Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Riepilogo

Questo protocollo illustra 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi utilizzando un metodo di ultracentrifugazione differenziale combinato con gradienti di densità del saccarosio seguito da analisi western blot.

Abstract

Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari rilasciate praticamente da tutte le cellule e secrete in tutti i fluidi biologici. Sono stati sviluppati molti metodi per l'isolamento di queste vescicole, tra cui l'ultracentrifugazione, l'ultrafiltrazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale. Tuttavia, non tutti sono adatti per la purificazione e la caratterizzazione di esosomi su larga scala. Qui è delineato un protocollo per stabilire colture di fibroblasti primari isolati da muscoli scheletrici di topo adulto, seguito dalla purificazione e caratterizzazione degli esosomi dai terreni di coltura di queste cellule. Il metodo si basa sull'uso di fasi di centrifugazione sequenziale seguite da gradienti di densità del saccarosio. La purezza dei preparati esosomiali viene quindi convalidata mediante analisi western blot utilizzando una batteria di marcatori canonici (ad esempio, Alix, CD9 e CD81). Il protocollo descrive come isolare e concentrare gli esosomi bioattivi per la microscopia elettronica, la spettrometria di massa e gli esperimenti di uptake per studi funzionali. Può essere facilmente scalato verso l'alto o verso il basso e adattato per l'isolamento degli esosomi da diversi tipi di cellule, tessuti e fluidi biologici.

Introduzione

Gli esosomi sono vescicole extracellulari eterogenee di dimensioni comprese tra 30 e 150 nm. Sono attori chiave affermati nei processi fisiologici e patologici, data la loro distribuzione ubiquitaria nei tessuti e negli organi ^1,2. Gli esosomi trasportano un carico complesso di proteine, lipidi, tipi di DNA e tipi di RNA, che variano a seconda del tipo di cellule da cui derivano ^1,2,3. Gli esosomi sono arricchiti in proteine che hanno funzioni diverse (ad esempio, le tetraspanine, tra cui CD9 e CD63) sono responsabili degli eventi di fusione. Ad esempio, le proteine da shock termico HSP70 e HSP90 sono coinvolte nel legame e nella presentazione dell'antigene. Inoltre, Alix, Tsg101 e flotillina partecipano alla biogenesi e al rilascio degli esosomi e sono ampiamente utilizzati come marcatori di queste nanovescicole ^2,3,4.

Gli esosomi contengono anche una varietà di RNA (cioè microRNA, RNA lunghi non codificanti, RNA ribosomiali) che possono essere trasferiti alle cellule riceventi, dove influenzano la segnalazione a valle³. Essendo racchiusi da una singola unità di membrana, la bioattività degli esosomi dipende non solo dal carico di proteine e acidi nucleici, ma anche dai componenti lipidici della membrana limitante¹. Le membrane esosomiali sono arricchite in fosfatidilserina, acido fosfatidico, colesterolo, sfingomielina, acido arachidonico e altri acidi grassi, che possono influenzare la stabilità degli esosomi e la topologia della membrana ^2,3. Come risultato della disposizione del carico e dei lipidi, gli esosomi avviano vie di segnalazione nelle cellule riceventi e partecipano al mantenimento della normale fisiologia tissutale 1,2,4,5. In alcune condizioni patologiche (ad esempio, neurodegenerazione, fibrosi e cancro), è stato dimostrato che innescano e propagano stimoli patologici 4,6,7,8,9,10,11.

Grazie alla loro capacità di propagare i segnali a siti vicini o lontani, gli esosomi sono diventati preziosi biomarcatori per la diagnosi o la prognosi delle condizioni patologiche. Inoltre, gli esosomi sono stati utilizzati sperimentalmente come veicoli dei composti terapeutici ^2,12. La potenziale applicazione di queste nanovescicole in clinica rende il metodo di isolamento sempre più importante per ottenere la massima resa, purezza e riproducibilità. Sono state sviluppate e implementate diverse tecniche per l'isolamento degli esosomi. Generalmente, gli esosomi possono essere isolati da terreni di coltura cellulare condizionati o fluidi corporei mediante centrifugazione differenziale, cromatografia ad esclusione dimensionale e cattura immunitaria (utilizzando kit disponibili in commercio). Ogni approccio presenta vantaggi e svantaggi unici che sono stati discussi in precedenza 1,2,13,14.

