور B من مرحلة المسح الضوئي، والذي يظهر في الشكل 5B.
13. بمجرد تسوية كلا المحورين، أعد كل من المحور A والمحور B إلى 0 مم. أغلق نافذة التحكم في المحرك وتحقق من أن الإشارة في موضعها الأصلي في حالة تحولها قليلاً.
14. سجل هذه الإشارة كمرجع.
    1. انتقل إلى إطار خصائص DAQ المحدد. تغيير قيمة المتوسط إلى 5 والاحتفاظ بكافة المعلمات الأخرى كافتراضي.
    2. انقر على المرجع الجديد. سيتم حساب عداد المتوسط في أعلى يمين النافذة من 0-20. بمجرد أن يصل العداد إلى 20 ، قم بتغيير قيمة المتوسط إلى 1 وانقر فوق موافق. سيتم حفظ الإشارة المنعكسة من البوليسترين كمرجع لأي فحوصات يتم التقاطها لاحقًا.
       ملاحظة: إذا كان فقط إجراء التصوير THz يجب أن يتم تنفيذها، فمن الأفضل لتنفيذ الخطوات 4.3-4.14 قبل إخراج أنسجة الورم من محلول DMEM.
15. قم بتركيب الورم على لوحة البوليسترين التي تغطي نافذة مرحلة المسح الضوئي.
    1. قم بإزالة نافذة التصوير من مرحلة المسح الضوئي وأحضرها إلى منطقة مناولة الأنسجة. ضع الورم على لوحة البوليسترين، كما هو موضح في الشكل 4B.
    2. تأكد من عدم وجود فقاعات هوائية كبيرة بين اللوحة والورم. إذا لوحظت فقاعات الهواء، اضغط على الورم مع ملاقط أو رفع الورم ولفة بلطف على البوليسترين حتى يتم تقليل فجوات الهواء.
    3. وضع الفواصل الاستيعابية على فترات منتظمة حول عينة الاختبار كما هو موضح في الشكل 4B. ضع لوحة البوليسترين الأخرى فوق الورم واضغط بلطف من أجل جعل سطح الورم مسطحًا قدر الإمكان. الشريط أسفل هذا ترتيب البوليسترين ورم البوليسترين على نافذة العينة.
16. قم بقلب نافذة العينة كما هو موضح في الشكل 4C، وخذ صورًا للورم للحفاظ على سجل لاتجاهه. أعد نافذة العينة مع الورم إلى مرحلة المسح الضوئي.
17. انقر على زر حوار معلمة الصورة لفتح نافذة معلمات اكتساب الصور. تعيين قيم Axis1minو Axis1maxو Axis2minو Axis2max لأرفق بشكل كامل موضع الورم في نافذة التصوير
    ملاحظة: بشكل افتراضي، Axis1 هو المحور A وAxis2 هو المحور B.
18. تعيين Axis1step وAxis2step إلى 0.2 ملم لمسح التصوير.
    ملاحظة: تعيين Axis1step و Axis2step سيتم تعيين حجم خطوة السائر المحركات 'إلى زيادات 200 ميكرون أثناء عملية المسح الضوئي. يمكن تقدير إجمالي وقت الفحص في إطار معلمات اكتساب الصور.
19. انقر على علامة التبويب قياس على النافذة الرئيسية وحدد خيار المسح الضوئي 2D Flyback. في الإطار الذي ينبثق، قم بالإشارة إلى اسم الدليل والملف الذي يتم ضمنهما حفظ بيانات الفحص.

