Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

Zusammenfassung

Frisch ausgeschnittene menschliche Brustkrebstumoren zeichnen sich durch Terahertz-Spektroskopie und Bildgebung nach Protokollen zur Handhabung von frischem Gewebe aus. Die Gewebepositionierung wird berücksichtigt, um eine effektive Charakterisierung zu ermöglichen und gleichzeitig eine zeitnahe Analyse für zukünftige intraoperative Anwendungen bereitzustellen.

Zusammenfassung

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Handhabung, Charakterisierung und Abbildung frisch ausgeschnittener menschlicher Brusttumoren mit gepulsten Terahertz-Bildgebungs- und Spektroskopie-Techniken dar. Das Protokoll beinhaltet den Terahertz-Übertragungsmodus bei normaler Inzidenz und den Terahertz-Reflexionsmodus in einem schrägen Winkel von 30°. Die gesammelten experimentellen Daten stellen Zeitbereichsimpulse des elektrischen Feldes dar. Das durch einen festen Punkt auf dem ausgeschnittenen Gewebe übertragene terahertz-Elektrisches Feldsignal wird durch ein analytisches Modell verarbeitet, um den Brechungsindex und den Absorptionskoeffizienten des Gewebes zu extrahieren. Mit Hilfe eines Schrittmotorscanners wird der terahertz emittierte Puls von jedem Pixel auf dem Tumor reflektiert und liefert ein planares Bild verschiedener Geweberegionen. Das Bild kann in der Zeit- oder Frequenzdomäne dargestellt werden. Darüber hinaus werden die extrahierten Daten des Brechungsindexes und des Absorptionskoeffizienten an jedem Pixel verwendet, um ein tomographisches Terahertz-Bild des Tumors zu liefern. Das Protokoll zeigt eine klare Unterscheidung zwischen krebserkranken und gesunden Geweben. Andererseits kann das Nichtbeachtung des Protokolls zu lauten oder ungenauen Bildern führen, da Luftblasen und Flüssigkeitsreste auf der Tumoroberfläche auftreten. Das Protokoll bietet eine Methode zur chirurgischen Margenbewertung von Brusttumoren.

Einleitung

Terahertz (THz) Bildgebung und Spektroskopie war ein schnell wachsendes Forschungsgebiet in den letzten zehn Jahren. Die kontinuierliche Entwicklung effizienterer und konsistenterer THz-Emitter im Bereich von 0,1–4 THz hat dazu geführt, dass ihre Anwendungen deutlich um¹gestiegen sind. Ein Bereich, in dem THz vielversprechend und deutlich gewachsen ist, ist der biomedizinische Bereich². THz-Strahlung hat sich als nichtionisierend und biologisch sicher auf den Leistungsniveaus im Allgemeinen verwendet, um feste Gewebe zu analysieren³. Als Ergebnis, THz Bildgebung und Spektroskopie wurde verwendet, um zu klassifizieren und zu unterscheiden verschiedene Gewebemerkmale wie Wassergehalt, um Verbrennungsschäden und Heilung⁴, Leberzirrhose⁵, und Krebs in verbraucheten^{Geweben 6,7}anzuzeigen. Krebs-Bewertung insbesondere deckt ein breites Spektrum von potenziellen klinischen und chirurgischen Anwendungen, und wurde für Krebserkrankungen des^Gehirns8 , Leber⁹, Eierstöcke¹⁰, Magen-Darm-Trakt¹¹, und Brust^{7,12,13,14,15,16,17,18,19}.

THz-Anwendungen für Brustkrebs konzentrieren sich in erster Linie auf die Unterstützung der Brustkonservierender Chirurgie oder Lumpektomie durch Margin-Bewertung. Das Ziel einer Lumpektomie ist es, den Tumor und eine kleine Schicht von umgebendem gesundem Gewebe zu entfernen, im Gegensatz zur vollen Mastektomie, die die gesamte Brust entfernt. Der chirurgische Rand des ausgeschnittenen Gewebes wird dann über die Pathologie bewertet, sobald die Probe in Formalin fixiert, geschnitten, in Paraffin eingebettet und in 4 m–5-m-Scheiben auf Mikroskopdias montiert wurde. Dieser Prozess kann zeitaufwändig sein und erfordert einen sekundären chirurgischen Eingriff zu einem späteren Zeitpunkt, wenn eine positive Marge beobachtet wird²⁰. Aktuelle Richtlinien der American Society of Radiation Oncology definieren diese positive Marge als Krebszellen, die mit der Oberflächenrandtinte²¹in Berührung kommen. THz-Bildgebung für hochabsorbierendes hydratisiertes Gewebe beschränkt sich in erster Linie auf Oberflächenbildgebung mit einer unterschiedlichen Penetration basierend auf dem Gewebetyp, was ausreicht, um die chirurgischen Anforderungen einer schnellen Margin-Bewertung zu erfüllen. Eine schnelle Analyse der Randbedingungen während der chirurgischen Einstellung würde die chirurgischen Kosten und die Folgerate erheblich senken. Bis heute hat sich THz bei der Unterscheidung zwischen Krebs und gesundem Gewebe in formal fixierten, paraffinierten (FFPE) Geweben als wirksam erwiesen, aber zusätzliche Untersuchungen sind erforderlich, um einen zuverlässigen Nachweis von Krebs in frisch ausgeschnittenen Geweben zu ermöglichen⁷.

