Платформа Lab-On-A-Chip для стимулирования остеоцитной механотрансдукции и анализа функциональных результатов ремоделирования костей

Резюме

Здесь мы представляем протоколы для анализа костной ремоделирования в лаборатории на чипе платформы. 3D печатных механических погрузочных устройств может быть в паре с платформой, чтобы вызвать остеоцит механотрансдукции путем деформации клеточной матрицы. Платформа также может быть использована для количественной оценки костной ремоделирования функциональных исходов остеокластов и остеобластов (резорбция/образование).

Аннотация

Реконструкция костей является жестко регулируемым процессом, который необходим для роста и ремонта скелета, а также адаптации к изменениям в механической среде. В ходе этого процесса механочувствительные остеоциты регулируют противоположные реакции между катаболическими остеокластами и анаболическими остеобластами. Чтобы лучше понять очень сложные сигнальные пути, которые регулируют этот процесс, наша лаборатория разработала фундаментальную платформу лаборатории на чипе (LOC) для анализа функциональных результатов (формирование и резорбция) ремоделирования костей в рамках мелкомасштабной системы. Поскольку ремоделирование костей является длительным процессом, который происходит на порядок от нескольких недель до нескольких месяцев, мы разработали долгосрочные протоколы культивирования клеток в системе. Остеобласты и остеокласты выращивались на субстратах функциональной активности в пределах LOC и поддерживались до семи недель. После этого, чипы были разобраны, чтобы обеспечить количественную оценку формирования костей и резорбции. Кроме того, мы разработали 3D-печатное механическое устройство погрузки, которое сочетается с платформой LOC и может быть использовано для индуцирования остеоцитов механотрансдукции путем деформации клеточной матрицы. Мы оптимизировали протоколы культивирования клеток для остеоцитов, остеобластов и остеокластов на платформе LOC и рассмотрели проблемы стерильности и цитотоксичности. Здесь мы представляем протоколы для изготовления и стерилизации LOC, посева ячеек на функциональных субстратов, вызывая механическую нагрузку, и разборки LOC для количественной оценки конечных результатов. Мы считаем, что эти методы закладывают основу для разработки истинного органа-на-чип для костной ремоделирования.

Введение

Кость является высокодинамической тканью, которая требует сложной координации между тремя основными типами клеток: остеоцитами, остеобластами и остеокластастами. Многоклеточные взаимодействия между этими клетками отвечают за потерю костной массы, которая происходит во время паралича и долгосрочной неподвижности, а также за формирование костей, которое происходит в ответ на рост и физические упражнения. Остеоциты, наиболее распространенный тип костных клеток, очень чувствительны к механическим раздражителям, применяемым к кости. Механическая стимуляция изменяет метаболическую активность остеоцитов и приводит к увеличению ключевых сигнальных молекул^1,,2. Благодаря этому процессу, известному как механотрансдукция, остеоциты могут непосредственно координировать деятельность остеобластов (костяных образующих клеток) и остеокластов (клетки костного resorbing). Поддержание костного гомеостаза требует жесткой регуляции между формированием костей и скоростью резорбции костей; однако, сбои в этом процессе могут привести к заболеваниям, таким как остеопороз или остеопетроз.

Сложность взаимодействия между этими тремя типами клеток хорошо поддается исследованию с использованием микрофлюидных и лабораторных технологий (LOC). С этой целью наша лаборатория недавно установила доказательство концепции платформы LOC для анализа резорбции костей и формирования (функциональные результаты) в процессе ремоделирования костей. Платформа может быть использована для изучения клеточных взаимодействий, измененных сред погрузки и скрининга наркотиков. В последние годы были разработаны различные микрофлюидные устройства для исследования молекулярных сигнальных путей, которые регулируют ремоделирование костей; однако, многие из этих систем количественно ремоделирования через косвенные маркеры, которые свидетельствуют о функциональной деятельности^3,4,,5,,6,7. Преимущество нашей системы в том, что она может быть использована для прямой количественной оценки функциональных результатов. Реконструкция костей является долгосрочным процессом. Таким образом, прямая количественная оценка резорбции и образования костей требует культивирования системы, которая может поддерживаться в течение как минимум нескольких недель до^{месяцев8,9,,10,11}. Таким образом, при разработке платформы LOC, мы установили долгосрочные протоколы культивирования, необходимые для формирования и резорбции и поддерживали клетки в системе до семи недель¹¹. Кроме того, мы включили соответствующие культивирование субстратов для обоих типов клеток в платформу; остеокласты культивировались непосредственно на кости, а остеобласты, которые, как известно, являются пластиковыми приверженцами, культивировались на полистироловых дисках. Далее мы рассмотрели вопросы, касающиеся бесплодия, долгосрочной цитотоксичности и разборки чипов для ремоделирования анализа^11,12.

