JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول 1) عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية من عضلة الساق الفأر البالغة وكذلك 2) تنقية وتوصيف الإكسوسومات باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي جنبا إلى جنب مع تدرجات كثافة السكروز تليها تحليلات اللطخة الغربية.

Abstract

الإكسوسومات هي حويصلات صغيرة خارج الخلية تفرزها جميع الخلايا تقريبا وتفرز في جميع السوائل الحيوية. تم تطوير العديد من الطرق لعزل هذه الحويصلات ، بما في ذلك الطرد المركزي الفائق والترشيح الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. ومع ذلك ، ليست كلها مناسبة لتنقية وتوصيف exosome على نطاق واسع. يوضح هنا بروتوكول لإنشاء مزارع الخلايا الليفية الأولية المعزولة من عضلات الهيكل العظمي للفأر البالغ ، يليه تنقية وتوصيف الإكسوسومات من وسائط زراعة هذه الخلايا. تعتمد الطريقة على استخدام خطوات الطرد المركزي المتسلسلة متبوعة بتدرجات كثافة السكروز. ثم يتم التحقق من نقاء المستحضرات الخارجية من خلال تحليلات اللطخة الغربية باستخدام بطارية من العلامات الكنسية (مثل Alix و CD9 و CD81). يصف البروتوكول كيفية عزل وتركيز الإكسوسومات النشطة بيولوجيا للمجهر الإلكتروني ، وقياس الطيف الكتلي ، وتجارب الامتصاص للدراسات الوظيفية. يمكن بسهولة توسيع نطاقه أو تقليله وتكييفه لعزل الإكسوسوم من أنواع الخلايا والأنسجة والسوائل البيولوجية المختلفة.

Introduction

Exosomes هي حويصلات خارج الخلية غير متجانسة يتراوح حجمها من 30-150 نانومتر. يتم تأسيسها لاعبين رئيسيين في العمليات الفسيولوجية والمرضية ، بالنظر إلى توزيعها في كل مكان في الأنسجة والأعضاء 1,2. تحمل الإكسوسومات شحنة معقدة من البروتينات والدهون وأنواع الحمض النووي وأنواع الحمض النووي الريبي ، والتي تختلف وفقا لنوع الخلايا التي اشتقت منها1،2،3. يتم إثراء الإكسوسومات في البروتينات التي لها وظائف مختلفة (أي أن التتراسبانين ، بما في ذلك CD9 و CD63) هي المسؤولة عن أحداث الاندماج. على سبيل المثال ، تشارك بروتينات الصدمة الحرارية HSP70 و HSP90 في ربط المستضد وعرضه. بالإضافة إلى ذلك ، يشارك Alex و Tsg101 والأسطول في التكوين الحيوي للإكسوسوم وإطلاقه ويستخدم على نطاق واسع كعلامات لهذه الحويصلاتالنانوية 2،3،4.

تحتوي الإكسوسومات أيضا على مجموعة متنوعة من الحمض النووي الريبي (مثل الحمض النووي الريبي الميكروي ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي) التي يمكن نقلها إلى الخلايا المتلقية ، حيث تؤثر على إشارات المصب3. نظرا لكونه محاطا بغشاء وحدة واحدة ، فإن النشاط الحيوي الخارجي لا يعتمد فقط على شحنة البروتينات والأحماض النووية ، ولكن أيضا على المكونات الدهنية للغشاء المحدد1. يتم إثراء الأغشية الخارجية بالفوسفاتيديل سيرين وحمض الفوسفاتيديك والكوليسترول والسفينغوميلين وحمض الأراكيدونيك والأحماض الدهنية الأخرى ، وكلها يمكن أن تؤثر على استقرار الإكسوسوم وطوبولوجيا الغشاء 2,3. نتيجة لترتيب الشحن والدهون ، تبدأ الإكسوسومات مسارات الإشارات في الخلايا المستقبلة وتشارك في الحفاظ على فسيولوجيا الأنسجة الطبيعية1،2،4،5. في ظل ظروف مرضية معينة (مثل التنكس العصبي والتليف والسرطان) ، فقد ثبت أنها تحفز وتنشر المحفزات المرضية4،6،7،8،9،10،11.