Il protocollo delineato si concentra su 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi rilasciati nel terreno di coltura da queste cellule. Attualmente manca un protocollo consolidato per l'isolamento degli esosomi dai fibroblasti primari per gli studi funzionali. I fibroblasti primari non secernono grandi quantità di esosomi, rendendo difficile il processo di isolamento e purificazione. Questo protocollo descrive la purificazione di grandi quantità di esosomi puri da grandi volumi di coltura, mantenendone l'integrità morfologica e l'attività funzionale. Gli esosomi purificati ottenuti da un terreno condizionato sono stati utilizzati con successo in esperimenti di captazione in vitro per indurre specifiche vie di segnalazione nelle cellule riceventi. Sono stati utilizzati anche per analisi proteomiche comparative di carichi esosomiali da più campioni biologici⁴.

Protocollo

Tutte le procedure nei topi sono state eseguite secondo i protocolli sugli animali approvati dal St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee e dalle linee guida del National Institutes of Health.

1. Preparazione delle soluzioni e dei terreni

1. Preparare la soluzione di digestione mescolando 15,4 mL di PBS con 2,5 mL di 20 mg/mL di collagenasi P (concentrazione finale di 5 mg/mL), 2 mL di dispasi II 11 U/mL (concentrazione finale di 1,2 U/mL) e 100 μL di CaCl₂ 1,0 M (concentrazione finale di 5 mM).
2. Preparare 500 mL di terreno fibroblastico primario (DMEM completo) mescolando 440 mL di DMEM con 50 mL di FBS (10%), 5,0 mL di penna/streptococco (100 U/mL e 100 μg/mL, rispettivamente) e 5,0 mL di integratore di glutammina (2 mM). Sterilizzare il mezzo con un filtro sottovuoto con pori da 0,22 μm.
3. Preparare il siero privo di esosomi mediante ultracentrifugazione notturna di FBS in provette di polipropilene da 38,5 mL a 100.000 x g a 4 °C e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
4. Preparare 500 mL di terreno privo di esosomi mescolando 440 mL di DMEM con 50 mL di siero privo di esosomi (10%), 5 mL di penna/streptococco (100 U/mL e 100 μg/mL) e 5 mL di integratore di glutammina (2 mM). Sterilizzare il mezzo con un filtro sottovuoto con pori da 0,22 μm.
5. Preparare Tris-HCl 0,5 M (pH 7,4) sciogliendo 6,057 g di Tris base in 90 mL di dH 2 O e regolando il pH a7,4 con HCl. Regolare il volume a 100 mL con dH₂O.
6. Preparare 10 mM di soluzione di Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM di Mg(Ac)2 (soluzione di lavoro di saccarosio) mescolando 97,9 mL di dH 2 O con 2mL di Tris-HCl 0,5 M (pH = 7,4) e 100 μL di 1 M Mg(Ac)₂. Aggiungere gli inibitori della proteasi alla soluzione appena prima dell'uso e mantenere la soluzione in ghiaccio.
7. Preparare le soluzioni a gradiente di densità del saccarosio su ghiaccio secondo la Tabella 1. Queste soluzioni sono sufficienti per preparare due tubi a gradiente di saccarosio.
8. Preparare il TCA al 100% aggiungendo 40 mL di dH₂O a 100 g di TCA in polvere e mescolare fino a completo scioglimento. Regolare il volume finale con dH₂O a 100 mL.
9. Preparare l'etanolo all'80% mescolando 20 mL di dH₂O con 80 mL di etanolo al 100%.
10. Preparare il tampone di esecuzione Western blot mescolando 1,8 L di dH₂O con 200 mL di tampone di esecuzione 10x.
11. Preparare il tampone di trasferimento western blot mescolando 1,4 L di dH₂O con 200 mL di tampone di trasferimento 10x e 400 ml di metanolo. Preraffreddare il tampone di trasferimento a 4 °C.
12. Preparare 20 soluzione salina tamponata con Tris (TBS) sciogliendo 122 g di base Tris e 180 g di cloruro di sodio in 850 mL di dH₂O (pH 8,0). Regolare il volume a 1 L con dH₂O.
13. Preparare il tampone bloccante sciogliendo 5 g di latte in polvere scremato con 1 mL di Tween-20 al 10%, 5 ml di TBS 20x e 94 ml di dH₂O.
14. Preparare il tampone anticorpale sciogliendo 3 g di BSA con 1 mL di Tween-20 al 10%, 5 mL di TBS 20x e 94 mL di dH₂O.
15. Preparare il tampone di lavaggio mescolando 100 mL di 20x TBS e 20 mL di 10% Tween-20 (10x) con 1,88 L di dH₂O.
16. Preparare la soluzione di sviluppo mescolando 1 volume di luminol/enhance con 1 volume di tampone di perossido stabile.

