用于刺激骨质复变和分析骨骼重塑功能结果的实验室A芯片平台

摘要

在这里，我们提出了用于在芯片实验平台内分析骨骼重塑的协议。3D 打印机械装载装置可与平台配对，通过变形细胞基质诱导骨质异质异体转导。该平台还可用于量化骨细胞和成骨细胞（再吸收/形成）的骨骼重塑功能结果。

摘要

骨骼重塑是骨骼生长和修复以及适应机械环境变化所需的严格监管过程。在这个过程中，对心肌敏感性骨细胞调节骨细胞和合成代谢性骨细胞之间的对立反应。为了更好地了解调节这一过程的高度复杂的信号通路，我们的实验室开发了一个基础的片上实验室（LOC）平台，用于分析小型系统中骨骼重塑的功能结果（形成和再吸收）。由于骨骼重塑是一个漫长的过程，发生在数周到数月，我们开发了系统内的长期细胞培养协议。成骨细胞和成骨细胞生长在LOC内的功能活性基质上，并维持长达七周。之后，芯片被拆解，以便定量骨骼形成和吸收。此外，我们还设计了一种3D打印机械装载装置，与LOC平台配对，并可用于通过变形细胞基质诱导骨质异质异化。我们在LOC平台内优化了骨细胞、成骨细胞和成骨细胞的细胞培养方案，并解决了不育和细胞毒性问题。在这里，我们介绍了用于制造和消毒LOC、在功能基板上播种细胞、诱导机械负载和拆卸LOC以量化端点结果的协议。我们认为，这些技术为开发真正的芯片上器官进行骨骼重塑奠定了基础。

引言

骨骼是一种高度动态的组织，需要三种主要细胞类型之间的复杂协调:骨细胞、成骨细胞和成骨细胞。这些细胞之间的多细胞相互作用是导致瘫痪和长期不动期间发生的骨质流失，以及因生长和运动而发生的骨骼形成的原因。骨细胞是最丰富的骨细胞类型，对应用于骨骼的机械刺激非常敏感。机械刺激改变骨质代谢活性，导致关键信号分子^11、22的增加。通过这个过程，称为二次转导，骨细胞可以直接协调成骨细胞（骨形成细胞）和成骨细胞（骨重组细胞）的活动。保持骨平衡需要骨骼形成和骨吸收率之间的严格调节;然而，这个过程的中断可能导致疾病状态，如骨质疏松症或骨质病。

这三种细胞类型之间相互作用的复杂性非常适合利用微流体和片上实验室 （LOC） 技术进行研究。为此，我们的实验室最近建立了LOC平台的概念证明，用于分析骨骼重塑过程中的骨再吸收和形成（功能结果）。该平台可用于研究细胞相互作用、改变的加载环境以及调查药物筛选。近年来，为研究调节骨重塑的分子信号通路开发了各种微流体装置;然而，这些系统中有许多通过间接标记量化改造，这些标记指示功能活动^{33、4、5、6、7。4,5,6,7}我们的系统的一个优点是，它可用于直接量化功能结果。骨骼重塑是一个长期的过程。因此，直接定量骨吸收和形成需要一个培养系统，可以维持至少几个星期到月^{88，9，10，11。9,10,11}因此，在开发LOC平台时，我们建立了形成和吸收所需的长期培养协议，并在系统内保持了长达7周的¹¹周细胞。此外，我们还将两种细胞类型的适当培养基板纳入平台;骨细胞直接在骨骼上培养，骨细胞，已知是塑料粘附物，在聚苯乙烯盘上培养。此外，我们讨论了有关不育、长期细胞毒性和芯片拆卸的问题，以便进行改造分析^{11，12。11,}

LOC平台还可用于通过矩阵变形诱导骨质异质转导。开发了一个3D打印机械装载装置，与LOC配对，并应用静态平面外散回来拉伸细胞^13。为了适应这种机械负载，LOC 内的井深度增加。这种小规模、简单的机械装载装置可以很容易地由具有有限工程经验的实验室生产，我们之前曾共享过3D打印组件¹³的图纸。在目前的工作中，我们展示了成功使用LOC所需的一些新技术。 具体来说，我们演示了芯片制造、功能基板的细胞播种、机械加载和芯片拆卸，用于重塑定量。我们认为，这些技术的解释得益于视觉格式。

研究方案

1. 芯片面罩制备

注:步骤 1.1 - 1.3 仅在初始收到芯片掩码时执行一次。它们确保面罩在使用过程中不会低头。微流体面罩的设计先前曾描述^{过11、14。,14}口罩是内部设计的，是使用高分辨率立体光刻设计的（图1A）。