نظرا لقدرتها على نشر الإشارات إلى المواقع المجاورة أو البعيدة ، أصبحت exosomes مؤشرات حيوية قيمة لتشخيص أو تشخيص حالات المرض. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام exosomes تجريبيا كمركبات للمركبات العلاجية 2,12. إن التطبيق المحتمل لهذه الحويصلات النانوية في العيادة يجعل طريقة العزل ذات أهمية متزايدة من أجل تحقيق أقصى قدر من الغلة والنقاء والتكاثر. تم تطوير وتنفيذ تقنيات مختلفة لعزل الإكسوسومات. بشكل عام ، يمكن عزل الإكسوسومات من وسائط زراعة الخلايا المكيفة أو سوائل الجسم عن طريق الطرد المركزي التفاضلي ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، والتقاط المناعة (باستخدام المجموعات المتاحة تجاريا). كل نهج له مزايا وعيوب فريدة تمت مناقشتها سابقا1،2،13،14.

يركز البروتوكول المبين على 1) عزل وزراعة الخلايا الليفية الأولية من عضلة الساق الفأر البالغة و 2) تنقية وتوصيف الإكسوسومات التي تطلقها هذه الخلايا في وسط الثقافة. لا يوجد حاليا بروتوكول راسخ لعزل الإكسوسومات من الخلايا الليفية الأولية للدراسات الوظيفية. لا تفرز الخلايا الليفية الأولية كميات كبيرة من الإكسوسومات ، مما يجعل عملية العزل والتنقية صعبة. يصف هذا البروتوكول تنقية كميات كبيرة من الإكسوسومات النقية من أحجام كبيرة من الثقافة مع الحفاظ على سلامتها المورفولوجية ونشاطها الوظيفي. تم استخدام الإكسوسومات المنقاة التي تم الحصول عليها من وسط مكيف بنجاح في تجارب الامتصاص في المختبر للحث على مسارات إشارات محددة في الخلايا المتلقية. كما تم استخدامها للتحليلات البروتينية المقارنة للشحنات الخارجية من عينات بيولوجية متعددة4.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات في الفئران وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال وإرشادات المعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد الحلول والوسائط

  1. تحضير محلول الهضم عن طريق خلط 15.4 مل من PBS مع 2.5 مل من 20 مجم / مل كولاجيناز P (5 مجم / مل تركيز نهائي) ، 2 مل من 11 وحدة / مل ديسباز II (1.2 وحدة / مل تركيز نهائي) ، و 100 ميكرولتر من 1.0 M CaCl2 (تركيز نهائي 5 mM).
  2. تحضير 500 مل من وسط الخلايا الليفية الأولية (DMEM كاملة) عن طريق خلط 440 مل من DMEM مع 50 مل من FBS (10٪) ، 5.0 مل من القلم / البكتيريا (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل ، على التوالي) و 5.0 مل من مكمل الجلوتامين (2 مللي مول). قم بتصفية وتعقيم الوسط باستخدام مرشح فراغ بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.
  3. قم بإعداد مصل خال من الإكسوسوم عن طريق الطرد المركزي الفائق ل FBS طوال الليل في أنابيب البولي بروبلين سعة 38.5 مل عند 100000 × جم عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
  4. تحضير 500 مل من الوسط الخالي من الإكسوسوم عن طريق خلط 440 مل من DMEM مع 50 مل من المصل الخالي من الإكسوسوم (10٪) ، 5 مل من القلم / البكتيريا (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل) ، و 5 مل من مكمل الجلوتامين (2 ملليمول). قم بتصفية وتعقيم الوسط باستخدام مرشح فراغ بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.
  5. تحضير 0.5 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) عن طريق إذابة 6.057 g من قاعدة Tris في 90 mL من dH 2 O وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. اضبط مستوى الصوت على 100 مل باستخدام dH2O.
  6. تحضير محلول 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) / 1 mM Mg (Ac) 2 (محلول عمل السكروز) عن طريق خلط 97.9 مل من dH 2 O مع 2 مل من 0.5 M Tris-HCl (درجة الحموضة = 7.4) و 100 ميكرولتر من 1 M Mg (Ac)2. أضف مثبطات الأنزيم البروتيني إلى المحلول قبل الاستخدام مباشرة واحتفظ بالمحلول على الجليد.
  7. تحضير محاليل تدرج كثافة السكروز على الجليد وفقا للجدول 1. هذه المحاليل كافية لإعداد أنبوبين متدرجين للسكروز.
  8. تحضير 100٪ TCA عن طريق إضافة 40 مل من dH2O إلى 100 غرام من مسحوق TCA وتخلط حتى يذوب تماما. اضبط مستوى الصوت النهائي باستخدام dH2O إلى 100 mL.
  9. تحضير 80٪ إيثانول عن طريق خلط 20 مل من dH2O مع 80 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
  10. قم بإعداد المخزن المؤقت لتشغيل اللطخة الغربية عن طريق خلط 1.8 لتر من dH2O مع 200 مل من المخزن المؤقت للتشغيل 10x.
  11. قم بإعداد المخزن المؤقت لنقل اللطخة الغربية عن طريق خلط 1.4 لتر من dH2O مع 200 مل من محلول نقل 10x و 400 مل من الميثانول. قم بتبريد المخزن المؤقت للنقل إلى 4 درجات مئوية.
  12. تحضير 20x محلول ملحي مخزن تريس (TBS) عن طريق إذابة 122 جم من قاعدة تريس و 180 جم من كلوريد الصوديوم في 850 مل من dH2O (درجة الحموضة 8.0). اضبط مستوى الصوت على 1 لتر باستخدام dH2O.
  13. تحضير المخزن المؤقت المانع عن طريق إذابة 5 جم من الحليب الجاف الخالي من الدسم مع 1 مل من 10٪ توين -20 ، 5 مل من 20x TBS ، و 94 مل من dH2O.
  14. تحضير المخزن المؤقت للأجسام المضادة عن طريق إذابة 3 جم من BSA مع 1 مل من 10٪ Tween-20 ، و 5 مل من 20x TBS ، و 94 مل من dH2O.
  15. تحضير المخزن المؤقت للغسيل عن طريق خلط 100 مل من 20x TBS و 20 مل من 10٪ Tween-20 (10x) مع 1.88 لتر من dH2O.
  16. تحضير محلول تطوير عن طريق خلط 1 حجم من اللومينول / تعزيز مع حجم واحد من العازلة بيروكسيد مستقرة.

