منصة مختبر على رقاقة لتحفيز العظام Mechanotransduction وتحليل النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام

Summary

هنا، نقدم بروتوكولات لتحليل إعادة عرض العظام داخل منصة المختبر على رقاقة. يمكن إقران جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد مع النظام الأساسي للحث على إحداث ميكانيكية العظام عن طريق تشويه المصفوفة الخلوية. ويمكن أيضا أن تستخدم منصة لتحديد العظام إعادة عرض النتائج الوظيفية من العظام والعظام (resorption / تشكيل).

Abstract

إعادة عرض العظام هي عملية منظمة بإحكام مطلوبة لنمو الهيكل العظمي والإصلاح بالإضافة إلى التكيف مع التغيرات في البيئة الميكانيكية. خلال هذه العملية, الخلايا العظمية الميشانوالحساسة تنظيم الاستجابات المتعارضة بين العظام تقويضي والعظام الابتنائية. لفهم أفضل لمسارات الإشارات المعقدة للغاية التي تنظم هذه العملية ، طور مختبرنا منصة أساسية للمختبر على رقاقة (LOC) لتحليل النتائج الوظيفية (تشكيل وارتشاف) لإعادة عرض العظام داخل نظام صغير الحجم. كما إعادة عرض العظام هي عملية طويلة التي تحدث على ترتيب أسابيع إلى أشهر، وضعنا بروتوكولات زراعة الخلايا على المدى الطويل داخل النظام. وتزرع الخلايا العظمية والعظام على ركائز النشاط الوظيفي داخل LOC والحفاظ عليها لمدة تصل إلى سبعة أسابيع. بعد ذلك ، تم تفكيك الرقائق للسماح بالقياس الكمي لتكوين العظام وارتشافها. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتصميم جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد يُزوج منصة LOC ويمكن استخدامه للحث على إحداث النخاع العظمي عن طريق تشويه المصفوفة الخلوية. لقد قمنا بتحسين بروتوكولات زراعة الخلايا لخلايا العظام، والعظام، والعظام داخل منصة LOC وعالجنا مخاوف العقم والسمية الخلوية. هنا، نقدم بروتوكولات لتصنيع وتعقيم LOC، وخلايا البذر على ركائز وظيفية، وحفز الحمل الميكانيكي، وتفكيك LOC لتحديد نتائج نقطة النهاية. ونحن نعتقد أن هذه التقنيات تضع الأساس لتطوير الجهاز الحقيقي على رقاقة لإعادة عرض العظام.

Introduction

العظام هو نسيج ديناميكي للغاية يتطلب تنسيقًا معقدًا بين أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة: الخلايا العظمية والعظام والعظام. التفاعلات متعددة الخلايا بين هذه الخلايا هي المسؤولة عن فقدان العظام التي تحدث أثناء الشلل والجمود على المدى الطويل وتشكيل العظام التي تحدث استجابة للنمو وممارسة الرياضة. الخلايا العظمية، نوع الخلية العظمية الأكثر وفرة، حساسة للغاية للمحفزات الميكانيكية المطبقة على العظام. التحفيز الميكانيكي يغير النشاط الأيضي للعظام ويؤدي إلى زيادة في جزيئات الإشارات الرئيسية^1،2. من خلال هذه العملية، والمعروفة باسم mechanotransduction، يمكن تنسيق الخلايا العظمية مباشرة أنشطة العظام (خلايا تشكيل العظام) والعظام (خلايا العظام resorbing). الحفاظ على التوازن العظام يتطلب تنظيما محكما بين تكوين العظام ومعدلات امتصاص العظام; ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الاضطرابات في هذه العملية إلى حالات المرض مثل هشاشة العظام أو هشاشة العظام.