In diesem Protokoll werden die Schritte zur Durchführung von THz-Bildgebung und Spektroskopie an frisch ausgeschnittenen menschlichen Gewebeproben beschrieben, die von einer Biobank gewonnen wurden. THz-Anwendungen, die auf frisch ausgeschnittenen menschlichen Brustkrebsgeweben basieren, wurden selten in veröffentlichten Forschungsarbeiten^7,18,22,23verwendet, insbesondere von Forschungsgruppen, die nicht in ein Krankenhaus integriert sind. Die Verwendung von frisch ausgeschnittenem Gewebe ist ebenfalls selten für andere Krebsanwendungen, wobei die meisten Nicht-Brustkrebs-Beispiele für Darmkrebs^24,25berichtet werden. Ein Grund dafür ist, dass FFPE-Gewebeblöcke viel einfacher zugänglich sind und handhaben als frisch ausgeschnittenes Gewebe, es sei denn, das THz-System, das für die Studie verwendet wird, ist Teil des chirurgischen Arbeitsablaufs. In ähnlicher Weise sind die meisten kommerziellen Labor-THz-Systeme nicht bereit, mit frischem Gewebe umzugehen, und diejenigen, die das tun, befinden sich noch in den Stadien der Verwendung des Zelllinienwachstums oder haben erst begonnen, ausgeschnittenes Gewebe aus Tiermodellen zu untersuchen. Um THz auf eine intraoperative Einstellung anzuwenden, müssen Bildgebungs- und Charakterisierungsschritte für frisches Gewebe im Voraus entwickelt werden, damit die Analyse die Fähigkeit zur Durchführung von Standardpathologie nicht beeinträchtigt. Für Anwendungen, die nicht von Natur aus als intraoperativ gedacht sind, ist die Charakterisierung von frischem Gewebe nach wie vor ein anspruchsvoller Schritt, der auf In-vivo-Anwendungen und Differenzierung ausgerichtet werden muss.

Ziel dieser Arbeit ist es, eine Richtlinie für die THz-Anwendung für frisch ausgeschnittenes Gewebe mit einem kommerziellen THz-System zu schaffen. Das Protokoll wurde auf einem THz-Bildgebungs- und Spektroskopiesystem²⁶ für murine Brustkrebstumoren^13,17,19 entwickelt und auf menschliches chirurgisches Gewebe aus Biobanken^7,18erweitert. Während das Protokoll für Brustkrebs generiert wurde, können die gleichen Konzepte auf ähnliche THz-Bildgebungssysteme und andere Arten von Festtumorkrebs angewendet werden, die mit einer Operation behandelt werden, bei der der Erfolg von der Margenbewertung abhängt²⁷. Aufgrund einer relativ geringen Menge an veröffentlichten THz-Ergebnissen zu frisch ausgeschnittenen Geweben ist dies die erste Arbeit nach dem Wissen der Autoren, die sich auf das Protokoll der Frischgewebehandhabung für THz-Bildgebung und Charakterisierung konzentriert.

Protokoll

Dieses Protokoll erfüllt alle Anforderungen der Abteilung für Umweltgesundheit und -sicherheit an der Universität Arkansas.

1. Einrichten des Gewebebehandlungsbereichs

1. Nehmen Sie ein Edelstahl-Metallfach und bedecken Sie es mit dem Biohazard-Beutel, wie in Abbildung 1dargestellt. Jede Handhabung der biologischen Gewebe wird innerhalb des Traybereichs (d. h. des Gewebebehandlungsbereichs) durchgeführt.
2. Bereiten Sie Labor-Pinzetten, Gewebetücher, Papiertücher, Filterpapierpackung, Gewebefarbstoffflaschen, Bleichflasche und Ethanolflasche um das Tablett für einfachen Zugriff bei Bedarf vor. Bewahren Sie gebrauchte Gewebe, Tücher und Handschuhe auf der Oberfläche des Biohazard-Materials auf, um sie am Ende des Protokolls zu entsorgen.
3. Füllen Sie ein 50 ml Zentrifugenrohr mit bis zu 45 ml 10% neutral gepuffertem Formalin und legen Sie es in die Zentrifuge-Lagerschale in der Nähe des Gewebehandling-Trays.

Abbildung 1: Einrichtung des Gewebebehandlungsbereichs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Umgang mit frischem Brustkrebstumor für THz Transmission Spectroscopy

ACHTUNG: Vor dem Umgang mit lebenden Geweben, tragen Sie Nitril Handhandschuhe, Schutzbrille, eine Gesichtsmaske und einen Labormantel. Verwenden Sie immer Laborpinzette, um Gewebe zu behandeln und zu vermeiden, sie direkt mit den Händen zu berühren. Alle Arbeiten mit frischem Gewebe außerhalb eines versiegelten Behälters oder der Scanphase sollten an dem in Schritt 1.1 eingerichteten Gewebebehandlungsbereich durchgeführt werden.

HINWEIS: Alle bei dieser Arbeit behandelten Gewebe wurden in Dulbeccos Modified Eagle-Medium (DMEM) und Antibiotikalösung von der Biobank geliefert.

1. Entfernen Sie den Massentumor aus der DMEM-Lösung und legen Sie ihn in eine Petrischale auf dem Gewebebehandlungsbereich (siehe Abbildung 2A).
2. Identifizieren Sie bei der Grobprüfung unterschiedliche Tumorregionen, aus denen kleine Stücke für die Transmissionscharakterisierung geschnitten werden. Schneiden Sie ein 0,5 mm dickes Tumorsegment von den identifizierten Punkten mit einer Niederprofilklinge aus Edelstahl, wie in Abbildung 2Bdargestellt. Platzieren Sie diesen geschnittenen Abschnitt zwischen zwei Quarzfenstern mit einem Abstandhalter von 0,1 mm Dicke in einem flüssigen Probenhalter, wie in Abbildung 2Cdargestellt.