2. تشريح عضلة الفأر الساقي (GA)15,16

  1. تحضير أنابيب 50 مل تحتوي على 10 مل PBS على الجليد.
  2. القتل الرحيم للفئران في غرفة CO2 تليها خلع عنق الرحم.
  3. إزالة عضلة gastrocnemius من كلا الساقين ونقلها إلى الأنبوب مع برنامج تلفزيوني على الجليد.
    ملاحظة: قم بإزالة العضلة الوحيدة من عضلة GA قبل نقل عضلة GA إلى PBS.

3. عزل الخلايا الليفية الأولية للفأر والثقافة

  1. وزن العضلات ونقلها إلى طبق 10 سم تحت غطاء السلامة الحيوية. فرم العضلات بالمشارط حتى تصبح عجينة ناعمة.
  2. انقل معجون العضلات المفروم ناعما إلى أنبوب سعة 50 مل وأضف 3.5x حجم / مجم من محلول الهضم إلى الأنبوب واحتضانه لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. امزج التعليق جيدا باستخدام ماصة سعة 5 مل كل 10 دقائق (سيساعد ذلك في التفكك التام).
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مفكك الأنسجة لهذه الخطوة.
  3. أضف 20 مل من DMEM كاملة إلى تعليق الخلية لتعطيل محلول الهضم. نقل إلى مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر وضعت على أنبوب 50 مل. اجمع التدفق واغسل مصفاة الخلية ب 5 مل إضافية من DMEM كاملة.
  4. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية بعناية.
  5. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من DMEM كاملة وزرع الخلايا في طبق 10 سم.
  6. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2 (المقطع 0 أو P0).
    ملاحظة: 1) يجب الحفاظ على هذه الثقافات عند مستوى أكسجين منخفض لضمان ظروف شبيهة بالفسيولوجية (مستوى O 2 في العضلات الهيكلية حوالي2.5٪) 17. 2) رقم المرور (على سبيل المثال ، P0) لمزرعة الخلية هو سجل لعدد المرات التي تم فيها زراعة المزرعة الفرعية. 3) يتم استزراع الخلايا الليفية الأولية في P0 بشكل روتيني حتى التقاء 100٪ بالإضافة إلى يوم واحد (وفقط ل P0). هذا لتطهير أنواع أخرى من الخلايا والتأكد من أن الخلايا الموجودة في المزرعة ليست سوى خلايا ليفية ، مستنفدة من الخلايا العضلية على أساس الفحص المجهري. تحتوي العضلات الهيكلية من بالغ في عمر شهرين على حوالي 2٪ من الأسلاف العضلية4. بالإضافة إلى ذلك ، لا تعلق الأسلاف العضلية عادة على الأطباق غير المطلية ؛ لذلك ، يتم فقدها أثناء الاستزراعالفرعي 18،19،20. تتطلب الخلايا العضلية وسيطا مختلفا (F10) مكملا ب 20٪ FBS وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) 18. في DMEM الكامل ، يكون للخلايا الليفية المتوسطة معدل تكاثر أعلى من الخلايا العضلية ، مما يؤدي إلى القضاء على هذه الخلايا الملوثة قبل الممر الأول.
  7. شطف خلايا P0 مع برنامج تلفزيوني عندما 100٪ متقاربة بالإضافة إلى 1 يوم. أضف 1 مل من محلول التربسين واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2 لفصل الخلايا. إيقاف النشاط الأنزيمي باستخدام 10 مل من DMEM كاملة.
  8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 10 دقائق في RT وإعادة تعليق بيليه في 20 مل من DMEM كاملة والبذور في طبق 15 سم (الممر 1 أو P1). تنمو الخلايا حتى التقاء 80٪ -90٪ ويمكن توسيعها حتى المرور 3.
    ملاحظة: اعتمادا على تجارب المصب ، يمكن استخدام المقطع 1 أو المقطع 2 (P2) أو المقطع 3 (P3).