1. 用塑料板盖住面罩的顶部表面，以保护该表面免受粘合。使用喷雾粘合剂将芯片面罩固定到同等大小的丙烯酸片上。将碎片夹在一起过夜，使胶粘剂完全固化。胶粘剂干燥后，从面罩顶部取下塑料板。
2. 使用双面胶带将丙烯酸片的底部连接到 3D 打印的平平盒（补充图 1，补充文件 1-4）。用力按压以确保紧密粘结。
3. 用防水密封剂密封平装箱可拆卸壁附近的任何小开口。让密封剂固化 24 小时。
4. 用 70% 乙醇 （EtOH） 清洁面罩表面。将带有所需芯片遮罩的平平盒放入烤箱中。使用数字持久度器确保蒙版的顶部是水平的。如有必要，调整调平螺钉。

2. PDMS 制造

注:浅井（1毫米）芯片设计用于功能活动（形成和再吸附）测定，深井（10毫米）芯片设计用于机械装载研究。深井的底部是通过附加一个单独的薄PDMS膜形成的（图1B）。

1. 盖层（第 1 层）
   1. 将 63 克 PDMS 预聚物和 6.3 克固化剂（10:1 比例）混合在塑料杯中。在真空干燥器中彻底混合一次性细胞铲和脱气30分钟。
   2. 将混合物慢慢倒入准备好的平位箱中。让 PDMS 坐 30 分钟，然后在 45°C 下烘烤 18 小时。
   3. 用锥形实验室铲松 PDMS 的边缘，从调平盒中取出聚合物片。
   4. 使用手术刀和 3D 打印模板将单个盖子切割到大小（70 毫米 x 34 毫米）。
   5. 用活检冲孔（直径 1 mm）在每个盖上打孔。
   6. 使用包装胶带表面清洁盖子。
      注:如果盖子没有立即使用，则将每个盖子包装在包装胶带中，并在室温 （RT） 下存储。
2. 井和微通道层（第 2 层）
   1. 将 PDMS 预聚合物和固化剂（10:1 比例）组合在塑料杯中。浅井设计需要43克预聚物和4.3克固化剂，深井设计需要227克预聚合物和22.7克固化剂。大力混合聚合物，脱气30分钟。
      注: 这假定面罩尺寸为 152.4 毫米 x 152.4 毫米。
   2. 将混合物缓慢倒在适当的预水平面罩上。让 PDMS 坐 30 分钟，然后在 45°C 下烘烤 18 小时。
   3. 用锥形实验室铲松 PDMS 的边缘，小心地将聚合物从面罩上剥离。使用手术刀和 3D 打印模板切出单个芯片。
      注:对于装载研究，芯片尺寸（70 x 34 mm）必须精确，并且井位于芯片中心。
   4. 表面用包装胶带清洁 PDMS。
      注:如果芯片没有立即使用，将每个芯片包装在包装胶带中，并储存在RT上。
3. 薄 PDMS 膜（第 3 层）
   注:此层仅用于深井设计。
   1. 将12.7克PDMS预聚物和1.3克固化剂（10:1比例）添加到塑料杯中。大力混合并脱气30分钟。
   2. 将聚合物缓慢倒入准备好的平整箱中，彻底刮起塑料杯，以去除尽可能多的PDMS。
   3. 使用细胞铲将 PDMS 扩散到整个表面。
      注:如果聚合物没有手动扩散，表面张力将足以防止聚合物形成均匀的板材。
   4. 让 PDMS 坐 30 分钟，然后在 45°C 下烘烤 18 小时。
   5. 用锥形铲子松开 PDMS 的边缘，然后小心地从平平盒中取出 PDMS 表。切割与第 2 层尺寸相匹配的单个膜。
   6. 使用卡钳测量膜中心的膜厚度。丢弃超出所需厚度（0.5 毫米 × 0.1 毫米）以外的任何膜。
   7. 用包装胶带小心清洁膜，放在一块石蜡薄膜上。
      注:如果膜没有立即使用，用包装胶带盖住膜顶部并储存在RT上。