تعقيد التفاعلات بين هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا يفسح المجال للتحقيق باستخدام تقنيات microfluidic والمختبر على رقاقة (LOC). وتحقيقا لهذه الغاية، وقد أنشأت مختبرنا مؤخرا دليلا على مفهوم منصة LOC لتحليل ارتشاف العظام وتشكيل (النتائج الوظيفية) في عملية إعادة عرض العظام. يمكن استخدام المنصة لدراسة التفاعلات الخلوية ، وبيئات التحميل المتغيرة ، وفحص المخدرات التحقيقية. في السنوات الأخيرة، تم تطوير أجهزة ميكروولينيك مختلفة للتحقيق في مسارات الإشارات الجزيئية التي تنظم إعادة عرض العظام. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الأنظمة تحدد إعادة عرض من خلال علامات غير مباشرة تدل على النشاط الوظيفي^{3،4،5،6،7}. ميزة نظامنا هو أنه يمكن استخدامه للقياس الكمي المباشر للنتائج الوظيفية. إعادة عرض العظام هي عملية طويلة الأجل. على هذا النحو ، يتطلب التحديد الكمي المباشر لارتشاف العظام وتشكيلها نظامًا للزراعة يمكن الحفاظ عليه لمدة لا تقل عن عدة أسابيع إلى أشهر^8،9،10،11. وهكذا، عند تطوير منصة LOC، أنشأنا بروتوكولات التبهي على المدى الطويل اللازمة لتشكيل وresorption والحفاظ على الخلايا داخل النظام لمدة تصل إلى سبعة أسابيع^11. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بدمج ركائز الاستزراع المناسب لكلا النوعين من الخلايا في المنصة. تم استزراع العظام مباشرة على العظام ، وكانت الخلايا العظمية ، والتي تعرف أنها منالبلاستيك ، مُستزرعة على أقراص البوليسترين. وعلاوة على ذلك، تناولنا القضايا المتعلقة بالعقم، والسمية الخلايا على المدى الطويل والتفكيك رقاقة لإعادة عرض تحليل^11،12.

ويمكن أيضا أن تستخدم منصة LOC للحث على mechanotransduction العظام من خلال تشوه مصفوفة. تم تطوير جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد ليقترن بـ LOC ويطبق جهازًا ثابتًا خارج المستوى لتمتد الخلايا^13. لاستيعاب هذا الحمل الميكانيكي ، تم زيادة عمق البئر داخل LOC. هذا الحجم الصغير، بسيطة جهاز تحميل الميكانيكية يمكن أن تنتج بسهولة من قبل مختبرات ذات خبرة هندسية محدودة، ونحن قد شارك سابقا رسومات من المكونات المطبوعة 3D^13. في العمل الحالي ، نبين بعض التقنيات الجديدة اللازمة للاستخدام الناجح للLOC . ونحن نعتقد أن شرح هذه التقنيات تستفيد من شكل البصرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد قناع رقاقة

ملاحظة: الخطوات 1.1 - 1.3 تحتاج فقط إلى تنفيذها مرة واحدة عند الاستلام الأولي لقناع الشريحة. أنها تضمن القناع لا ينحني أثناء الاستخدام. تم وصف تصميم الأقنعة الدقيقة في السابق^11،14. تم تصميم الأقنعة في المنزل وملفقة تجاريا باستخدام الاستريوغرافيا عالية الدقة(الشكل 1A).

1. تغطية السطح العلوي للقناع مع الأغطية البلاستيكية لحماية هذا السطح من لاصقة. تأمين قناع رقاقة إلى ورقة الاكريليك بنفس الحجم باستخدام لاصق رذاذ. المشبك القطع معا بين عشية وضحاها للسماح لللاصقة لعلاج تماما. بعد أن يجف لاصق، إزالة الأغطية البلاستيكية من الجزء العلوي من القناع.
2. إرفاق الجزء السفلي من ورقة الاكريليك إلى مربع التسوية المطبوعة 3D(الشكل التكميلي 1، الملفات التكميلية 1-4)باستخدام الشريط على الوجهين. اضغط بحزم لضمان وجود رابطة ضيقة.
3. ختم أي فتحات صغيرة بالقرب من الجدار للانفصال من مربع التسوية مع تسرب للماء. السماح للتسرب لعلاج لمدة 24 ساعة.
4. تنظيف سطح القناع مع الإيثانول 70٪ (EtOH). ضع مربع التسوية مع قناع الشريحة المطلوب في الفرن. استخدم منقلة رقمية لضمان مستوى الجزء العلوي من القناع. ضبط مسامير التسوية إذا لزم الأمر.

2. تصنيع PDMS

ملاحظة: يتم استخدام تصميم رقاقة ضحلة البئر (1 مم) للنشاط الوظيفي (التشكيل وإعادة الامتصاص) ، ويستخدم تصميم رقاقة عميقة البئر (10 مم) لدراسات التحميل الميكانيكية. يتم تشكيل الجزء السفلي من البئر العميق عن طريق إرفاق غشاء PDMS رقيقة منفصلة(الشكل 1B).