4. بذر الخلايا وجمع الوسط المشروط

  1. اغسل الخلايا الليفية (P1 أو P2 أو P3) ب 10 مل من PBS ، وأضف 2.5 مل من محلول التربسين إلى الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2. إيقاف النشاط الأنزيمي باستخدام 10 مل من DMEM كاملة.
    ملاحظة: بعد المرور 4 ، يتم التخلص من الخلايا الأولية ويجب عدم استخدامها لإجراء مزيد من التجارب ، لأنها تغير الخصائص.
  2. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام في RT لمدة 10 دقائق.
  3. إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من الوسط الخالي من الإكسوسوم وعد الخلايا.
  4. بذر الخلايا في 1.5-2.0 × 106 خلايا لكل طبق (15 سم) واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2.
  5. اجمع الوسط المكيف بين 16-24 ساعة في أنابيب سعة 50 مل على الجليد.
    ملاحظة: إذا لم تكن الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، فيمكن إضافة وسط جديد خال من الظواهر الخارجية مرة أخرى وجمعها بعد فترة 16-24 ساعة إضافية. يمكن الجمع بين المجموعتين لمزيد من المعالجة.

5. تنقية الإكسوسومات باستخدام الطرد المركزي التفاضلي والفائق

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية أو على الجليد. وازن الأنبوب بأنبوب مملوء بالماء عند الحاجة.

  1. جهاز طرد مركزي الوسط المكيف عند 300 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا الحية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
  2. قم بإزالة الخلايا الميتة عن طريق الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق ونقل المادة الطافية إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 38.5 مل.
  3. جهاز طرد مركزي للطاف عند 10000 × جم لمدة 30 دقيقة لإزالة العضيات والأجسام المبرمج وشظايا الغشاء. انقل المادة الطافية إلى أنبوب فائق الوضوح سعة 38.5 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي الفائقة الطافية عند 100000 × جم لمدة 1.5 ساعة لتكوير الإكسوسومات.
  5. تخلص بعناية من المادة الطافية ، واترك حوالي 1 مل من الوسط المكيف ، واغسل الحبيبات الخارجية بحجم إجمالي قدره 30 مل من برنامج تلفزيوني بارد مثلج.
  6. جهاز طرد مركزي عند 100000 × جم لمدة 1.5 ساعة وتخلص بعناية من المادة الطافية عن طريق السحب ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات الخارجية.
  7. أعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني بارد (~ 25 ميكرولتر لكل طبق 15 سم) وقم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA وقارئ الصفائح الدقيقة عند 562 نانومتر.
    ملاحظة: يتم قياس تركيز البروتين بتخفيف 1: 2 مع 0.1٪ Triton-X100 في dH2O. إن ناتج الإكسوسومات من طبق 15 سم (20 مل من الوسط المكيف) من الخلايا الليفية الأولية عند التقاء 80٪ هو ~ 3-4 ميكروغرام.