2. Dissezione del muscolo del topo gastrocnemio (GA)^15,16

1. Preparare provette da 50 mL contenenti 10 mL di PBS su ghiaccio.
2. Eutanasia dei topi in una camera di CO₂ seguita da lussazione cervicale.
3. Rimuovere il muscolo gastrocnemio da entrambe le gambe e trasferirle nel tubo con PBS su ghiaccio.
   NOTA: Rimuovere il muscolo soleo dal muscolo GA prima di trasferire il muscolo GA al PBS.

3. Isolamento e coltura di fibroblasti primari di topo

1. Pesare i muscoli e trasferirli in un piatto da 10 cm sotto una cappa di biosicurezza. Tritare i muscoli con il bisturi fino a quando non diventa una pasta fine.
2. Trasferire la pasta muscolare finemente tritata in una provetta da 50 mL e aggiungere 3,5 volte il volume/mg di tessuto di soluzione digestiva nella provetta e incubare per 45 minuti a 37 °C. Mescolare accuratamente la sospensione con una pipetta da 5 ml ogni 10 minuti (questo aiuterà nella completa dissociazione).
   NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un dissociatore tissutale per questo passaggio.
3. Aggiungere 20 mL di DMEM completo alla sospensione cellulare per inattivare la soluzione di digestione. Trasferire in un colino per celle di nylon da 70 μm posto su una provetta da 50 ml. Raccogliere il flusso passante e lavare il filtro cellulare con altri 5 ml di DMEM completo.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti e rimuovere con cautela il surnatante.
5. Risospendere il pellet in 10 mL di DMEM completo e seminare le cellule in un piatto di 10 cm.
6. Coltivare le cellule a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂ (passaggio 0 o P0).
   NOTA: 1) Queste colture devono essere mantenute a un basso livello di ossigeno per garantire condizioni simili a quelle fisiologiche (il livello di O 2 nel muscolo scheletrico è di circa il_2,5%)¹⁷. 2) Il numero di passaggio (ad esempio, P0) di una coltura cellulare è una registrazione del numero di volte in cui la coltura è stata sottocoltivata. 3) I fibroblasti primari a P0 vengono coltivati di routine fino al 100% di confluenza più 1 giorno (e solo per P0). Questo per eliminare altri tipi di cellule e garantire che le cellule presenti nella coltura siano solo fibroblasti, impoveriti di cellule miogeniche in base all'esame al microscopio. Il muscolo scheletrico di un animale adulto a 2 mesi di età contiene circa il 2% di progenitori miogenici⁴. Inoltre, i progenitori miogenici di solito non si attaccano alle piastre non rivestite; pertanto, vengono persi durante la subcoltura^18,19,20. Le cellule miogeniche richiedono un terreno diverso (F10) integrato con il 20% di FBS e fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF)¹⁸. Nel DMEM completo, i fibroblasti medi hanno un tasso di proliferazione più elevato rispetto alle cellule miogeniche, il che si traduce nell'eliminazione di queste cellule contaminanti prima del primo passaggio.
7. Risciacquare le celle P0 con PBS quando sono confluenti al 100% più 1 giorno. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsinizzazione e incubare a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂ per staccare le cellule. Interrompere l'attività enzimatica utilizzando 10 mL di DMEM completo.
8. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 minuti a RT e risospendere il pellet in 20 mL di DMEM completo e seminare in un piatto di 15 cm (passaggio 1 o P1). Le cellule vengono cresciute fino all'80%-90% di confluenza e possono essere espanse fino al passaggio 3.
   NOTA: A seconda degli esperimenti a valle, è possibile utilizzare il passaggio 1, il passaggio 2 (P2) o il passaggio 3 (P3).

4. Semina delle cellule e raccolta del terreno condizionato

1. Lavare i fibroblasti (P1, P2 o P3) con 10 mL di PBS, aggiungere 2,5 mL di soluzione di tripsinizzazione alle cellule e incubare a 37 °C, 5% CO 2, 3% O_{2 .} Interrompere l'attività enzimatica utilizzando 10 mL di DMEM completo.
   NOTA: Dopo il passaggio 4, le cellule primarie vengono scartate e non devono essere utilizzate per ulteriori esperimenti, poiché cambiano caratteristiche.
2. Raccogliere le cellule e centrifugare a 300 x g a RT per 10 min.
3. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno privo di esosomi e contare le cellule.
4. Seminare le cellule a 1,5–2,0 x 10⁶ cellule per piatto (15 cm) e incubare a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂ .
5. Raccogliere il terreno condizionato tra 16 e 24 ore in provette da 50 mL su ghiaccio.
   NOTA: Se le cellule non sono confluenti all'80%, è possibile aggiungere nuovamente terreno libero esosomiale fresco e raccoglierlo dopo un ulteriore periodo di 16-24 ore. Le due collezioni possono essere combinate per ulteriori lavorazioni.