5. بعد المعالجة الأنسجة الطازجة استعدادا لإجراء علم الأمراض النسيجية

1. عند الانتهاء من عملية المسح الضوئي، قم بإزالة نافذة العينة، وألواح البوليسترين، وعينة من نظام THz الأساسي ونقلها إلى المنطقة المخصصة للنفايات الخطرة. إزالة الورم من لوحة البوليسترين ووضعه على قطعة مسطحة من الورق المقوى من حجم مماثل لتلك التي من الورم. تأكد من أن اتجاه الورم هو نفسه كما كان على البوليسترين ، مع لمس وجه التصوير للورق المقوى.
2. تراجع مسحة القطن في صبغة الأنسجة الحمراء ووصمة عار على الجانب الأيسر من الورم وصولا الى حيث حافة الورم يتصل الورق المقوى. وبالمثل، وصمة عار على الجانب الأيمن من الورم مع صبغة الأنسجة الزرقاء. قم بتلطيخ السطح المكشوف للورم بخط من صبغة الأنسجة الصفراء التي تربط البقعة الحمراء بالبقعة الزرقاء للدلالة على الجزء الخلفي من العينة ، كما هو موضح في الشكل 7A.
   ملاحظة: لمنع الحبر من تلطيخ محلول formalin، قم بتطبيق طبقة رقيقة فقط على الأنسجة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق مسحة القطن على سطح مختلف قبل تلطيخ الأنسجة أو استخدام مسحة القطن نظيفة لمسح أي صبغة الزائدة. تجنب السماح للصبغة الاتصال الجلد أو الملابس. تتم عملية تلطيخ الورم هذه كمرجع لتوفير معلومات حول جانب التصوير الخاص بالورم واتجاهه إلى أخصائي علم الأمراض.

الشكل 7: آخر معالجة على الورم بعد التصوير THz. (أ)وضع الورم وجهه لأسفل على حامل الورق المقوى ومصبوغ مع صبغة وسم الأنسجة. (ب)تصفية الورق الموضوع ة فوق الورم ومسجلة للحفاظ على الاتصال. (C)ورم ملطخ ة ثابتة على الورق المقوى مغمورة في 10٪ حل رسمي مؤقت محايد ومختومة مع parafilm. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. دع الحبر يجف لمدة 3-4 دقيقة تقريبًا. اقطع قطعة من ورق التصفية بنفس الأبعاد التقريبية مثل الورق المقوى. وضعه على الورم والتفاف قطعة من الشريط تماما حول ورقة التصفية والورق المقوى كما هو مبين في الشكل 7B. يجب أن الشريط وورقة التصفية تأمين الورم ضد الورق المقوى دون تطبيق أي ضغط كبير.
4. تزج الأنسجة الملونة الملصقة على الورق المقوى في 10٪ حل رسمي محايد وختم أنبوب الطرد المركزي باستخدام فيلم البارافين، كما هو مبين في الشكل 7C. قم بتعيين رقم العينة والتاريخ ونوع الأنسجة ورقم الورم للعينة الموجودة على ملصق الأنبوب. إرسال الورم إلى أخصائي علم الأمراض لمزيد من المعالجة علم الأنسجة.

6 - التخلص من النفايات الخطرة

1. جمع جميع النفايات من علبة مناولة الأنسجة جنبا إلى جنب مع كيس المخاطر البيولوجية المستخدمة لتغطية الدرج ووضعها في كيس جديد من المخاطر البيولوجية، كما هو مبين في الشكل 8. إحضار الحقيبة إلى منطقة النفايات المحددة الخطورة بيولوجياً في المبنى وتحديد موعد مع قسم الصحة والسلامة البيئية (EH&S) لالتقاط النفايات. تنظيف علبة مناولة الأنسجة والمنطقة المحيطة بها على الطاولة مع محلول التبييض 10٪ والإيثانول.

الشكل 8: صورة لحقيبة النفايات الخطيرة بيولوجيا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. خذ حامل العينة السائلة مع الفواصل ونوافذ الكوارتز ، ونافذة أخذ العينات التي تم تركيب الورم عليها ، ولوحات البوليسترين ، وملاقط المختبر إلى منطقة الغسيل. شطف جميع المواد بالماء ومن ثم 10٪ محلول التبييض، والمسح بالمناشف الورقية حسب الضرورة لإزالة حطام الأنسجة. شطف مرة أخرى بالماء، فرك مع محلول ألكونوكس، وشطف جيدا. للزجاج والبلاستيك، شطف في الكحول ايزوبروبيل 70٪ وتوضع جانبا لتجف.
   ملاحظة: بمجرد أن يكون الورم في formalin وتكون مساحة العينة نظيفة ، يمكن معالجة البيانات في نفس الوقت الذي يتم فيه التصوير أو في وقت لاحق.