Платформа LOC также может быть использована для индуцирования остеоцитов механотрансдукции через матричную деформацию. 3D печатных механических погрузочных устройств был разработан в паре с LOC и применить статические из плоскости distention растянуть клетки¹³. Для учета этой механической нагрузки была увеличена глубина скважины в пределах ЛОК. Это небольшое, простое механическое устройство погрузки может быть легко произведено лабораториями с ограниченным инженерным опытом, и мы ранее делились чертежами 3D печатных компонентов^13. В текущей работе мы демонстрируем некоторые из новых методов, необходимых для успешного использования LOC. В частности, мы демонстрируем изготовление чипов, посев клеток на функциональных субстратах, механическую загрузку и разборку чипов для ремоделирования количественной оценки. Мы считаем, что объяснение этих методов выгоду от визуального формата.

протокол

1. Подготовка маски чипа

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1 - 1.3 только должны быть выполнены один раз после первоначального получения маски чипа. Они гарантируют, что маска не кланяется во время использования. Конструкция микрофлюидных масок ранее была^{описана 11,,14}. Маски были разработаны в доме и коммерчески изготовлены с использованием стереолитографии высокого разрешения(рисунок 1A).

1. Обложка верхней поверхности маски с пластиковой пленкой, чтобы защитить эту поверхность от клея. Закрепите маску чипа на акриловом листе одинакового размера с помощью спрея. Зажим части вместе на ночь, чтобы клей полностью вылечить. После того, как клей высохнет, снимите пластиковую пленку с верхней части маски.
2. Прикрепите нижнюю часть акрилового листа к 3D печатной выравнивающей коробке(Дополнительная цифра 1, Дополнительные файлы 1-4) с помощью двусторонней ленты. Нажмите твердо, чтобы обеспечить тесную связь.
3. Печать любых небольших отверстий возле съемной стенки выравнивания окна с водонепроницаемым герметиком. Разрешить герметик вылечить в течение 24 ч.
4. Очистите поверхность маски с помощью 70% этанола (EtOH). Поместите выравнивающую коробку с нужной маской чипа в духовку. Используйте цифровой протрактор, чтобы обеспечить уровень верхней части маски. При необходимости отрегулируйте выравнивающие винты.

2. Изготовление PDMS

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения исследований функциональной активности (формирования и резорбции) используется мелководной (1 мм) конструкция чипа, а для механических погрузочных исследований используется глубоко внушивная (10 мм) конструкция чипа. Дно глубокой скважины формируется путем крепления отдельной тонкой мембраны PDMS(рисунок 1B).

1. Слой lid (слой 1)
   1. Смешайте 63 г преполимера PDMS и 6,3 г лечащий агент (коэффициент 10:1) в пластиковой чашке. Тщательно перемешайте с одноразовым клеточным шпателем и дегазом в вакуумном ошикаторе в течение 30 минут.
   2. Медленно налейте смесь в подготовленную выравнивающую коробку. Пусть PDMS сидеть в течение 30 минут, а затем выпекать при температуре 45 градусов по Цельсию в течение 18 ч.
   3. Онажай края PDMS с конической лабораторной шпателем и удалите полимерный лист из выравнивающей коробки.
   4. Вырезать отдельные крышки до размера (70 мм х 34 мм) с помощью скальпеля и 3D печатных шаблонов.
   5. Пробить отверстия доступа через каждую крышку с биопсии удар (1 мм в диаметре).
   6. Поверхность очистить крышки с упаковочной лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если крышки не используются немедленно, оберните каждый в упаковочную ленту и хранить при комнатной температуре (RT).
2. Ну и слой микроканала (слой 2)
   1. Смешайте преполимер PDMS и лечащий агент (коэффициент 10:1) в пластиковом стаканчике. Мелкой хорошо дизайн требует 43 г преполимера и 4,3 г лечебного агента, и глубокой конструкции скважины требует 227 г преполимера и 22,7 г лечебного агента. Смешайте полимер энергично и дегазы в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это предполагает размер маски 152,4 мм х 152,4 мм.
   2. Медленно залить смесью над соответствующей предварительно выровненные маски. Пусть PDMS сидеть в течение 30 минут, а затем выпекать при температуре 45 градусов по Цельсию в течение 18 ч.
   3. Онащайте края PDMS конической лабораторной шпателем и тщательно снимите полимер от маски. Используйте скальпель и 3D печатный шаблон, чтобы вырезать отдельные фишки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для погрузки исследования важно, чтобы размеры чипа (70 х 34 мм) являются точными и что скважина находится в центре чипа.
   4. Поверхность очистить PDMS с упаковочной лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если чипы не используются немедленно, оберните каждый чип в упаковочную ленту и храните на RT.
3. Тонкая мембрана PDMS (слой 3)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот слой используется только для глубокого хорошего дизайна.
   1. Добавьте 12,7 г преполимера PDMS и 1,3 г лечащий агент (коэффициент 10:1) в пластиковый стаканчик. Смешайте энергично и дега в течение 30 минут.
   2. Медленно залить полимером в подготовленную коробку выравнивания и тщательно соскребать пластиковый стаканчик, чтобы удалить как можно больше PDMS, насколько это возможно.
   3. Используйте клеточный шпатель для распространения PDMS по всей поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если полимер не распространяется вручную, поверхностного натяжения будет достаточно, чтобы предотвратить полимер от формирования единого листа.
   4. Пусть PDMS сидеть в течение 30 минут, а затем выпекать при температуре 45 градусов по Цельсию в течение 18 ч.
   5. Онажайте края PDMS с помощью конической шпателя и аккуратно снимите лист PDMS с выравнивающей коробки. Вырезать отдельные мембраны, которые соответствуют размеры слоя 2.
   6. Измерьте толщину мембраны в центре мембраны с помощью калиперов. Откажитесь от любых мембран, которые находятся за пределами желаемой толщины (0,5 мм и 0,1 мм).
   7. Тщательно очистить мембраны с упаковочной лентой и поместить на кусок парафина пленки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мембраны не используются немедленно, накройте верхнюю часть мембраны упаковочной лентой и храните на RT.

3. Функциональная деятельность субстратов

ПРИМЕЧАНИЕ: Полистирол диски и костные пластины должны быть прикреплены к нижней части скважин, которые будут использоваться для остеобластных и остеокластских культур, соответственно.

1. Полистирол диски(Рисунок 1C)
   1. Поместите липкую ленту на задней стороне ткани культуры обработаны полистирола coverslip. Вырежьте круглые диски из крышки с помощью заточенного пробкового бора (диаметром 5,4 мм). Погрузите диски в 70% EtOH и оставьте на ночь.
   2. Аккуратно скраб верхней поверхности диска с хлопком наконечником аппликатор пропитанной в 70% EtOH. Убедитесь, что внешний край диска тщательно очищен.
   3. Используя две пары щипцы, держите диск и удалите липкую ленту поддержки. Поместите диск обработанной стороны вниз и очистить заднюю сторону с хлопка наконечником аппликатора.
   4. Опустите деревянный конец хлопка наконечником аппликатора в дегазтированную смесь неизлечимых PDMS и поместите небольшое количество полимера на дно желаемого колодца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся неизлечимые PDMS могут храниться при -20 градусах Цельсия.
   5. Поместите полистирол диск, обработанные вверх, в колодец и осторожно нажмите на диск с ватным тампоном. Убедитесь, что неизлечимый PDMS не соприкасается с обработанной стороной диска.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если PDMS соприкасается с обработанной поверхностью диска, удалите диск из скважины и повторите шаги 3.1.4 и 3.1.5 с новым диском.
   6. Пусть чип сидеть на ровной поверхности в течение 30 минут, а затем выпекать при 65 градусах по Цельсию в течение 4 ч.
2. Костные
   1. Используйте щипцы, чтобы поместить костную пластину (6 мм в диаметре, толщина 0,4 мм) на дно 100-мм тарелки. Держите устойчивый с щипками и осторожно etch 'X' на задней части пластины скальпелем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе визуализации,'X' используется для различения задней части пластины и поверхности, на которой были посеяны клетки.
   2. Используйте деревянный конец хлопка наконечником аппликатора, чтобы добавить небольшое количество неизлечимых PDMS на дно желаемого хорошо. Поместите костную пластину, отмеченную стороной вниз, в колодец и используйте хлопок наконечником аппликатор аппликатор нажать пластины вниз.
   3. Пусть чип сидеть на ровной поверхности в течение 30 минут, а затем выпекать при 65 градусах по Цельсию в течение 4 ч.

4. Сборка и стерилизация чипов

1. Активируйте поверхности слоя 1 и слоя 2 с плазменным очистителем на 30 с с с помощью средней радиочастотной (РЧ) мощности (эквивалентно примерно 10,2 Вт).
2. Выровняйте отверстия доступа в слое 1 с микроканалами в слое 2 и твердо нажмите два слоя вместе.
3. Для глубокой конструкции, повторите шаг 4.1 с слоем 2 и слоем 3. Во время плазменной обработки используйте двусторонню ленту, чтобы прикрепить парафина пленки слоя 3 к плоской поверхности.
4. Используйте скальпель, чтобы обрезать избыток материала из мембраны PDMS. Тщательно снимите лист парафина пленки со дна чипа
5. Выпекать чип при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы увеличить прочность связи между слоями PDMS.
6. Вставьте угловые советы дозирования (18 Gauge, 0.5 in, 90 ") в отверстия доступа в крышке. Закрепите распределительный совет к крышке с двумя частью эпоксидной смолы. Используйте наконечник micropipette для нанесения эпоксидной смолы вокруг каждого дозирования наконечника.
7. После того, как эпоксидная кислота полностью вылечилась, поверхность очистите чип 70% EtOH и поместите в шкаф биобезопасности. Выполните все последующие шаги в шкафу биобезопасности.
8. Подключите 5 мл шприца к распределительным наконечникам со стерильными силиконовыми трубками (1/32' ID, 10 см в длину) и заполните весь чип 70% EtOH не менее 30 с. Для мелкой конструкции, управлять всеми жидкостями со шприцем насос установлен на скорость потока 4 мл / ч. Для глубокой конструкции, управлять всеми жидкостями, медленно распределяя шприц вручную.
9. Удалите EtOH из чипа и стерилизовать чип с ультрафиолетовым светом на ночь.
10. Вымойте чип 3 раза с dH₂O. Заполните чип с dH₂O, удалить трубки из дозирования советы и инкубировать, по крайней мере 48 ч при 37 градусов по Цельсию.

5. Сборка механического погрузочного устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: Процессы проектирования и изготовления для 3D-печатного механического погрузочного устройства(рисунок 2A-C) были ранее описаны, и все файлы дизайна для печатных компонентов были ранее предоставлены¹³.

1. Автоклав все компоненты погрузочного устройства на 30 мин при 121 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать деформации печатных компонентов, оберните каждый кусок индивидуально в фольгу и место на твердой плоской поверхности во время процесса autoclaving. Металлическое оборудование можно завернуть вместе. Выполните все последующие шаги в шкафу биобезопасности.
2. Поместите источник сжатия вокруг вала пластины и вставьте пластину в центральное отверстие на дне основания(рисунок 2D).
3. Прикрепите блок циферблата к нижней части основания, используя четыре самонажающихся винта.
4. Поместите второй источник сжатия вокруг центрального винта. Вставьте винт в шестиугольной форме отверстие в нижней части циферблата и винт сборки в резьбовой отверстие в центре блока циферблата.
5. Винт четыре мужчины и женщины противостояние в нижней части базы.
6. Удалите слабину с устройства, повернув циферблат против часовой стрелки до тех пор, пока верхняя часть пластины не будет ниже верхней части основания. Затем медленно поверните циферблат по часовой стрелке, пока верхняя часть пластины не будет равен верхней части основания.

6. Эксперименты

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы для экспериментов функциональной деятельности ранее были предоставлены^11,12.

1. Погрузочные исследования(рисунок 3)
   1. Следуя шагу 4.9, используйте 5 мл шприца для удаления dH₂O из глубокого колодца чипа. Пальто нижней части скважины с 200 мг/мл типа I коллагена (CTI) в 0,02 М уксусной кислоты в течение 1 ч.
   2. Промыть чип три раза с фосфат-буфером сольников Dulbecco с кальцием и магнием (DPBS).
   3. Поместите чип в держатель чипа и семена с остеоцитами MLO-Y4 при плотности 2 х 10⁴ клетки/мл в минимальной существенной альфа-среде (МЭМЗ) дополнены 5% сыворотки икры, 5% сыворотки крупного рогатого скота плода и 1% пенициллина/стрептомицина.
   4. Снимите трубку с наконечников дозирования и поместите чип в глубоко внушаемую культурную тарелку (150 мм х 25 мм). Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ на 72 ч.
   5. Прикрепите стерильные трубки к распределительным наконечникам и используйте шприц 5 мЛ для удаления отработанного средства культуры из чипа. Медленно распределяйте в свежей среде культуры для пополнения чипа.
   6. Поместите держатель чипа в прямоугольную вставку в верхней части базы погрузочного устройства. Кормите трубки через слоты, расположенные на крышке погрузочного устройства, и закрепите крышку к основанию четырьмя винтами и гайками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что крышка остается на уровне, сначала закрепите два винта, которые расположены по диагонали друг от друга, прежде чем закрепить оставшиеся два винта.
   7. Нанесите нагрузку на клетки, повернув циферблат по часовой стрелке до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое смещение пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство спроектировано таким образом, что одно вращение циферблата приравнивается к смещению пластины 1 мм. Поле деформации, генерируемое в верхней части мембраны PDMS, ранее моделировалось как функция смещения пластинса с использованием анализа конечного элемента (FEA)^13.
   8. Поместите погрузочное устройство в пустую коробку наконечника микропайпета P1000. Инкубировать клетки с прикладной нагрузкой в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера можно служит используемый здесь период загрузки. Можно использовать альтернативные сроки загрузки.
   9. После инкубации удалите нагрузку из клеток, повернув циферблат против часовой стрелки до тех пор, пока пластина не вернется в исходное исходное положение. Снимите крышку с устройства и поместите держатель чипа в глубоко вполне культурную пластину. Инкубировать клетки в течение 90-минутного периода восстановления послегрузо-загрузки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, период восстановления, используемый здесь, служит примером. Можно использовать альтернативные времена восстановления. Для долгосрочных исследований, кормклетки каждые 72 ч.
   10. Используйте 5 мл шприца для удаления кондиционированной среды из чипа.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда может быть сохранена и сохранена при -80 градусов по Цельсию.
   11. Удалите чип с держателя чипа и используйте конические шпатель, чтобы разорвать связь между крышкой PDMS и хорошо слоя.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые анализы теперь могут быть выполнены после любого протокола, установленного для пластины клеточной культуры.

Результаты

Конфигурация мелкой скважины может быть использована для анализа функциональной активности остеобластов и остеокластов. Формирование костей через остеобласты и резорбцию через остеокласты требует культивирования раз на порядок от нескольких недель до месяцев. Фор...

Обсуждение

В этой статье описаны основы для изготовления кости ремоделирования LOC платформы для культивирования остеоцитов, остеокластов и остеобластов. Изменяя глубину и размер скважины в чипе, были разработаны несколько конфигураций для стимулирования остеоцитов с механической нагрузкой и к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic sheet	Optix	--	3.175 mm thick
Angled dispensing tips	Jensen Global	JG18-0.5X-90	Remove plastic connector prior to use
Biopsy punch	Robbins Instruments	RBP-10	1 mm diameter
Bone wafers	Boneslices.com	0.4 mm thick	Bovine cortical bone
Bovine calf serum	Hyclone	SH30072
Calipers	Global Industrial	T9F534164
Cell spatula	TPP	99010
Chip mask	ProtoLabs	Custom-designed	Print material: Accura SL 5530
Cork borer	Fisher Scientific	07-865-10B
Cotton tipped applicator	Puritan	806-WCL
Culture dish (100 mm)	Corning	430591	Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm)	Corning	430597	Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape	3M Company	Scotch 237
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910
Forceps	Fisher Scientific	22-327379
Leveling box	Custom-made	--	3D printed
Masking tape	3M Company	Scoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblasts	ATCC	CRL-2593	Subclone 4
Mechanical loading device	Custom-made	--	3D printed
Minimum essential alpha medium	Gibco	12571-063
MLO-Y4 osteocytes	--	--	Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tape	Duck Brand	--	Standard packaging tape
Paraffin film	Bemis Parafilm	PM999
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	p4333
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kit	Dow Corning	Sylgard 184
Polystyrene coverslips	Nunc Thermanox	174942	Sterile, tissue culture treated
Oven	Quincy Lab	12-180
RAW264.7 preosteoclasts	ATCC	TIB-71
Scalpel	BD Medical	372611
Silicone tubing	Saint-Gobain Tygon	ABW00001	ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks software	Dassault Systèmes	--	Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesive	Loctite	2323879	Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml)	BD Medical	309646	Sterile
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-2213	Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatula	Fisher Scientific	21-401-10
Two-part expoxy	Loctite	1395391	5 minute quick set
Type I collagen	Corning	354236	Rat tail collagen
Vacuum desiccator	Bel-Art	F42010-0000
Waterproof sealant	Gorilla	8090001	100% silicone sealant