Abbildung 2: Tumorschnitt für die THz-Übertragungsspektroskopiemessungen. (A) Foto des Massentumors. (B) Foto der kleinen Abschnitte (0,5 mm) des Tumors, der aus dem Massentumor geschnitten wurde. (C) Der in Scheiben geschnittene Tumorabschnitt, der im flüssigen Probenhalter zwischen den beiden Quarzfenstern mit einem 0,1 mm Polytetrafluorethylen-Abstandshalter für die Spektroskopiemessung platziert ist. Abbildung von T. Bowman et al.¹⁸ mit Genehmigung von SPIE wiederveröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. THz Transmission Spectroskopie Messungen

1. Stellen Sie das Transmissionsspektroskopiemodul innerhalb der THz-Kernkammer ein, indem Sie die Modulgriffe über die Montagepfosten im Kernsystem ausrichten und die Bühne nach unten in das System schieben. Ziehen Sie die beiden Befestigungsschrauben in der oberen rechten und unteren linken Ecke des Moduls an, wie in Abbildung 3Adargestellt.
2. Reinigen Sie das System während des gesamten Spektroskopieverfahrens mit trockenem Stickstoffgas bei 5 L/min (LPM), um Wasserdampf aus dem Probenraum zu entfernen.
3. Öffnen Sie die THz-Übertragungsspektroskopie-Messsoftware vom Desktop aus, der mit dem THz-System verbunden ist. Es öffnet das Hauptfenster.
4. Klicken Sie auf die Registerkarte Scannen oben im Fenster. Ein Spectra Scan Setup-Fenster wird angezeigt. Wählen Sie im Dropdown-Menü der Registerkarte Messmodus oben rechts im Fenster die Option Übertragung aus, um die Übertragungsspektroskopie einzurichten. Wenn die Spitze nicht automatisch sichtbar ist, aktivieren Sie die Option Aktivieren unter der Registerkarte Manuelle Spitzensuche, und schritt Sie manuell die optische Verzögerung, um die Spitze in sauge zu versetzen.
5. Zeichnen Sie nach 30 min Der Reinigung ein Luftreferenzsignal auf, indem Sie die folgenden Schritte befolgen.
   1. Geben Sie unter der Registerkarte Scaneinstellungen im Spektren-Scan-Setup-Fenster einen entsprechenden Namen für die Referenzdatei ein, legen Sie Num Scans auf 1.800 fest, und legen Sie die Startverzögerung (s) auf 0 fest. Belassen Sie die anderen Einstellungen als Standardwerte.
   2. Klicken Sie im Scan-Setup-Fenster auf Maßreferenz, um die Luftreferenzmessung durchzuführen. Klicken Sie dann auf Sample messen, um das Übertragungssignal durch Luft als Stichprobendurchschnitt von 1.800 Signalen über 1 min zu messen.

Abbildung 3: Einrichtung des THz-Übertragungsspektroskopiemoduls. (A) THz-Kernkammer mit darauf montiertem Übertragungsmodul. (B) Ein Foto des Flüssigkeitsprobenhalters. (C) Der Probenhalter, der für die Messungen in der Kernkammer platziert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Messen Sie die beiden Quarzfenster im Flüssigkeitsprobenhalter, wie in Abbildung 3Bdargestellt.
   1. Legen Sie die beiden Quarzfenster in den flüssigen Probenhalter ohne Abstandshalter dazwischen.
   2. Öffnen Sie die THz-Kernkammer. Montieren Sie den Flüssigkeitsprobenhalter am Transmissionsspektroskopiemodul, wie in Abbildung 3Cdargestellt. Schließen Sie die Kammer.
   3. Klicken Sie auf die Registerkarte Scannen im Hauptfenster. Wiederholen Sie die Schritte 3.5.1–3.5.2 für das Quarzbeispiel, aktualisieren Sie jedoch start delay (s) auf 900. Dies lässt Zeit, um Wasserdampf vor der Messung zu reinigen.
   4. Wenn der Quarz als Referenz für zusätzliche Proben gewünscht wird, klicken Sie auf die Registerkarte Referenz löschen unter den Scan-Einstellungen. Dadurch wird die Luftreferenz gelichtt. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Measurereferenz, um die Quarzmessungen als neue Referenz aufzuzeichnen.
7. Platzieren Sie den in Scheiben geschnittenen Tumorabschnitt zwischen den beiden Quarzfenstern innerhalb des Flüssigkeitsprobenhalters und positionieren Sie den Halter in der Kammer für eine Einzelpunkt-Übertragungsmessung des Gewebes. Wiederholen Sie Schritt 3.6.3, um die Messung aufzuzeichnen.
8. Nehmen Sie den Flüssigkeitsprobenhalter nach Abschluss der Messungen aus der Kammer und bringen Sie ihn in den Bereich, der für die Gewebehandhabung vorgesehen ist. Zerlegen Sie den Flüssigkeitsprobenhalter, wischen Sie den Tumorabschnitt mit den Gewebetüchern aus den Quarzfenstern ab und legen Sie die verwendeten Gewebetücher in ein und demselben Tablett, um sie zusammen mit den anderen Biogefährdungsabfällen in den Biogefährdungsbeutel zu entsorgen.
9. Wiederholen Sie die Schritte 2.2, 3.7 und 3.8, wenn dies erforderlich ist, um zusätzliche Tumorscheiben zu charakterisieren. Wenn die Messungen abgeschlossen sind, gehen Sie zum Hauptfenster und klicken Sie auf die Registerkarte Datei, um die Messdaten zu speichern. Schließen Sie das Softwarefenster.