3. 功能活性基板

注:聚苯乙烯盘和骨片必须分别附着在用于骨质和骨质培养的井底。

1. 聚苯乙烯盘 （图 1C）
   1. 将遮蔽胶带放在组织培养处理聚苯乙烯盖玻片的背面。使用锐化的软木孔（直径为 5.4 mm）从盖玻片上切割圆形圆盘。将光盘浸入 70% EtOH 中，并过夜。
   2. 用浸在 70% EtOH 中的棉面涂片轻轻擦洗圆盘的顶部表面。确保彻底清洁光盘的外边缘。
   3. 使用两对钳子，按住光盘并拆下遮蔽胶带后背。将光盘处理侧向下放置，用棉面倾斜施用器清洁背面。
   4. 将棉尖施用器的木端浸入未固化 PDMS 的脱气混合物中，并将少量聚合物放在所需井的底部。
      注:未固化的PDMS可储存在-20°C。
   5. 将处理后向上的聚苯乙烯盘放入井中，用棉签轻轻压下圆盘。确保没有未固化的 PDMS 与光盘的经过处理的一侧接触。
      注:如果 PDMS 确实与光盘的经过处理表面接触，请从井中取出光盘，然后使用新光盘重复步骤 3.1.4 和 3.1.5。
   6. 让芯片在水平表面上坐30分钟，然后在65°C下烘烤4小时。
2. 骨片
   1. 使用钳子将骨片（直径 6 毫米，0.4 毫米厚）放在 100 mm 盘的底部。用钳子稳稳地握住晶圆，用手术刀轻轻蚀刻晶圆背面的"X"。
      注:在成像过程中，"X"用于区分晶圆背面和细胞播种的表面。
   2. 使用棉倾涂器的木端将少量未固化的 PDMS 添加到所需井的底部。将骨片（标记侧向下）放入井中，并使用棉面倾斜施用器将晶圆向下压下。
   3. 让芯片在水平表面上坐30分钟，然后在65°C下烘烤4小时。

4. 芯片组装和灭菌

1. 使用中射频 （RF） 功率设置（相当于大约 10.2 W）的等离子滤清器激活第 1 层和第 2 层的表面，30 s。
2. 将第 1 层中的检修孔与第 2 层中的微通道对齐，并将两层牢固地压在一起。
3. 对于深井设计，使用第 2 层和第 3 层重复步骤 4.1。在等离子体处理过程中，使用双面胶带将第 3 层的石蜡膜连接到平坦的表面。
4. 使用手术刀从 PDMS 膜中修剪多余的材料。小心地从芯片底部剥去石蜡薄膜片
5. 在 65°C 下烘烤芯片 10 分钟，以提高 PDMS 层之间的粘结强度。
6. 将倾斜的点胶尖端（18 仪表、0.5 英寸、90°）插入盖子的检修孔中。用两部分环氧树脂将点胶尖端固定到盖子上。使用微移液笔尖在每个点胶尖端周围涂抹环氧树脂。
7. 环氧树脂完全固化后，表面用 70% EtOH 清洁芯片，并放入生物安全柜中。在生物安全柜内执行所有后续步骤。
8. 将 5 mL 注射器连接到带无菌硅胶管的点胶尖端（1/32'ID，10 厘米长），并将整个芯片填充 70% EtOH，至少 30 s。对于浅井设计，使用注射器泵管理所有液体，流量设置为 4 mL/h。对于深井设计，通过缓慢用手分配注射器来管理所有液体。
9. 从芯片中取出 EtOH，用紫外线在一夜之间对芯片进行消毒。
10. 用 dH₂O 将芯片清洗 3 次，用 dH₂O 填充芯片，从分配尖端取出管，并在 37°C 下孵育至少 48 小时。

5. 机械装载装置组件

注:3D打印机械装载装置（图2A-C）的设计与制造过程已过描述，打印部件的所有设计文件此前已提供¹³个。

1. 在 121 °C 下，对装载装置的所有部件进行 30 分钟的高压灭菌。
   注:为避免打印部件变形，请将每件单独包裹在箔上，并在高压过程中放置在坚硬的平面上。金属硬件可以包装在一起。在生物安全柜内完成所有后续步骤。
2. 在板轴周围放置压缩弹簧，然后将板子插入底座底部的中心孔（图 2D）。
3. 使用四个自攻螺钉将表盘块连接到底座底部。
4. 在中央螺钉周围放置第二个压缩弹簧。将螺钉插入表盘底部的六角形孔中，然后将组件拧入表盘块中心的螺纹孔中。
5. 将四个雄-女性支架拧入底座底部。
6. 逆时针转动表盘，直到表盘顶部低于底座顶部，从而消除设备的松弛。然后缓慢地顺时针转动表盘，直到表盘顶部与底座顶部平一平。