5. Purificazione degli esosomi mediante differenziale e ultracentrifugazione

NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti a 4 °C o su ghiaccio. Bilanciare il tubo con un tubo pieno d'acqua quando necessario.

1. Centrifugare il terreno condizionato a 300 x g per 10 minuti per la rimozione delle cellule vive e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 mL.
2. Rimuovere le cellule morte mediante centrifugazione a 2.000 x g per 10 minuti e trasferire il surnatante in una provetta di polipropilene da 38,5 mL.
3. Centrifugare il surnatante a 10.000 x g per 30 minuti per la rimozione di organelli, corpi apoptotici e frammenti di membrana. Trasferire il surnatante in una provetta ultratrasparente da 38,5 mL.
4. Ultracentrifugare il surnatante a 100.000 x g per 1,5 h per pellettare gli esosomi.
5. Scartare con cura il surnatante, lasciando circa 1 mL di terreno condizionato, e lavare il pellet dell'esosoma in un volume totale di 30 mL di PBS ghiacciato.
6. Centrifugare a 100.000 x g per 1,5 h ed eliminare con cura il surnatante mediante pipettaggio, facendo attenzione a non disturbare il pellet esosomiale.
7. Risospendere il pellet in PBS ghiacciato (~25 μL per piatto da 15 cm) e misurare la concentrazione proteica utilizzando il kit del saggio delle proteine BCA e un lettore di micropiastre a 562 nm.
   NOTA: La concentrazione proteica è misurata mediante una diluizione 1:2 con Triton-X100 allo 0,1% in dH₂O. La resa degli esosomi da un piatto da 15 cm (20 mL di terreno condizionato) di fibroblasti primari all'80% di confluenza è di ~3-4 μg.

6. Caratterizzazione degli esosomi mediante gradiente di densità del saccarosio

1. Caricare il gradiente di saccarosio in una provetta ultratrasparente da 13 mL pipettando (dal basso verso l'alto) quanto segue: 1,5 mL di 2,0 M, 2,5 mL di 1,3 M, 2,5 mL di 1,16 M, 2,0 mL di 0,8 M e 2,0 mL di soluzioni di saccarosio 0,5 M.
2. Mescolare 30-100 μg di esosomi con una soluzione di saccarosio 0,25 M e regolare il volume a 1 mL.
3. Caricare con cautela gli esosomi sopra i gradienti e ultracentrifugare i campioni per 2,5 ore a 100.000 x g e 4 °C.
4. Rimuovere le provette dall'ultracentrifuga e posizionarle sul ghiaccio e raccogliere 1,0 mL di frazioni partendo dalla parte superiore del gradiente. Trasferirli in provette da 1,7 mL su ghiaccio.
5. Aggiungere 110 μL di TCA al 100% in ciascuna provetta, mescolare bene e incubare per 10 minuti a RT.
6. Centrifugare per 10 minuti a 10.000 x g e RT ed eliminare con cura il surnatante.
7. Risospendere il pellet in 500 μL di etanolo preraffreddato all'80% e lasciare lavare i campioni per 10 minuti a -20 °C.
8. Centrifugare per 10 minuti a 10.000 x g e 4 °C ed eliminare il surnatante.
9. Asciugare il pellet per 10-15 minuti a RT e risospendere il pellet in PBS per esperimenti in vitro. Misurare la concentrazione proteica utilizzando il kit del saggio delle proteine BCA o risospendere il pellet direttamente in 14,5 μL di dH₂O, 5 μL di tampone Laemmli 4x e 0,5 μL di 1 M DTT per le analisi western blot.

7. Rilevamento degli esosomi mediante analisi western blot

1. Miscelare 5-10 μg di esosomi del passaggio 5.7 con 5 μL di tampone Laemmli 4x e 0,5 μL di 1 M DTT, quindi regolare il volume finale a 20 μL con dH₂O. Riscaldare tutti i campioni, compresi quelli del passaggio 6.9, per 5 minuti a 98 °C.
2. Caricare i campioni in un gel TGX privo di coloranti al 10% e caricare le scale proteiche secondo le raccomandazioni del produttore.
   NOTA: Scegliere la percentuale di gel in base al peso molecolare della proteina di interesse.
3. Far scorrere il gel a 100 V per ~1 ora nel tampone di funzionamento fino a quando il colorante di caricamento non si trova sul fondo del gel.
   NOTA: Il tempo di funzionamento può variare in base all'apparecchiatura utilizzata o al tipo e alla percentuale di gel.
4. Immagina il gel. Le immagini dei gel privi di colorazione vengono utilizzate come controllo del carico per gli immunoblots.
5. Trasferire il gel con una membrana in PVDF per 1,5 ore a 80 V o per una notte a 30 V a 4 °C.
6. Bloccare le membrane nel tampone di blocco per 1 ora a RT.
7. Incubare le membrane per la ricerca di anticorpi specifici (Tabella 2) in tampone anticorpale per una notte a 4 °C con agitazione.
8. Lavare le membrane in tampone di lavaggio e incubare le membrane con gli anticorpi secondari appropriati (Tabella 2) per 1 ora a RT con agitazione.
9. Lavare le membrane in un tampone di lavaggio e creare un'immagine delle membrane utilizzando una soluzione di sviluppo e un imager basato su telecamera. In alternativa, utilizzare una pellicola a raggi X per sviluppare le membrane.

Risultati

Questo protocollo è adatto per la purificazione di esosomi da grandi volumi di terreno condizionato in modo economico. La procedura è altamente riproducibile e coerente. La Figura 1 mostra l'immagine al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) degli esosomi purificati dal terreno di coltura dei fibroblasti primari di topo. La Figura 2 mostra il pattern di espressione proteica dei marcatori esosomiali canonici e l'assenza di contaminanti proteici citosolici...

Discussione

Un passo fondamentale per il successo dell'isolamento degli esosomi dai terreni di coltura, come delineato in questo protocollo, è la corretta costituzione e mantenimento di colture primarie di fibroblasti di topo dal muscolo scheletrico adulto. Queste colture devono essere mantenute a un basso livello di ossigeno per garantire condizioni simili a quelle fisiologiche (il livello di O₂ nel muscolo scheletrico è ~2,5%)¹⁵. I fibroblasti primari cambiano caratteristiche se passati in colt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dishes	Midwest Scientific, TPP	TP93100
15 cm dishes	Midwest Scientific	TP93150
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific, Pierce	23225
Bovine serum albumin Fraction V	Roche	10735094001
CaCl2	Sigma	C1016-100G
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11	Eppendorf	022620659/5427754008
Chemidoc MP imaging system	BioRad	12003154
Collagenase P	Sigma, Roche	11 213 857 001	100 mg
cOmplete protease inhibitor cocktail	Millipore/Sigma, Roche	11697498001
Criterion Blotter with plate electrodes	BioRad	1704070
Criterion TGX stain-free protein gel	BioRad	5678034	10% 18-well, midi-gel
Criterion vertical electrophoresis cell (midi)	BioRad	NC0165100
Dispase II	Sigma, Roche	04 942 078 001	neutral protease, grade II
Dithiothreitol	Sigma/Millipore, Roche	10708984001
Dulbecco’s Modification Eagles Medium	Corning	15-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Corning	352070
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-028
Fluostar Omega multi-mode microplate reader	BMG Labtech
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144S-500
Immobilon-P Transfer membranes	Millipore	IPVH00010
Laemmli sample buffer (4x)	BioRad	1610747
Magnesium acetate solution	Sigma	63052-100ml
Non-fat dry milk	LabScientific	M-0842
O2/CO2 incubator	Sanyo	MC0-18M
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122	10,000 U/ml
Premium microcentrifuge tubes	Fisher Scientific, Midwest Scientific	AVSC1510	1.7 mL
Protected disposable scalpels	Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker	372610
Running buffer	BioRad	1610732
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S271-3
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system	Millipore	S2GPU05RE	500 mL
Sterile cell strainer (70 mm)	Fisher Scientific, Fisher brand	22-363-548
Sucrose	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S5-500
SuperSignal west Femto	Thermo Fisher Scientific	34096
Thin wall Polypropylene tubes	Beckman Coulter	326823
Transfer buffer	BioRad	16110734
Trichloroacetic Acid	Sigma	91228-100G
Tris base	BioRad	1610719
Triton-X100 solution	Sigma	93443-100mL
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific, Gibco	12604-013	No phenol red
Tween-20	BioRad	#1610781
Ultra-centrifuge Optima XPM	Beckman Coulter	A99842
Ultra-clear tube (14x89 mm)	Beckman Coulter	344059
Ultra-clear tubes (25x89 mm)	Beckman Coulter	344058
Water bath Isotemp 220	Fisher Scientific	FS220