4. Umgang mit frischem Brustkrebs tumor für THz Reflexionsmodus Imaging

1. Entfernen Sie die frische Tumorprobe aus der DMEM- und Antibiotikalösung und legen Sie sie auf eine Petrischale. Wählen Sie bei grober Inspektion eine Seite des Tumors aus, die ausreichend flach ist und wenig Blut und wenige Blutgefäße hat. Vermeiden Sie bildgebendes Gewebe mit Blut oder Blutgefäßen, wenn möglich.
2. Legen Sie den Tumor mit der Seite, die abgebildet werden soll, auf Filterpapier Grad 1, um das überschüssige DMEM zu trocknen und das Gewebe von Flüssigkeit oder Sekreten aus dem Tumor zu entfernen, wie in Abbildung 4Adargestellt. Positionieren Sie den Tumor auf dem Filterpapier an einen trockenen Punkt, wenn das Papier gesättigt ist. Trocknen Sie den Tumor für ca. 5 min.

Abbildung 4: FrischeS Tumorprobenpräparat für tHz-Bildgebung. (A) Tumor auf Filterpapier zum Trocknen gelegt. (B) Tumor auf Polystyrolplatte über dem bildgebenden Fenster mit Tissue-Wischpads platziert, um überschüssige Flüssigkeiten zu absorbieren. (C) Tumor von unten betrachtet, um die Spurausrichtung zu verfolgen und auf Luftblasen zu überprüfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Heben Sie das Transmissionsspektroskopiemodul auf und stellen Sie die Spiegelbasis des Reflexions-Imaging-Moduls (RIM) auf dem THz-Kernsystem ein, wie in Abbildung 5Adargestellt. Wenn Sie die Spiegel einstellen, montieren Sie die RIM-Scanstufe über der Spiegelbasis und schrauben Sie sie in das Kernsystem ein (siehe Abbildung 5B).
4. Reinigen Sie das System mit trockenem Stickstoffgas bei 5 LPM für 30 min vor dem Bildgebungsverfahren, um Wasserdampf aus dem Probenraum zu entfernen. Nach 30 min reduzieren Sie die Menge an trockenem Stickstoffgas auf 3 LPM für den Rest der Zeit, in der das System in Gebrauch ist.
5. Legen Sie eine Polystyrolplatte mit einer Dicke von 1,2 mm auf das Scanfenster mit einem Durchmesser von 37 mm. Zentrieren Sie das Scanfenster zusammen mit der Polystyrolplatte auf der Probenstufe.

Abbildung 5: Systemeinrichtung für Reflexionsabbildungen. (A) Reflexions-Bildverarbeitungsmodul Spiegelbasis. (B) Scanstufe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HINWEIS: Andere Dicken und Plattenmaterialien eignen sich für Schritt 4.5, sollten aber eine gleichmäßige Dicke aufweisen und eine geringe Absorption aufweisen, um das THz-Signal nicht zu behindern.

6. Öffnen Sie die THz-Reflexions-Bildgebungs-Messsoftware vom Desktop aus, der mit dem THz-System verbunden ist. Es öffnet sich ein Fenster mit mehreren Dialogsymbolen für bestimmte Funktionen und zwei Unterfenstern für THz-Feldplots (willkürliche Einheiten a.u.) gegen die Zeit bzw. Frequenz.
7. Um die Parameter für die RIM-Einrichtung festzulegen, klicken Sie oben im Fenster auf das Symbol Bildparameterdialog. Ein Fenster "Bildaufnahmeparameter" wird angezeigt. Wählen Sie RIM aus dem Dropdown-Menü der Registerkarte Vorlage für die Einrichtung von Reflexionsabbildungen aus. Klicken Sie auf OK und gehen Sie zurück zum Hauptfenster der Software.
8. Klicken Sie im Hauptfenster auf das Symbol Festpunkt-Scan. Dadurch werden die THz-Antennen aktiviert, um das ereignisgemäße THz-Signal zu senden und das reflektierte THz-Signal von einem einzigen Punkt auf der Polystyrolplatte zu empfangen.
9. Klicken Sie auf das Symbol MotorStage Dialog oben im Hauptfenster. Das Motorsteuerfenster öffnet sich. Passen Sie die optische Verzögerungsachse an, indem Sie auf die Vorwärts-/Rückwärtsrichtungspfeile klicken, um den reflektierten Impuls vom Polystyrol im Hauptfenster zu zentrieren.
   HINWEIS: Nach dem Einstellen der optischen Verzögerungsachse sollten zwei Impulse auf dem Fenster erscheinen, wie in Abbildung 6dargestellt: einer von der unteren Schnittstelle der Polystyrolplatte (primäre Reflexion) und einer von der oberen Schnittstelle der Polystyrolplatte (Sekundärreflexion).
10. Fenster die primäre Reflexion von der Polystyrolplatte heraus und halten Sie die sekundäre Reflexion im Fenster, die während des bildgebenden Verfahrens zu den Reflexionen aus dem Gewebe beiträgt. Dies geschieht in zwei Schritten.
    1. Klicken Sie zunächst auf die Schaltfläche Datenerfassungseinstellungen oben im Hauptfenster, um das Dialogfenster für die Datenerfassungseinstellungen zu öffnen. Ändern Sie den optischen Verzögerungswert von 5 V (Standard) auf 4 V.
    2. Zweitens passen Sie die vertikale Position der Scanstufe mit der Mikrometerskala auf der Scanstufe an, bis die Minima des sekundären Impulses am stärksten ist. Passen Sie die optische Verzögerung der Achse im Motor Control Window an, um die primäre Reflexion außerhalb des Bereichs des gemessenen reflektierten Signals zu setzen.
       HINWEIS: Bei einer 1,2 mm dicken Polystyrolplatte wird die primär reflektierende Reflexion ausgeklappt, wenn die sekundäre Reflexionsminimale Spitze auf der optischen Verzögerungsachse des Zeitbereichsfensters etwa -0,3 mm beträgt.