6. 实验

注:以前提供功能活动实验的协议^{11，12。11,}

1. 加载研究 （图 3）
   1. 按照步骤 4.9，使用 5 mL 注射器从深井芯片中取出 dH₂O。用200μL 0.15mg/mL I型胶原蛋白（CTI）在0.02M醋酸中涂覆1小时。
   2. 用 Dulbecco 的磷酸缓冲盐水用钙和镁 （DPBS®） 冲洗芯片三次。
   3. 将芯片放入芯片持有人和种子与MLO-Y4骨质细胞密度为2 x 10⁴细胞/mL在最低必需的α介质（MEM®），辅以5%小牛血清，5%胎儿牛血清和1%青霉素/链霉素。
   4. 从分配尖端取下油管，并将芯片放入深井培养盘中（150 mm x 25 mm）。在37°C和5%CO2下孵育₂细胞，72小时。
   5. 将无菌管连接到分配技巧，并使用 5 mL 注射器从芯片上去除废培养介质。在新鲜培养介质中缓慢分配以重新填充芯片。
   6. 将芯片支架放入装载设备底座顶部的矩形内部。通过装载装置盖上的插槽将油管送至底座，并配有四个盘头螺钉和六角螺母。
      注: 为确保盖子保持水平，首先固定两个螺钉，这些螺钉彼此对角地固定，然后再固定剩余的两个螺钉。
   7. 通过顺时针转动表盘，将负载施加到电池上，直到达到所需的盘位移。
      注: 设备的设计使表盘的一次旋转相当于 1 mm 的盘位移。在PDMS膜顶部生成的应变场以前被建模为使用有限元分析^（FEA）13的板位移函数。
   8. 将装载装置放入一个空的 P1000 微移液笔尖盒中。用施加的负载孵育细胞 15 分钟。
      注: 此处使用的加载时间段用作示例。可以使用替代加载时间。
   9. 孵育后，逆时针转动表盘，从电池中取出负载，直到板子返回到原始起始位置。从设备上取下盖子，并将芯片支架放入深孔培养板中。在加载后恢复期为 90 分钟孵化细胞。
      注: 同样，此处使用的恢复时间段是示例。可以使用替代恢复时间。对于长期研究，每72小时喂食一次细胞。
   10. 使用 5 mL 注射器从芯片上取出调节介质。
       注:此介质可以保存并存储在 -80 °C。
   11. 从芯片支架上取下芯片，并使用锥形铲子打破 PDMS 盖和井层之间的粘结。
       注:细胞检测现在可以按照为细胞培养板建立的任何协议进行。

结果

浅井配置可用于分析成骨和成骨细胞的功能活性。通过成骨细胞和通过成骨细胞的再吸收形成骨骼需要数周到数月的培养时间。从MC3T3-E1预骨质形成用阿利扎林红和冯科萨污渍^11，15,15量化。在第49天，沾染了阿利扎林红的平均表面积为10.7%=2.2%（平均值= 均值的标准误差^）11。与冯·科萨染色的平均表面积为6.4%~1.6...

讨论

本文介绍了为培养骨细胞、骨细胞和骨细胞构建骨骼改造LOC平台奠定基础。通过改变芯片内井的深度和大小，开发了多种配置，以机械载荷刺激骨质和量化骨骼重塑的功能结果（图1B）。

在芯片组装过程中，优化等离子氧化协议对于消除泄漏问题至关重要。我们发现，将 PDMS 表面暴露在使用中射频功率设置（步骤 4.1）生成的 30 s 氧等离子体...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic sheet	Optix	--	3.175 mm thick
Angled dispensing tips	Jensen Global	JG18-0.5X-90	Remove plastic connector prior to use
Biopsy punch	Robbins Instruments	RBP-10	1 mm diameter
Bone wafers	Boneslices.com	0.4 mm thick	Bovine cortical bone
Bovine calf serum	Hyclone	SH30072
Calipers	Global Industrial	T9F534164
Cell spatula	TPP	99010
Chip mask	ProtoLabs	Custom-designed	Print material: Accura SL 5530
Cork borer	Fisher Scientific	07-865-10B
Cotton tipped applicator	Puritan	806-WCL
Culture dish (100 mm)	Corning	430591	Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm)	Corning	430597	Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape	3M Company	Scotch 237
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910
Forceps	Fisher Scientific	22-327379
Leveling box	Custom-made	--	3D printed
Masking tape	3M Company	Scoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblasts	ATCC	CRL-2593	Subclone 4
Mechanical loading device	Custom-made	--	3D printed
Minimum essential alpha medium	Gibco	12571-063
MLO-Y4 osteocytes	--	--	Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tape	Duck Brand	--	Standard packaging tape
Paraffin film	Bemis Parafilm	PM999
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	p4333
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kit	Dow Corning	Sylgard 184
Polystyrene coverslips	Nunc Thermanox	174942	Sterile, tissue culture treated
Oven	Quincy Lab	12-180
RAW264.7 preosteoclasts	ATCC	TIB-71
Scalpel	BD Medical	372611
Silicone tubing	Saint-Gobain Tygon	ABW00001	ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks software	Dassault Systèmes	--	Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesive	Loctite	2323879	Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml)	BD Medical	309646	Sterile
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-2213	Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatula	Fisher Scientific	21-401-10
Two-part expoxy	Loctite	1395391	5 minute quick set
Type I collagen	Corning	354236	Rat tail collagen
Vacuum desiccator	Bel-Art	F42010-0000
Waterproof sealant	Gorilla	8090001	100% silicone sealant