1. طبقة الغطاء (الطبقة 1)
   1. الجمع بين 63 غرام من PDMS prepolymer و 6.3 غرام من عامل علاج (نسبة 10:1) في كوب من البلاستيك. مزيج شامل مع ملعقة الخلية المتاح وديغا في فراغ desiccator لمدة 30 دقيقة.
   2. صب الخليط ببطء في مربع التسوية المعدة. دع PDMS الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم خبز في 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
   3. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مختبر مدبب وإزالة ورقة البوليمر من مربع التسوية.
   4. اقطع الأغطية الفردية إلى حجم (70 مم × 34 مم) باستخدام مشرط وقالب مطبوع ثلاثي الأبعاد.
   5. ثقوب الوصول لكمة من خلال كل غطاء مع لكمة خزعة (قطر 1 مم).
   6. سطح تنظيف الأغطية مع شريط التعبئة والتغليف.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأغطية على الفور، قم بتغليف كل منها في شريط التعبئة والتغليف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. كذلك وطبقة القناة الدقيقة (طبقة 2)
   1. الجمع بين PDMS قبل البوليمر وكيل علاج (نسبة 10:1) في كوب من البلاستيك. تصميم بئر الضحلة يتطلب 43 غرام من قبل البوليمر و 4.3 غرام من عامل علاج، وتصميم عميق جيدا يتطلب 227 غرام من قبل البوليمر و 22.7 غرام من عامل علاج. تخلط البوليمر بقوة وديغا لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يفترض هذا بعد قناع 152.4 مم × 152.4 مم.
   2. صب الخليط ببطء على قناع مناسب قبل التسوية. دع PDMS الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم خبز في 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
   3. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مختبر مدبب وقشر بعناية البوليمر بعيدا عن القناع. استخدم قالب مشرط و3D مطبوع لقطع رقائق الفردية.
      ملاحظة: بالنسبة لدراسات التحميل، من المهم أن تكون أبعاد الشريحة (70 × 34 مم) دقيقة وأن البئر يقع في وسط الشريحة.
   4. سطح تنظيف PDMS مع شريط التعبئة والتغليف.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الرقائق على الفور، قم بتغليف كل رقاقة في شريط التعبئة والتغليف وتخزينها في RT.
3. غشاء PDMS رقيقة (طبقة 3)
   ملاحظة: يتم استخدام هذه الطبقة فقط لتصميم بئر عميق.
   1. إضافة 12.7 غرام من PDMS prepolymer و 1.3 غرام من عامل علاج (نسبة 10:1) إلى كوب من البلاستيك. تخلط بقوة وdegas لمدة 30 دقيقة.
   2. صب البوليمر ببطء في مربع التسوية المعدة وكشط تماما كوب من البلاستيك لإزالة أكبر قدر ممكن PDMS.
   3. استخدام ملعقة الخلية لنشر PDMS على سطح كامل.
      ملاحظة: إذا لم يتم نشر البوليمر يدوياً، سوف يكون التوتر السطحي كافياً لمنع البوليمر من تشكيل ورقة موحدة.
   4. دع PDMS الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم خبز في 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
   5. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مدببة وإزالة ورقة PDMS بعناية من مربع التسوية. قطع الأغشية الفردية التي تتطابق مع أبعاد الطبقة 2.
   6. قياس سمك الغشاء في وسط الغشاء باستخدام الفرجار. تخلص من أي أغشية خارج السماكة المطلوبة (0.5 مم ± 0.1 مم).
   7. الأغشية نظيفة بعناية مع شريط التعبئة والتغليف ومكان على قطعة من فيلم البارافين.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأغشية على الفور، قم بتغطية الجزء العلوي من الغشاء بشريط التعبئة والتغليف وتخزينها في RT.

3. ركائز النشاط الوظيفي

ملاحظة: يجب إرفاق أقراص البوليسترين ورقائق العظام إلى الجزء السفلي من الآبار التي سيتم استخدامها لثقافات العظام والعظام، على التوالي.

1. أقراص البوليسترين(الشكل 1C)
   1. وضع شريط اخفاء على الجانب الخلفي من ثقافة الأنسجة المعالجة غطاء البوليسترين. قطع الأقراص الدائرية من الغطاء باستخدام شحذ الفلين بورر (قطر 5.4 ملم). غمر الأقراص في 70٪ EtOH وترك بين عشية وضحاها.
   2. فرك بلطف السطح العلوي من القرص مع قضيب القطن يميل غارقة في 70٪ EtOH. تأكد من تنظيف الحافة الخارجية للقرص تمامًا.
   3. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، عقد القرص وإزالة إخفاء الشريط الدعم. ضع القرص الجانب المعالجة أسفل وتنظيف الجانب الخلفي مع قضيب القطن يميل.
   4. تراجع نهاية خشبية من قضيب القطن يميل في خليط degassed من PDMS uncured ووضع كمية صغيرة من البوليمر على الجزء السفلي من البئر المطلوب.
      ملاحظة: يمكن تخزين PDMS غير المعبّر المتبقية عند -20 درجة مئوية.
   5. ضع قرص البوليسترين، تعامل الجانب لأعلى، في البئر واضغط بلطف لأسفل على القرص مع مسحة القطن. تأكد من عدم اتصال PDMS غير المعمرة بالجانب المعالج من القرص.
      ملاحظة: إذا كان PDMS لا تأتي في اتصال مع السطح المعالج من القرص، إزالة القرص من البئر وتكرار الخطوات 3.1.4 و 3.1.5 مع قرص جديد.
   6. دع الشريحة تُجلس على سطح مستوي لمدة 30 دقيقة ثم تخبز على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 4 سه.
2. رقائق العظام
   1. استخدم ملقط لوضع رقاقة عظمية (قطرها 6 مم، سمكها 0.4 مم) في الجزء السفلي من طبق 100 مم. عقد رقاقة ثابتة مع ملقط وحفر بلطف 'X' على الجزء الخلفي من رقاقة مع مشرط.
      ملاحظة: أثناء عملية التصوير، يتم استخدام "X" للتمييز بين الجزء الخلفي من الرقاقة والسطح الذي تم بذر الخلايا عليه.
   2. استخدام نهاية خشبية من قضيب القطن يميل لإضافة كمية صغيرة من PDMS uncured إلى الجزء السفلي من البئر المطلوب. ضع رقاقة العظام، ملحوظ الجانب إلى أسفل، في البئر واستخدام قضيب القطن يميل للضغط على رقاقة أسفل.
   3. دع الشريحة تُجلس على سطح مستوي لمدة 30 دقيقة ثم تخبز على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 4 سه.

4. رقاقة التجمع والتعقيم

1. قم بتنشيط أسطح الطبقة 1 والطبقة 2 باستخدام منظف بلازما لمدة 30 ق باستخدام إعداد طاقة التردد الراديوي المتوسط (RF) (أي ما يعادل 10.2 واط تقريبًا).
2. محاذاة ثقوب الوصول في طبقة 1 مع القنوات الدقيقة في طبقة 2 واضغط بحزم على طبقتين معا.
3. لتصميم بئر عميق، كرر الخطوة 4.1 مع طبقة 2 وطبقة 3. أثناء معالجة البلازما، استخدم الشريط على الوجهين لإرفاق فيلم البارافين من الطبقة 3 إلى سطح مستو.
4. استخدام مشرط لتقليم قبالة المواد الزائدة من غشاء PDMS. قشر بعناية بعيدا ورقة من فيلم البارافين من الجزء السفلي من رقاقة
5. خبز رقاقة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لزيادة قوة السندات بين طبقات PDMS.
6. إدراج نصائح الاستغناء الزاوية (18 قياس، 0.5 في، 90 درجة) في ثقوب الوصول في الغطاء. تأمين نصائح الاستغناء عن الغطاء مع اثنين من جزء الايبوكسي. استخدام تلميح micropipette لتطبيق الايبوكسي حول كل نصيحة الاستغناء.
7. بعد الايبوكسي قد شفي تماما، سطح تنظيف رقاقة مع 70٪ EtOH ووضعها في خزانة السلامة البيولوجية. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
8. قم بتوصيل حقنة 5 مل بنصائح الاستغناء عن أنابيب السيليكون المعقمة (معرف 1/32' ، ~ 10 سم في الطول) وملء الشريحة بأكملها مع 70٪ EtOH لمدة 30 s على الأقل. لتصميم بئر الضحلة، وإدارة جميع السوائل مع مضخة حقنة تعيين إلى معدل تدفق 4 مل / ساعة. لتصميم عميق جيدا، وإدارة جميع السوائل عن طريق الاستغناء ببطء الحقنة باليد.
9. إزالة EtOH من رقاقة وتعقيم رقاقة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها.
10. غسل رقاقة 3 مرات مع dH₂O. ملء رقاقة مع dH₂O، وإزالة أنابيب من نصائح الاستغناء واحتضان لمدة لا تقل عن 48 ساعة في 37 درجة مئوية.

5. تجميع جهاز التحميل الميكانيكي

ملاحظة: تم وصف عمليات التصميم والتصنيع لجهاز التحميل الميكانيكي المطبوع ثلاثي الأبعاد(الشكل 2A-C)مسبقًا وتم توفير جميع ملفات التصميم للمكونات المطبوعة مسبقًا¹³.

1. أوتوكلاف جميع مكونات جهاز التحميل لمدة 30 دقيقة في 121 درجة مئوية.
   ملاحظة: لتجنب تزييف المكونات المطبوعة، قم بتغليف كل قطعة بشكل فردي في احباط ووضعها على سطح مستو صلب أثناء عملية الأوتوكلاف. يمكن لف الأجهزة المعدنية معا. أكمل جميع الخطوات اللاحقة داخل خزانة السلامة البيولوجية.
2. وضع ربيع ضغط حول رمح من الصفائح وإدراج الصفائح في حفرة مركزية على الجزء السفلي من القاعدة(الشكل 2D).
3. إرفاق كتلة الطلب إلى الجزء السفلي من القاعدة باستخدام أربعة مسامير التنصت الذاتي.
4. وضع الربيع ضغط الثاني حول المسمار المركزي. أدخل المسمار في ثقب سداسي الشكل في الجزء السفلي من الطلب والمسمار الجمعية في ثقب مترابطة في وسط كتلة الطلب.
5. المسمار أربع مواجهات بين الذكور والإناث في الجزء السفلي من القاعدة.
6. قم بإزالة الركود من الجهاز عن طريق تحويل اتجاه عقارب الساعة إلى أن يكون الجزء العلوي من اللوحة أسفل الجزء العلوي من القاعدة. ثم بدوره ببطء في اتجاه عقارب الساعة حتى أعلى لوحة هو مستوى مع الجزء العلوي من القاعدة.

6- التجريب

ملاحظة: بروتوكولات لتجارب النشاط الوظيفي قدمت سابقا^11،12.