Abbildung 6: THz-Reflexionen von der unteren und oberen Schnittstelle der Polystyrolplatte. (A) THz-Signaleinfall zu einer 1,2 mm dicken Polystyrolplatte. (B) Gemessene primäre und sekundäre THz-Zeitdomänensignale aus dem Polystyrol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

11. Stufen Sie die Beispielstufe, und notieren Sie das Referenzsignal.
    1. Wählen Sie zwei Punkte auf jeder Achse (A-Achse und B-Achse) aus, die Positionen auf der Polystyrolplatte in der Nähe des Rands des Probenfensters bezeichnen. Bei der A-Achse von -15 mm bis 15 mm können die beiden Positionspunkte beispielsweise -10 mm und 10 mm betragen; und für die B-Achse im Bereich von -15 mm–15 mm können die beiden Positionspunkte -10 mm und 10 mm betragen.
    2. Klicken Sie auf die Taste Motor Control Dialog, um das Motorsteuerungsfenster zu öffnen. Positionieren Sie das Motorsteuerungsfenster und das Hauptsoftwarefenster so, dass das Zeitbereichssignal beim Einstellen der Motorpositionen sichtbar ist. Legen Sie sowohl die A-Achse als auch die B-Achse auf 0 mm fest.
    3. Gleichnis der A-Achse mit den folgenden Schritten. Als Beispiel wird ein Bereich von -10 mm–10 mm verwendet.
    4. Ändern Sie im Motor control Windowden Wert der A-Achse von 0 auf -10 und drücken Sie Enter. Die Stufe bewegt sich in die -10 mm Position auf der A-Achse und eine Verschiebung der Signalposition am Hauptfenster wird beobachtet.
    5. Verwenden Sie die einstellbare Mikrometerskala auf der in Abbildung 5B dargestellten Scanstufe, um die minimale Spitze des Signals zurück in die in Schritt 4.10.2 eingestellte Position zu verschieben.
    6. Ändern Sie den A-Achsenwert in +10, und drücken Sie enter. Die Stufe bewegt sich nun von der Position -10 mm in die +10 mm Position auf der A-Achse und eine Verschiebung des Signals wird wieder beobachtet. Beachten Sie die Richtung und den Abstand, in dem sich das Signal von seiner vorherigen Position verschoben hat, und ändern Sie den Wert der A-Achse erneut in -10. Das Signal kehrt in die in Schritt 4.11.5 eingestellte Position zurück.
    7. Drehen Sie die Navellierungsschraube auf der A-Achse der Scanstufe, wie in Abbildung 5B dargestellt, und verschieben Sie das Signal, um den Abstand in die gleiche Richtung zu verdoppeln, in der es sich von der ursprünglichen Position bewegt hat. Verwenden Sie das Mikrometer auf der Scan-Stufe, um das Signal wieder in die ursprüngliche Position zu verschieben (-0,3 mm für 1,2 mm Polystyrol).
    8. Wiederholen Sie die Schritte 4.11.6–4.11.7, bis das Signal bei +10 und -10 gleich ist und die Spitze für beide Positionen an der ursprünglichen Position (-0,3 mm auf der optischen Achse) fokussiert ist.
12. Sobald die Nivellierung der A-Achse erreicht ist, ändern Sie den A-Achsenwert auf 0 und wiederholen Sie das gleiche Verfahren für die B-Achse. Beginnen Sie, indem Sie den Wert der B-Achse am Motorsteuerfenster von 0 auf den positivsten Wert (z. B. +10 mm) ändern. Verwenden Sie beim Nivellieren außerdem die Navellierungsschraube auf der B-Achse der Scanstufe, die in Abbildung 5Bdargestellt ist.
13. Sobald beide Achsen eingeebnet sind, geben Sie sowohl die A-Achse als auch die B-Achse auf 0 mm zurück. Schließen Sie das Motor control Window und überprüfen Sie, ob sich das Signal in seiner ursprünglichen Position befindet, falls es ein wenig verschoben wird.
14. Zeichnen Sie dieses Signal als Referenz auf.
    1. Wechseln Sie zum Fenster DAQ-Eigenschaften festlegen. Ändern Sie den Mittelwert auf 5, und behalten Sie alle anderen Parameter als Standard bei.
    2. Klicken Sie auf Neue Referenz. Der Mittelwertzähler oben rechts im Fenster zählt von 0 bis 20. Sobald der Zähler 20 erreicht hat, ändern Sie den Mittelwert auf 1, und klicken Sie auf OK. Das reflektierte Signal des Polystyrols wird als Referenz für später durchgeführte Scans gespeichert.
       HINWEIS: Wenn nur das THz-Bildgebungsverfahren durchgeführt werden muss, ist es am besten, die Schritte 4.3–4.14 durchzuführen, bevor sie das Tumorgewebe aus der DMEM-Lösung entfernen.
15. Montieren Sie den Tumor auf der Polystyrolplatte, die das Scan-Bühnenfenster abdeckt.
    1. Entfernen Sie das Bildgebungsfenster aus der Scanphase und bringen Sie es in den Gewebebehandlungsbereich. Platzieren Sie den Tumor auf einer Polystyrolplatte, wie in Abbildung 4Bdargestellt.
    2. Stellen Sie sicher, dass sich keine signifikanten Luftblasen zwischen der Platte und dem Tumor befinden. Wenn Luftblasen beobachtet werden, drücken Sie den Tumor mit einer Pinzette oder heben Sie den Tumor an und rollen Sie ihn vorsichtig auf das Polystyrol, bis die Luftspalten minimiert sind.
    3. Platzieren Sie absorptive Abstandshalter in regelmäßigen Abständen um die Testprobe, wie in Abbildung 4Bdargestellt. Legen Sie eine weitere Polystyrolplatte über den Tumor und drücken Sie vorsichtig, um die Tumoroberfläche so flach wie möglich zu machen. Verkleben Sie diese Polystyrol-Tumor-Polystyrol-Anordnung am Probenfenster.
16. Drehen Sie das Beispielfenster wie in Abbildung 4Cdargestellt, und machen Sie Fotos von dem Tumor, um seine Ausrichtung aufzuzeichnen. Bringen Sie das Probenfenster mit dem Tumor in die Scanphase zurück.
17. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bildparameter-Dialog, um das Fenster Bildaufnahmeparameter zu öffnen. Legen Sie die Werte von Axis1min, Axis1max, Axis2minund Axis2max fest, um die Position des Tumors im Bildgebungsfenster vollständig einzuschließen.
    HINWEIS: Standardmäßig ist Axis1 die A-Achse und Axis2 die B-Achse.
18. Stellen Sie Axis1step und Axis2step für den Bildscan auf 0,2 mm ein.
    ANMERKUNG: Wenn Sie den Axis1step und den Axis2step festlegen, werden die Schrittgrößen der Schrittmotoren während des Scanvorgangs auf 200 m in Schritten festgelegt. Die gesamte Scanzeit kann im Fenster Bildaufnahmeparameter geschätzt werden.
19. Klicken Sie auf die Registerkarte Messen im Hauptfenster und wählen Sie die Option Flyback 2D Scan aus. Geben Sie in dem angezeigten Fenster das Verzeichnis und den Dateinamen an, unter dem die Scandaten gespeichert werden sollen.

5. Nachbearbeitung des frischen Gewebes in Vorbereitung auf das histopathologische Verfahren

1. Entfernen Sie nach Abschluss des Scanvorgangs das Probenfenster, die Polystyrolplatten und die Probe aus dem THz-Kernsystem, und verschieben Sie sie in den bereichweise für gefährliche Abfälle. Entfernen Sie den Tumor von der Polystyrolplatte und legen Sie ihn auf ein flaches Stück Karton mit einer Größe, die mit der des Tumors vergleichbar ist. Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung des Tumors die gleiche ist wie auf dem Polystyrol, wobei das bildgebende Gesicht die Pappe berührt.
2. Tauchen Sie einen Wattestäbchen in roten Gewebefarbstoff und färben Sie die linke Seite des Tumors bis zu dem Punkt, an dem der Rand des Tumors die Pappe kontaktiert. In ähnlicher Weise färben Sie die rechte Seite des Tumors mit blauem Gewebefarbstoff. Färben Sie die freiliegende Oberfläche des Tumors mit einer Linie von gelbem Gewebefarbstoff, der den roten Fleck mit dem blauen Fleck verbindet, um die Rückseite der Probe zu bezeichnen, wie in Abbildung 7Adargestellt.
   HINWEIS: Um zu verhindern, dass die Tinte die Formalinlösung färbt, tragen Sie nur eine dünne Schicht auf das Gewebe auf. Dies kann erreicht werden, indem man den Wattestäbchen auf einer anderen Oberfläche vor der Färbung des Gewebes abstreift oder einen sauberen Wattestäbchen verwendet, um überschüssigen Farbstoff abzuwischen. Vermeiden Sie es, den Farbstoff mit der Haut oder Kleidung in Kontakt zu bringen. Dieser Tumor-Färbungsprozess wird als Referenz durchgeführt, um Informationen über die bildgebende Seite des Tumors und seine Ausrichtung an den Pathologen zu liefern.

Abbildung 7: Nachbearbeitung des Tumors nach THz-Bildgebung. (A) Tumor mit dem Gesicht nach unten auf Kartonhalter gelegt und mit Gewebemarkierung Farbstoff gefärbt. (B) Filterpapier über Tumor gelegt und verklebt, um den Kontakt aufrecht zu erhalten. (C) Gefärbter Tumor auf dem Karton fixiert, in 10% neutral gepufferte Formalinlösung getaucht und mit Parafilm versiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Lassen Sie die Tinte ca. 3–4 min trocknen. Schneiden Sie ein Stück Filterpapier mit den gleichen ungefähren Abmessungen wie die Pappe. Legen Sie es auf den Tumor und wickeln Sie ein Stück Klebeband vollständig um das Filterpapier und Karton, wie in Abbildung 7Bgezeigt. Das Band und das Filterpapier sollten den Tumor gegen die Pappe sichern, ohne nennenswerten Druck auszuüben.
4. Tauchen Sie das auf der Pappe angebrachte Gebegegewebe in 10% neutral gepufferte Formalinlösung ein und versiegeln Sie das Zentrifugenrohr mit einem Paraffinfilm, wie in Abbildung 7Cdargestellt. Legen Sie die Probennummer, das Datum, den Gewebetyp und die Tumornummer für die Probe auf dem Rohretikett fest. Senden Sie den Tumor an den Pathologen zur weiteren histopathologischen Verarbeitung.

6. Gefährliche Abfallentsorgung

1. Sammeln Sie alle Abfälle aus dem Gewebehandhabungstablett zusammen mit dem Biohazard-Beutel, mit dem das Tablett abgedeckt wird, und legen Sie ihn in einen neuen Biohazard-Beutel, wie in Abbildung 8dargestellt. Bringen Sie die Tasche in den ausgewiesenen biogefährlichen Abfallbereich im Gebäude und vereinbaren Sie einen Termin mit der Abteilung für Umweltgesundheit und -sicherheit (EH&S) für die Abfallabholung. Reinigen Sie die Gewebehandhabungswanne und die Umgebung auf dem Tisch mit 10% Bleichlösung und Ethanol.

Abbildung 8: Foto des biogefährlichen Abfallbeutels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Nehmen Sie den Flüssigkeitsprobenhalter mit den Abstandshaltern und Quarzfenstern, das Probefenster, auf dem der Tumor montiert war, Polystyrolplatten und Laborpinzette in den Waschbereich. Spülen Sie alle Materialien mit Wasser und dann 10% Bleichlösung, Wischen mit Papiertüchern nach Bedarf, um Gewebeablagerungen zu entfernen. Wieder mit Wasser abspülen, mit Alconoxlösung schrubben und gründlich ausspülen. Für Glas- und Kunststoffwaren in 70% Isopropylalkohol abspülen und zum Trocknen beiseite stellen.
   HINWEIS: Sobald sich der Tumor im Formalin befindet und der Probenraum sauber ist, kann die Datenverarbeitung gleichzeitig mit der Bildgebung oder einem späteren Zeitpunkt abgewickelt werden.

7. Datenverarbeitung zum Erstellen von THz-Bildern

1. Exportieren Sie die gespeicherten .tvl-Datendateien aus dem THz-System. Die aus dem System erhaltenen Rohdatendateien werden in Python geschrieben und am besten in Python gelesen, bevor sie als MATLAB-Datendateien gespeichert werden.
2. Um das THz-Bild des gescannten Frischgewebes zu konstruieren, konvertieren Sie die Rohzeit-Domänenreflexions-Bildgebungsdaten mithilfe von Fourier-Transformation in die dritte Dimension der Rohdatenmatrix (d. h. die Zeitdimension) in den Frequenzbereich. Nehmen Sie auch die Fourier-Transformation der Referenzdaten.
   HINWEIS: Ein typisches Frequenzbereichsspektrum sollte Daten im Bereich von 0,1 THz–4 THz liefern.
3. Normalisieren Sie die Probendaten mit den Referenzdaten und führen Sie die Leistungsspektren basierend auf der Integration der normalisierten Daten über den Frequenzbereich von f₁ = 0,5 THz bis f₂ = 1,0 THz mit der folgenden Gleichung¹⁹durch:
   
   HINWEIS: Hier ist _E-Probe die Frequenzbereichsreflexions-Bildgebungsdaten der Gewebeprobe und _E-Referenz ist der Frequenzbereich eines Einzelnenpunktreflexionsdatens des Referenzsignals.
4. Konstruieren Sie das zweidimensionale Bild, indem Sie die berechneten Leistungsspektrendaten an jedem Punkt in der Matrix zeichnen, die durch die A- und die B-Achse definiert werden. Dies wird als Leistungsspektren-THz-Bild bezeichnet.
   HINWEIS: Die Methode zum Abrufen eines tomographischen THz-Bildes wird stattdessen in den Schritten 7.5–7.7 beschrieben.
5. Für die Charakterisierung berechnen Sie die theoretische frequenzabhängige Reflexion für einen Bereich potenzieller Gewebeeigenschaften mit der folgenden Gleichung^18:
   
   ANMERKUNG: Hier_T,ij ist der komplexe Fresnel-Reflexionskoeffizient zwischen Region i und Region j;d_j die Dicke des Bereichs j; und j_j ist der Ausbreitungswinkel in Region j, der mit dem Einfallswinkel durch Snells Gesetz zusammenhängt. ist der komplexe Ausbreitungskoeffizient in Bereich j, wobei die Winkelfrequenz , c ist die Lichtgeschwindigkeit im Vakuum, n_j ist der reale Teil des Brechungsindex, und -_abs,j ist der Absorptionskoeffizient¹⁸. Region 1 ist Luft, Region 2 ist die Polystyrolplatte und Region 3 ist das Gewebe.
6. Berechnen Sie die Reflexion in Gleichung (2) für einen Bereich von benutzerdefinierten Brechungsindizes und Absorptionskoeffizienten für Region 3 (n₃ und_abs,3) und vergleichen Sie sie mit dem gemessenen Signal an jedem Punkt, um den kombinierten mittleren quadrierten Fehler für die Größe und Phase zu berechnen. α
   HINWEIS: Die Lösung für den Brechungsindex und den Absorptionskoeffizienten ist das Wertpaar, das den niedrigsten Fehler gibt.
7. Konstruieren Sie das tomographische THz-Bild aus dem extrahierten Brechungsindex und den Absorptionskoeffizientendaten (n₃ und_abs,3) an jedem Pixel. α Analysieren Sie die Tumorregionen, indem Sie mit dem vom Pathologen erhaltenen Pathologie-Diabild vergleichen. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 9dargestellt, mit Beispielen für die unzureichende Einhaltung des Protokolls in Abbildung 10 und Abbildung 11.

8. Extraktion elektrischer Eigenschaften des Gewebes mittels Transmissionsspektroskopiedaten

1. Gehen Sie im Hauptfenster der THz-Übertragungsspektroskopie-Messsoftware auf die Registerkarte Datei und klicken Sie auf die Option Export. Es öffnet sich ein Fenster, in dem der zu exportierende Datentyp und das Sample ausgewählt werden. Wählen Sie Die Option Transmittance und Transmittance Phase Datentypen für die Quarz- und Gewebeprobenmessungen.
2. Berechnen Sie die theoretische frequenzabhängige Übertragung für einen Bereich potenzieller Gewebeeigenschaften mit der folgenden Gleichung^15:
   
   HINWEIS: Hier ist das Verhältnis zwischen Fresnel-Übertragungskoeffizienten für die Proben- und Referenzeinstellungen; 1₁ bzw. ₃ sind die komplexen Ausbreitungskonstanten von Luft bzw. Gewebe; und d ist die Dicke des Gewebes. Die Ausbreitungskonstante ist im Allgemeinen definiert als . - ist der komplexe Brechungsindex, der als definiert ist, wobei n der reale Teil des Brechungsindexisten ist; c ist die Lichtgeschwindigkeit; ist die Winkelfrequenz; und ist der _{Absorptionskoeffizient} ¹⁵.
3. Berechnen Sie den kombinierten mittleren quadrierten Fehler zwischen der Größe und Phase der Übertragung in Gleichung (3) und den Messdaten aus dem System für einen Bereich von benutzerdefinierten n- und_abs-Werten. α
   HINWEIS: Die Lösung für den Brechungsindex und den Absorptionskoeffizienten ist das Wertpaar, das den niedrigsten Fehler gibt.
4. Zeichnen Sie die extrahierten Brechungsindex- und Absorptionskoeffizientendaten mit dem Frequenzbereich von 0,15 bis 3,5 THz. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 12dargestellt.

Ergebnisse

Die THz-Bildgebungsergebnisse^18, die nach dem oben genannten Protokoll der menschlichen Brustkrebstumor-#ND14139 von der Biobank erhalten wurden, sind in Abbildung 9dargestellt. Dem Pathologiebericht zufolge handelte es sich bei dem #ND14139 Tumor um ein i/II-infiltrierendes duktales Karzinom (IDC), das von einer 49-jährigen Frau über eine Operation im Linken Brustklumpenektomie-Verfahren erhalten wurde. Das Foto des Tumors ist in Abbildung 9A

Diskussion

Die effektive THz-Reflexionsbildgebung von frischem Gewebe hängt in erster Linie von zwei kritischen Aspekten ab: 1) der richtigen Berücksichtigung der Gewebehandhabung (Abschnitte 2 und 4.15); und 2) die Bühneneinrichtung (hauptsächlich Abschnitt 4.11). Eine unzureichende Trocknung des Gewebes kann zu einer erhöhten Reflexion und Unfähigkeit führen, Regionen aufgrund hoher Reflexionen von DMEM und anderen Flüssigkeiten zu visualisieren. In der Zwischenzeit erzeugt ein schlechter Gewebekontakt mit dem Bildgebungs...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% isopropyl alcohol	VWR	89108-162	Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water
Alconox powder detergent	VWR	21835-032	Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass
Bio Hazard Bags	Fisher Scientific	19-033-712	Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags
Cardboard holder	N/A	N/A	Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin
Centrifuge Tubes	VWR	10026-078	Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line
Cotton Swabs	Walmart	551398298	Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue
Ethyl Alcohol	VWR	71002-426	KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol
Eye protection goggles	VWR	89130-918	Kimberly-clark professional safety glasses
Face Mask	VWR	95041-774	DUKAL Corporation surgical masks
Filter paper	Sigma Aldrich	Z240087	Whatman grade 1 cellulose filters
Formalin solution	Sigma Aldrich	HT501128-4L	10% neutral buffered formalin
Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC))	National Disease Research Interchange (NDRI biobank	N/A	A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required
IRADECON Bleach solution	VWR	89234-816	Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution
KIMTECH SCIENCE wipes	VWR	21905-026	Kimberly-clark professional Kim wipes
Laboratory Coat	VWR	10141-342	This catalog number is for medium size coat
Laboratory tweezers/Forceps	VWR	82027-388	Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue
Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer)	TeraView, Ltd	N/A	1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows
Nitrile hand gloves	VWR	82026-426	This catalog number is for medium size gloves
Nitrogen cylinder	Airgas	NI UHP300	NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300
Paper towel	VWR	14222-321	11" x 8.78" Sheets, 1 Ply
Parafilm	VWR	52858-076	Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion.
Petri Dish	VWR	470210-568	VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom)
Polystyrene Plate	Home Depot	1S11143A	~ 10 cm x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet
ScanAcquire Software	TeraView, Ltd	N/A	System Software for THz reflection imaging measurements
Stainless steel low-profile blade (#4689)	VWR	25608-964	Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades
Stainless steel metal tray	Quick Medical	10F	Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays
Tissue Marking Dyes	Ted Pella, Inc	Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4	Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory
TPS Spectra 3000	TeraView, Ltd	N/A	THz imaging and spectroscopy system
TPS Spectra Software	TeraView, Ltd	N/A	System Software for THz transmission spectroscopy measurements