6. توصيف الإكسوسومات بواسطة تدرج كثافة السكروز

  1. قم بتحميل تدرج السكروز في أنبوب فائق الوضوح سعة 13 مل عن طريق سحب (من الأسفل إلى الأعلى) ما يلي: 1.5 مل من 2.0 م ، 2.5 مل من 1.3 م ، 2.5 مل من 1.16 م ، 2.0 مل من 0.8 م ، و 2.0 مل من 0.5 م محاليل السكروز.
  2. امزج 30-100 ميكروغرام من الإكسوسومات بمحلول السكروز 0.25 متر واضبط الحجم على 1 مل.
  3. قم بتحميل الإكسوسومات الموجودة أعلى التدرجات بعناية وأجهزة الطرد المركزي الفائقة العينات لمدة 2.5 ساعة عند 100000 × جم و 4 درجات مئوية.
  4. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الفائق وضعها على الجليد واجمع 1.0 مل من الكسور بدءا من أعلى الانحدار. نقلها إلى أنابيب 1.7 مل على الجليد.
  5. أضف 110 ميكرولتر من TCA بنسبة 100٪ إلى كل أنبوب ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 10 دقائق في RT.
  6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 10000 × g و RT وتخلص بعناية من المادة الطافية.
  7. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من الإيثانول المبرد مسبقا بنسبة 80٪ واترك العينات تغسل لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية.
  8. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 10000 × جم و 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  9. جفف الحبيبات لمدة 10-15 دقيقة في RT وأعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني للتجارب في المختبر. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة بروتين BCA أو أعد تعليق الحبيبات مباشرة في 14.5 ميكرولتر من dH2O ، و 5 ميكرولتر من 4x Laemmli buffer ، و 0.5 ميكرولتر من 1 M DTT لتحليلات اللطخة الغربية.

7. الكشف عن Exosome عن طريق تحليل اللطخة الغربية

  1. امزج 5-10 ميكروغرام من الإكسوسومات من الخطوة 5.7 مع 5 ميكرولتر من 4x Laemmli buffer ، و 0.5 ميكرولتر من 1 M DTT ، ثم اضبط الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر مع dH2O. سخني جميع العينات ، بما في ذلك تلك الموجودة في الخطوة 6.9 ، لمدة 5 دقائق عند 98 درجة مئوية.
  2. قم بتحميل العينات في جل خال من البقع بنسبة 10٪ TGX وقم بتحميل سلالم البروتين وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: اختر النسبة المئوية للهلام وفقا للوزن الجزيئي للبروتين محل الاهتمام.
  3. قم بتشغيل الجل عند 100 فولت لمدة ~ 1 ساعة في تشغيل المخزن المؤقت حتى تصبح صبغة التحميل في الجزء السفلي من الجل.
    ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل وفقا للمعدات المستخدمة أو نوع الجل ونسبته.
  4. صورة الجل. تستخدم صور المواد الهلامية الخالية من البقع كعنصر تحكم في تحميل البقع المناعية.
  5. انقل الجل باستخدام غشاء PVDF لمدة 1.5 ساعة عند 80 فولت أو طوال الليل عند 30 فولت عند 4 درجات مئوية.
  6. سد الأغشية في سد العازلة لمدة 1 ساعة في RT.
  7. احتضان الأغشية لأجسام مضادة محددة (الجدول 2) في مخزن الأجسام المضادة طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع التقليب.
  8. غسل الأغشية في العازلة الغسيل واحتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الجدول 2) لمدة 1 ساعة في RT مع الإثارة.
  9. اغسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل وصور الأغشية باستخدام محلول تطوير وتصوير قائم على الكاميرا. بدلا من ذلك ، استخدم فيلم الأشعة السينية لتطوير الأغشية.