1. دراسات التحميل(الشكل 3)
   1. بعد الخطوة 4.9، استخدم حقنة 5 مل لإزالة dH₂O من رقاقة بئر عميق. معطف الجزء السفلي من البئر مع 200 ميكرولتر من 0.15 ملغ / مل نوع الأول الكولاجين (CTI) في 0.02 M حمض الخليك لمدة 1 ساعة.
   2. شطف رقاقة ثلاث مرات مع دلبيكو الفوسفات المخزنة مؤقتا مع الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS ++).
   3. ضع رقاقة في حامل الشريحة والبذور مع MLO-Y4 العظام بكثافة 2 × 10⁴ خلايا / مل في الحد الأدنى من متوسط ألفا الأساسية (MEMα) تكملها 5٪ مصل العجل، 5٪ مصل البقر الجنين، و 1٪ البنسلين / العقديات.
   4. إزالة الأنابيب من نصائح الاستغناء ووضع رقاقة في طبق ثقافة عميقة جيدا (150 ملم × 25 ملم). الخلايا المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 72 ساعة.
   5. إرفاق أنابيب معقمة إلى نصائح الاستغناء واستخدام حقنة 5 مل لإزالة متوسط الثقافة المستهلكة من رقاقة. الاستغناء ببطء في الثقافة الجديدة المتوسطة لإعادة ملء رقاقة.
   6. ضع حامل الشريحة في الداخل المستطيل في الجزء العلوي من قاعدة جهاز التحميل. تغذية أنابيب من خلال فتحات تقع على غطاء جهاز التحميل وتأمين الغطاء إلى القاعدة مع أربعة مسامير رئيس عموم والمكسرات عرافة.
      ملاحظة: للتأكد من أن الغطاء لا يزال مستوى، تأمين أولاً اثنين من مسامير التي تقع قطرياً من بعضها البعض قبل تأمين مسامير المتبقية اثنين.
   7. تطبيق تحميل على الخلايا عن طريق تحويل الطلب في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم الوصول إلى إزاحة الصفائح المطلوبة.
      ملاحظة: تم تصميم الجهاز بحيث دوران واحد من الطلب يعادل إزاحة لوحة من 1 مم. حقل سلالة ولدت على الجزء العلوي من غشاء PDMS كان سابقا على غرار وظيفة من الإزاحة الصفائح باستخدام تحليل العناصر المحدودة (FEA)¹³.
   8. ضع جهاز التحميل في مربع تلميح P1000 ميكروبيزيت فارغ. احتضان الخلايا مع الحمل المطبق لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: فترة التحميل الزمنية المستخدمة هنا بمثابة مثال. يمكن استخدام أوقات التحميل البديلة.
   9. بعد الحضانة، قم بإزالة الحمل من الخلايا عن طريق تحويل اتجاه عقارب الساعة إلى أن يعود الصفائح إلى موضع البداية الأصلي. قم بإزالة الغطاء من الجهاز ووضع حامل الشريحة في لوحة الثقافة العميقة. احتضان الخلايا لفترة استرداد تحميل آخر 90 دقيقة.
      ملاحظة: مرة أخرى، فترة الاسترداد الزمنية المستخدمة هنا بمثابة مثال. يمكن استخدام أوقات الاسترداد البديلة. للدراسات طويلة الأجل، تغذية الخلايا كل 72 ساعة.
   10. استخدم حقنة 5 مل لإزالة الوسط المكيف من الشريحة.
       ملاحظة: يمكن حفظ هذا الوسط وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
   11. إزالة رقاقة من حامل رقاقة واستخدام ملعقة مدبب لكسر السندات بين غطاء PDMS وطبقة جيدا.
       ملاحظة: يمكن الآن تنفيذ المقالات الخلوية بعد أي بروتوكول تم إنشاؤه للوحة ثقافة الخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يمكن استخدام التكوين الضحل ة البئر لتحليل النشاط الوظيفي للعظام والعظام. تكوين العظام عن طريق العظام وارتشاف عبر العظام يتطلب أوقات التبهي على أمر عدة أسابيع إلى أشهر. تم قياس تكوين العظام من MC3T3-E1 قبل العظم باستخدام الأليسارين الأحمر وفون كوسا البقع^11،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تصف هذه المقالة الأسس لتلفيق منصة LOC لإعادة عرض العظام لاستزراع الخلايا العظمية والعظام والعظام. عن طريق تغيير عمق وحجم البئر داخل الشريحة ، تم تطوير تكوينات متعددة لتحفيز العظام مع الحمل الميكانيكي وتحديد النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام(الشكل 1B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic sheet	Optix	--	3.175 mm thick
Angled dispensing tips	Jensen Global	JG18-0.5X-90	Remove plastic connector prior to use
Biopsy punch	Robbins Instruments	RBP-10	1 mm diameter
Bone wafers	Boneslices.com	0.4 mm thick	Bovine cortical bone
Bovine calf serum	Hyclone	SH30072
Calipers	Global Industrial	T9F534164
Cell spatula	TPP	99010
Chip mask	ProtoLabs	Custom-designed	Print material: Accura SL 5530
Cork borer	Fisher Scientific	07-865-10B
Cotton tipped applicator	Puritan	806-WCL
Culture dish (100 mm)	Corning	430591	Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm)	Corning	430597	Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape	3M Company	Scotch 237
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910
Forceps	Fisher Scientific	22-327379
Leveling box	Custom-made	--	3D printed
Masking tape	3M Company	Scoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblasts	ATCC	CRL-2593	Subclone 4
Mechanical loading device	Custom-made	--	3D printed
Minimum essential alpha medium	Gibco	12571-063
MLO-Y4 osteocytes	--	--	Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tape	Duck Brand	--	Standard packaging tape
Paraffin film	Bemis Parafilm	PM999
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	p4333
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kit	Dow Corning	Sylgard 184
Polystyrene coverslips	Nunc Thermanox	174942	Sterile, tissue culture treated
Oven	Quincy Lab	12-180
RAW264.7 preosteoclasts	ATCC	TIB-71
Scalpel	BD Medical	372611
Silicone tubing	Saint-Gobain Tygon	ABW00001	ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks software	Dassault Systèmes	--	Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesive	Loctite	2323879	Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml)	BD Medical	309646	Sterile
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-2213	Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatula	Fisher Scientific	21-401-10
Two-part expoxy	Loctite	1395391	5 minute quick set
Type I collagen	Corning	354236	Rat tail collagen
Vacuum desiccator	Bel-Art	F42010-0000
Waterproof sealant	Gorilla	8090001	100% silicone sealant