7. معالجة البيانات لبناء صور THz

1. تصدير ملفات بيانات .tvl المحفوظة من نظام THz. تتم كتابة ملفات البيانات الخام التي تم الحصول عليها من النظام في بيثون وأفضل قراءة في بيثون قبل الحفظ كملفات بيانات MATLAB.
2. لبناء صورة THz للأنسجة الطازجة الممسوحة ضوئياً، قم بتحويل بيانات تصوير انعكاس المجال الزمني الخام إلى مجال التردد باستخدام تحويل فورييه على البعد الثالث لمصفوفة البيانات الخام (أي البعد الزمني). أيضا اتخاذ تحويل فورييه من البيانات المرجعية.
   ملاحظة: وينبغي أن يوفر طيف نطاق التردد النموذجي بيانات تتراوح بين 0.1 THz-4 THz.
3. تطبيع بيانات العينة مع البيانات المرجعية وتنفيذ أطياف الطاقة على أساس تكامل البيانات العادية على نطاق التردد من f₁ = 0.5 THz إلى f₂ = 1.0 THz باستخدام المعادلة التالية^19:
   
   ملاحظة: هنا _{E عينة} هو ضوء التردد انعكاس البيانات تصوير عينة الأنسجة _{وE مرجع} هو مجال التردد من بيانات انعكاس نقطة واحدة من الإشارة المرجعية.
4. قم بإنشاء الصورة ثنائية الأبعاد عن طريق رسم بيانات أطياف الطاقة المحسوبة عند كل نقطة في المصفوفة التي تم تعريفها بواسطة المحور A وB-axis. هذا ما يعرف باسم صورة المواصفات THz الأطياف الطاقة.
   ملاحظة: طريقة الحصول على صورة THz توموغرافية بدلاً من ذلك مفصلة في الخطوات 7.5-7.7.
5. للتوصيف، احسب الانعكاس النظري المعتمد على التردد لمجموعة من خصائص الأنسجة المحتملة باستخدام المعادلة^{التالية 18:}
   
   ملاحظة: هنا _هو معامل انعكاس Fresnel المعقد بين المنطقة i وregion j; d_j هو سمك المنطقة j؛ وο_j هي زاوية الانتشار في المنطقة j المتعلقة بزاوية الإصابة بقانون Snell. هو معامل الانتشار المعقد في المنطقة j، حيث يكون الترددات الزاوي ، ج هي سرعة الضوء في الفراغ ، n_j هو الجزء الحقيقي من مؤشر الانكسار ، وα ABS ،_j هو معامل الامتصاص¹⁸. المنطقة 1 هي الهواء، المنطقة 2 هي لوحة البوليسترين، والمنطقة 3 هي الأنسجة.
6. احسب الانعكاس في المعادلة (2) لمجموعة من الفهارس الانكسارية المعرفة من قبل المستخدم ومعاملات الامتصاص للمنطقة 3(n₃ و α_ABS,3)وقارنها مع الإشارة المقاسة في كل نقطة لحساب الخطأ التربيعي المتوسط المجمع للحجم والمرحلة.
   ملاحظة: الحل للفهرس الانكساري معامل الامتصاص هو زوج القيم التي تعطي أدنى خطأ.
7. بناء صورة THz توموغرافي من مؤشر الانكسار المستخرج وبيانات معامل الامتصاص(ن₃ وα_{القيمة المطلقة،3)}في كل بكسل. تحليل مناطق الورم من خلال المقارنة مع صورة الشريحة المرضية التي تم الحصول عليها من الطبيب الشرعي. وترد النتائج التمثيلية في الشكل 9،مع أمثلة على عدم كفاية الالتزام بالبروتوكول في الشكل 10 والشكل 11.

8. استخراج الخصائص الكهربائية للأنسجة باستخدام بيانات التحليل الطيفي الإرسال

1. على النافذة الرئيسية لبرنامج قياس الطيف الإرسال THz، انتقل إلى علامة التبويب الملفات وانقر على خيار التصدير. سيتم إنشاء نافذة لتحديد نوع البيانات والنموذج للتصدير. اختر أنواع بيانات مرحلة الإرسال والإرسال لقياسات عينات الكوارتز والأنسجة.
2. حساب الإرسال النظري المعتمد على التردد لمجموعة من خصائص الأنسجة المحتملة باستخدام المعادلة التالية^15:
   
   ملاحظة: هنا هو النسبة بين معاملات انتقال Fresnel للعينة والاجهزة المرجعية; 1₁ و ₃ هي ثوابت الانتشار المعقدة للهواء والأنسجة، على التوالي؛ وd هو سمك الأنسجة. يتم تعريف ثابت الانتشار بشكل عام على أنه . ñ هو مؤشر الانكسار المعقد الذي يعرف بأنه ، حيث n هو الجزء الحقيقي من مؤشر الانكسار ؛ ج هو سرعة الضوء؛ هو التردد الزاوي؛ وα _{القيمة المطلقة} هو معامل الامتصاص^15.
3. حساب متوسط الخطأ التربيعي المشترك بين حجم ومرحلة الإرسال في المعادلة (3) وبيانات القياس من النظام لمجموعة من قيم n و α_{القيمة المطلقة} المعرفة من قبل المستخدم.
   ملاحظة: الحل للفهرس الانكساري معامل الامتصاص هو زوج القيم التي تعطي أدنى خطأ.
4. رسم مؤشر الانكسار المستخرج وبيانات معامل الامتصاص مقابل نطاق التردد من 0.15-3.5 THz. تظهر النتائج التمثيلية في الشكل 12.

النتائج

يتم عرض نتائج التصوير THz¹⁸ التي تم الحصول عليها بعد البروتوكول المذكور أعلاه من عينة ورم سرطان الثدي البشري #ND14139 وردت من البنك الحيوي في الشكل 9. وفقا لتقرير علم الأمراض، كان الورم #ND14139 هو درجة I/II تسلل سرطان القناة (IDC) التي تم الحصول عليها من امرأة تبلغ من العمر 49...

Discussion

ويعتمد التصوير الفعال للأنسجة الطازجة في الأنسجة الطازجة في المقام الأول على جانبين حاسمين هما: 1) النظر السليم في مناولة الأنسجة (القسمان 2 و4.15)؛ (2) النظر السليم في مناولة الأنسجة (القسمان 2 و4.15)؛ (2) النظر السليم في مناولة الأنسجة (القسمان 2 و4.15)؛ (2) النظر السليم في مناولة الأنسجة (القسمان 2 و4.1...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% isopropyl alcohol	VWR	89108-162	Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water
Alconox powder detergent	VWR	21835-032	Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass
Bio Hazard Bags	Fisher Scientific	19-033-712	Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags
Cardboard holder	N/A	N/A	Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin
Centrifuge Tubes	VWR	10026-078	Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line
Cotton Swabs	Walmart	551398298	Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue
Ethyl Alcohol	VWR	71002-426	KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol
Eye protection goggles	VWR	89130-918	Kimberly-clark professional safety glasses
Face Mask	VWR	95041-774	DUKAL Corporation surgical masks
Filter paper	Sigma Aldrich	Z240087	Whatman grade 1 cellulose filters
Formalin solution	Sigma Aldrich	HT501128-4L	10% neutral buffered formalin
Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC))	National Disease Research Interchange (NDRI biobank	N/A	A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required
IRADECON Bleach solution	VWR	89234-816	Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution
KIMTECH SCIENCE wipes	VWR	21905-026	Kimberly-clark professional Kim wipes
Laboratory Coat	VWR	10141-342	This catalog number is for medium size coat
Laboratory tweezers/Forceps	VWR	82027-388	Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue
Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer)	TeraView, Ltd	N/A	1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows
Nitrile hand gloves	VWR	82026-426	This catalog number is for medium size gloves
Nitrogen cylinder	Airgas	NI UHP300	NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300
Paper towel	VWR	14222-321	11" x 8.78" Sheets, 1 Ply
Parafilm	VWR	52858-076	Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion.
Petri Dish	VWR	470210-568	VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom)
Polystyrene Plate	Home Depot	1S11143A	~ 10 cm x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet
ScanAcquire Software	TeraView, Ltd	N/A	System Software for THz reflection imaging measurements
Stainless steel low-profile blade (#4689)	VWR	25608-964	Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades
Stainless steel metal tray	Quick Medical	10F	Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays
Tissue Marking Dyes	Ted Pella, Inc	Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4	Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory
TPS Spectra 3000	TeraView, Ltd	N/A	THz imaging and spectroscopy system
TPS Spectra Software	TeraView, Ltd	N/A	System Software for THz transmission spectroscopy measurements