النتائج

هذا البروتوكول مناسب لتنقية الإكسوسومات من كميات كبيرة من الوسط المكيف بطريقة فعالة من حيث التكلفة. الإجراء قابل للتكرار للغاية ومتسقة. يوضح الشكل 1 صورة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) للإكسوسومات المنقاة من وسط زراعة الخلايا الليفية الأولية للفأر. يوضح الشكل 2

Discussion

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة للعزل الناجح للإكسوسومات من وسائط الاستزراع ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، في إنشاء وصيانة مزارع الخلايا الليفية الأولية للفأر من العضلات الهيكلية البالغة. يجب الحفاظ على هذه الثقافات عند مستوى أكسجين منخفض لضمان ظروف شبيهة بالفسيولوجية (مستوى O 2 في العضلات ...

Disclosures

ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

أليساندرا دازو حاصلة على كرسي مجوهرات الأطفال (JFC) في علم الوراثة والعلاج الجيني. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01GM104981 و RO1DK095169 و CA021764 ومؤسسة أسيزي في ممفيس والجمعيات الخيرية الأمريكية اللبنانية السورية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm dishesMidwest Scientific, TPPTP93100
15 cm dishesMidwest ScientificTP93150
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific, Pierce23225
Bovine serum albumin Fraction VRoche10735094001
CaCl2SigmaC1016-100G
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11Eppendorf022620659/5427754008
Chemidoc MP imaging systemBioRad12003154
Collagenase PSigma, Roche11 213 857 001100 mg
cOmplete protease inhibitor cocktailMillipore/Sigma, Roche11697498001
Criterion Blotter with plate electrodesBioRad1704070
Criterion TGX stain-free protein gelBioRad567803410% 18-well, midi-gel
Criterion vertical electrophoresis cell (midi)BioRadNC0165100
Dispase IISigma, Roche04 942 078 001neutral protease, grade II
DithiothreitolSigma/Millipore, Roche10708984001
Dulbecco’s Modification Eagles MediumCorning15-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineCorning21-031-CV
Ethanol 200 proofPharmco by Greenfield Global111000200
Falcon 50 mL conical centrifuge tubesCorning352070
Fetal Bovine SerumGibco10437-028
Fluostar Omega multi-mode microplate readerBMG Labtech
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific, Gibco35050-061
Hydrochloric acidFisher ScientificA144S-500
Immobilon-P Transfer membranesMilliporeIPVH00010
Laemmli sample buffer (4x)BioRad1610747
Magnesium acetate solutionSigma63052-100ml
Non-fat dry milkLabScientificM-0842
O2/CO2 incubatorSanyoMC0-18M
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific, Gibco15140-12210,000 U/ml
Premium microcentrifuge tubesFisher Scientific, Midwest ScientificAVSC15101.7 mL
Protected disposable scalpelsFisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker372610
Running bufferBioRad1610732
Sodium ChlorideFisher Scientific, Fisher ChemicalS271-3
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration systemMilliporeS2GPU05RE500 mL
Sterile cell strainer (70 mm)Fisher Scientific, Fisher brand22-363-548
SucroseFisher Scientific, Fisher ChemicalS5-500
SuperSignal west FemtoThermo Fisher Scientific34096
Thin wall Polypropylene tubesBeckman Coulter326823
Transfer bufferBioRad16110734
Trichloroacetic AcidSigma91228-100G
Tris baseBioRad1610719
Triton-X100 solutionSigma93443-100mL
TrypLE Express EnzymeThermo Fisher Scientific, Gibco12604-013No phenol red
Tween-20BioRad#1610781
Ultra-centrifuge Optima XPMBeckman CoulterA99842
Ultra-clear tube (14x89 mm)Beckman Coulter344059
Ultra-clear tubes (25x89 mm)Beckman Coulter344058
Water bath Isotemp 220Fisher ScientificFS220

References

  1. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  2. Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells. 8 (4), 307 (2019).
  3. Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential. Cell & Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).
  4. van de Vlekkert, D., et al. Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis. Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).
  5. Rackov, G., et al. A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment. Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).
  6. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  7. Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).
  8. Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis. Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).
  9. Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology. Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).
  10. Machado, E., et al. Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression. Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).
  11. Tian, W., Liu, S., Li, B. Potential role of exosomes in cancer metastasis. Biomed Research International. , 4649705 (2019).
  12. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease. Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).
  13. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).
  14. Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., González-Valdez, J. Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes. Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).
  15. Boutagy, N. E., et al. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).
  16. . Muscle Dissection in mouse Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8 (2016)
  17. Mas-Bargues, C., et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).
  18. Bois, P. R., Grosveld, G. FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts. The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).
  19. Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages. Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).
  20. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Alex CD9 CD81

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved