Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Resumo

Este protocolo ilustra 1) o isolamento e cultura de fibroblastos primários do músculo gastrocnêmio de camundongos adultos, bem como 2) purificação e caracterização de exossomos usando um método de ultracentrifugação diferencial combinado com gradientes de densidade de sacarose seguidos por análises de western blot.

Resumo

Exossomos são pequenas vesículas extracelulares liberadas por praticamente todas as células e secretadas em todos os fluidos biológicos. Muitos métodos foram desenvolvidos para o isolamento dessas vesículas, incluindo ultracentrifugação, ultrafiltração e cromatografia de exclusão de tamanho. No entanto, nem todos são adequados para purificação e caracterização de exossomos em larga escala. Delinea-se aqui um protocolo para o estabelecimento de culturas de fibroblastos primários isolados de músculos esqueléticos adultos de camundongos, seguido de purificação e caracterização de exossomos dos meios de cultura dessas células. O método baseia-se no uso de etapas de centrifugação sequencial seguidas de gradientes de densidade de sacarose. A pureza das preparações exossômicas é então validada por análises de western blot usando uma bateria de marcadores canônicos (i.e., Alix, CD9 e CD81). O protocolo descreve como isolar e concentrar exossomos bioativos para microscopia eletrônica, espectrometria de massa e experimentos de captação para estudos funcionais. Ele pode ser facilmente ampliado para cima ou para baixo e adaptado para isolamento de exossomos de diferentes tipos de células, tecidos e fluidos biológicos.

Introdução

Exossomos são vesículas extracelulares heterogêneas que variam em tamanho de 30 a 150 nm. Estabelecem-se como peças-chave nos processos fisiológicos e patológicos, dada a sua distribuição ubíqua em tecidos e órgãos ^1,2. Os exossomos carregam uma carga complexa de proteínas, lipídios, tipos de DNA e tipos de RNA, que variam de acordo com o tipo de células das quais são derivadas ^1,2,3. Os exossomos são enriquecidos em proteínas que têm diferentes funções (ou seja, tetraspaninas, incluindo CD9 e CD63) são responsáveis por eventos de fusão. Por exemplo, as proteínas de choque térmico HSP70 e HSP90 estão envolvidas na ligação e apresentação de antígenos. Adicionalmente, Alix, Tsg101 e flotino, participam da biogênese e liberação do exossomo e são amplamente utilizados como marcadores dessas nanovesículas2,3,4.

Os exossomos também contêm uma variedade de RNAs (isto é, microRNAs, RNAs longos não codificantes, RNAs ribossomais) que podem ser transferidos para as células receptoras, onde influenciam a sinalização a jusante³. Por ser delimitada por uma única unidade de membrana, a bioatividade do exossomo depende não apenas da carga de proteínas e ácidos nucléicos, mas também dos componentes lipídicos da membrana limitante¹. As membranas exossômicas são enriquecidas com fosfatidilserina, ácido fosfatídico, colesterol, esfingomielina, ácido araquidônico e outros ácidos graxos, os quais podem influenciar a estabilidade do exossomo e a topologia da membrana ^2,3. Como resultado do arranjo de carga e lipídios, os exossomos iniciam vias de sinalização nas células receptoras e participam da manutenção da fisiologia tecidual normal 1,2,4,5. Em determinadas condições patológicas (neurodegeneração, fibrose e câncer), eles têm demonstrado desencadear e propagar estímulos patológicos 4,6,7,8,9,10,11.

Devido à sua capacidade de propagar sinais para locais vizinhos ou distantes, os exossomos tornaram-se valiosos biomarcadores para o diagnóstico ou prognóstico de condições de doença. Além disso, exossomos têm sido utilizados experimentalmente como veículos de compostos terapêuticos ^2,12. O potencial de aplicação dessas nanovesículas na clínica torna o método de isolamento cada vez mais importante para atingir o máximo rendimento, pureza e reprodutibilidade. Diferentes técnicas para o isolamento de exossomos têm sido desenvolvidas e implementadas. Geralmente, os exossomos podem ser isolados de meios de cultura celular condicionados ou fluidos corporais por centrifugação diferencial, cromatografia de exclusão de tamanho e captura imunológica (usando kits disponíveis comercialmente). Cada abordagem tem vantagens e desvantagens únicas que foram discutidas anteriormente 1,2,13,14.

O protocolo delineado enfoca 1) isolamento e cultura de fibroblastos primários do músculo gastrocnêmio de camundongos adultos e 2) purificação e caracterização de exossomos liberados no meio de cultura por essas células. Atualmente, não existe um protocolo bem estabelecido para o isolamento de exossomos de fibroblastos primários para estudos funcionais. Os fibroblastos primários não secretam grandes quantidades de exossomos, tornando o processo de isolamento e purificação desafiador. Este protocolo descreve a purificação de grandes quantidades de exossomos puros de grandes volumes de cultura, mantendo sua integridade morfológica e atividade funcional. Exossomos purificados obtidos de meio condicionado têm sido usados com sucesso em experimentos de captação in vitro para induzir vias de sinalização específicas em células receptoras. Eles também têm sido utilizados para análises proteômicas comparativas de cargas exossômicas de múltiplas amostras^{biológicas 4}.

Protocolo

Todos os procedimentos em camundongos foram realizados de acordo com protocolos animais aprovados pelo St. Jude Children's Research Hospital, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e diretrizes do National Institutes of Health.

1. Preparação de soluções e meios

1. Preparar a solução de digestão misturando 15,4 mL de PBS com 2,5 mL de 20 mg/mL de colagenase P (concentração final de 5 mg/mL), 2 mL de dispase II de 11 U/mL (concentração final de 1,2 U/mL) e 100 μL de CaCl₂ de 1,0 M (concentração final de 5 mM).
2. Preparar 500 mL de meio de fibroblastos primários (DMEM completo) misturando 440 mL de DMEM com 50 mL de FBS (10%), 5,0 mL de pen/strep (100 U/mL e 100 μg/mL, respectivamente) e 5,0 mL de suplemento de glutamina (2 mM). Filtrar-esterilizar o meio com um filtro a vácuo de tamanho de poro de 0,22 μm.
3. Preparar soro livre de exossomos por ultracentrifugação noturna de FBS em tubos de polipropileno de 38,5 mL a 100.000 x g a 4 °C e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
4. Preparar 500 mL de meio livre de exossomos misturando 440 mL de DMEM com 50 mL de soro livre de exossomos (10%), 5 mL de pen/strep (100 U/mL e 100 μg/mL) e 5 mL de suplemento de glutamina (2 mM). Filtrar-esterilizar o meio com um filtro a vácuo de tamanho de poro de 0,22 μm.
5. Preparar 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) dissolvendo 6,057 g de Tris base em 90 mL de dH 2 O e ajustando opH para 7,4 com HCl. Ajustar o volume para 100 mL com dH₂O.
6. Preparar 10 mM de solução de Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Mg(Ac)2 (solução de trabalho de sacarose) misturando 97,9 mL de dH 2 O com 2 mL deTris-HCl 0,5 M (pH = 7,4) e 100 μL de 1 M Mg(Ac)₂. Adicione inibidores de protease à solução imediatamente antes de usar e mantenha a solução no gelo.
7. Preparar soluções de gradiente de densidade de sacarose no gelo de acordo com a Tabela 1. Essas soluções são suficientes para preparar dois tubos de gradiente de sacarose.
8. Preparar 100% de TCA adicionando 40 mL de dH₂O a 100 g de pó de TCA e misturar até dissolver completamente. Ajustar o volume final com dH₂O para 100 mL.
9. Preparar etanol a 80% misturando 20 mL de dH₂O com 80 mL de etanol 100%.
10. Prepare o buffer de corrida western blot misturando 1,8 L de dH₂O com 200 mL de buffer de corrida de 10x.
11. Preparar o tampão de transferência western blot misturando 1,4 L de dH₂O com 200 mL de tampão de transferência 10x e 400 mL de metanol. Pré-arrefecer o tampão de transferência a 4 °C.
12. Preparar 20x solução salina tamponada com Tris (TBS) dissolvendo 122 g de Tris base e 180 g de cloreto de sódio em 850 mL de dH₂O (pH 8,0). Ajuste o volume para 1 L com dH₂O.
13. Preparar o tampão de bloqueio dissolvendo 5 g de leite em pó desnatado com 1 mL de Tween-20 a 10%, 5 mL de 20x TBS e 94 mL de dH₂O.
14. Preparar tampão de anticorpos dissolvendo 3 g de BSA com 1 mL de Tween-20 a 10%, 5 mL de 20x TBS e 94 mL de dH₂O.
15. Preparar o tampão de lavagem misturando 100 mL de 20x TBS e 20 mL de Tween-20 10% (10x) com 1,88 L de dH₂O.
16. Preparar a solução reveladora misturando 1 volume de luminol/enhance com 1 volume de tampão de peróxido estável.

2. Dissecção do músculo gastrocnêmio (GA) de camundongos^15,16

1. Preparar tubos de 50 mL contendo 10 mL de PBS sobre gelo.
2. Eutanásia dos camundongos em câmara de CO₂ seguida de deslocamento cervical.
3. Retire o músculo gastrocnêmio de ambas as pernas e transfira-os para o tubo com PBS no gelo.
   NOTA: Remova o músculo sóleo do músculo GA antes de transferir o músculo GA para PBS.

3. Isolamento e cultura de fibroblastos primários em camundongos

1. Pese os músculos e transfira-os para um prato de 10 cm sob uma capa de biossegurança. Pique os músculos com bisturis até se tornar uma pasta fina.
2. Transfira a pasta muscular finamente picada para um tubo de 50 mL e adicione 3,5x volume/mg de tecido de solução de digestão ao tubo e incube por 45 min a 37 °C. Misture bem a suspensão com uma pipeta de 5 mL a cada 10 min (isso ajudará na dissociação completa).
   NOTA: Alternativamente, um dissociador de tecido pode ser usado para esta etapa.
3. Adicionar 20 mL de DMEM completo à suspensão celular para inativar a solução de digestão. Transfira para um filtro de células de nylon de 70 μm colocado em um tubo de 50 mL. Recolher o flow-through e lavar o filtro celular com mais 5 ml de DMEM completo.
4. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g à temperatura ambiente (TR) durante 10 minutos e remover cuidadosamente o sobrenadante.
5. Ressuspender o pellet em 10 mL de DMEM completo e semear as células em uma placa de 10 cm.
6. Cultivar as células a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂ (passagem 0 ou P0).
   NOTA: 1) Essas culturas precisam ser mantidas em um baixo nível de oxigênio para garantir condições fisiológicas (o nível de O 2 no músculo esquelético está em torno de_2,5%)¹⁷. 2) O número de passagem (por exemplo, P0) de uma cultura celular é um registro do número de vezes que a cultura foi subcultivada. 3) Fibroblastos primários em P0 são rotineiramente cultivados até 100% de confluência mais 1 dia (e somente para P0). Trata-se de purgar outros tipos de células e garantir que as células presentes na cultura sejam apenas fibroblastos, depletados de células miogênicas com base no exame microscópico. O músculo esquelético de um animal adulto aos 2 meses de idade contém cerca de 2% de progenitores miogênicos⁴. Além disso, os progenitores miogênicos geralmente não se ligam aos pratos não revestidos; portanto, perdem-se durante a subcultura18,19,20. As células miogênicas necessitam de um meio diferente (F10) suplementado com SFB a 20% e fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF)¹⁸. No DMEM completo, os fibroblastos médios apresentam maior taxa de proliferação que as células miogênicas, o que resulta na eliminação dessas células contaminantes antes da primeira passagem.
7. Enxaguar as células P0 com PBS quando 100% confluente mais 1 dia. Adicionar 1 mL de solução de tripsinização e incubar a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂ para separar as células. Pare a atividade enzimática usando 10 mL de DMEM completo.
8. Centrifugar as células a 300 x g por 10 min em TR e ressuspender o pellet em 20 mL de DMEM completo e semear em uma placa de 15 cm (passagem 1 ou P1). As células são cultivadas até 80%-90% de confluência e podem ser expandidas até a passagem 3.
   NOTA: Dependendo dos experimentos a jusante a passagem 1, a passagem 2 (P2) ou a passagem 3 (P3) podem ser usadas.

4. Semeadura das células e coleta do meio condicionado

1. Lavar os fibroblastos (P1, P2 ou P3) com 10 mL de PBS, adicionar 2,5 mL de solução de tripsinização às células e incubar a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂. Pare a atividade enzimática usando 10 mL de DMEM completo.
   NOTA: Após a passagem 4, as células primárias são descartadas e não devem ser usadas para experimentos posteriores, pois mudam de característica.
2. Recolher as células e centrifugar a 300 x g em RT durante 10 min.
3. Ressuspendeu o pellet celular em 10 mL de meio livre de exossomo e contagem das células.
4. Semeando as células a 1,5–2,0 x 10⁶ células por prato (15 cm) e incubar a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂.
5. Coletar o meio condicionado entre 16 e 24 h em tubos de 50 mL sobre gelo.
   NOTA: Se as células não forem 80% confluentes, o meio livre exossomal fresco pode ser adicionado novamente e coletado após um período adicional de 16 a 24 horas. As duas coleções podem ser combinadas para processamento posterior.

5. Purificação de exossomos utilizando diferencial e ultracentrifugação

NOTA: Todas as etapas são executadas a 4 °C ou no gelo. Equilibre o tubo com um tubo cheio de água quando necessário.

1. Centrifugar o meio condicionado a 300 x g por 10 min para remoção de células vivas e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 mL.
2. Remover as células mortas por centrifugação a 2.000 x g por 10 min e transferir o sobrenadante para um tubo de polipropileno de 38,5 mL.
3. Centrifugar o sobrenadante a 10.000 x g por 30 min para a remoção de organelas, corpos apoptóticos e fragmentos de membrana. Transfira o sobrenadante para um tubo ultratransparente de 38,5 mL.
4. Ultracentrifugar o sobrenadante a 100.000 x g por 1,5 h para pellet dos exossomos.
5. Descarte cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 1 mL de meio condicionado, e lave o pellet do exossomo em um volume total de 30 mL de PBS gelado.
6. Centrifugar a 100.000 x g por 1,5 h e descartar cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem, tomando cuidado para não perturbar a pelota exossomal.
7. Ressuspender o pellet em PBS gelado (~25 μL por placa de 15 cm) e medir a concentração de proteína usando o kit de ensaio de proteína BCA e um leitor de microplacas a 562 nm.
   NOTA: A concentração de proteínas é medida por uma diluição de 1:2 com 0,1% de Triton-X100 em dH₂O. O rendimento de exossomos de uma placa de 15 cm (20 mL de meio condicionado) de fibroblastos primários a 80% de confluência é de ~3–4 μg.

6. Caracterização de exossomos pelo gradiente de densidade de sacarose

1. Coloque o gradiente de sacarose em um tubo ultratransparente de 13 mL pipetando (de baixo para cima) o seguinte: 1,5 mL de soluções de sacarose de 2,0 M, 2,5 mL de 1,3 M, 2,5 mL de 1,16 M, 2,0 mL de 0,8 M e 2,0 mL de soluções de sacarose 0,5 M.
2. Misturar 30–100 μg de exossomos com solução de sacarose 0,25 M e ajustar o volume para 1 mL.
3. Carregar cuidadosamente os exossomos sobre os gradientes e ultracentrifugar as amostras por 2,5 h a 100.000 x g e 4 °C.
4. Retire os tubos da ultracentrífuga e coloque-os sobre gelo e colete frações de 1,0 mL a partir do topo do gradiente. Transfira-os para tubos de 1,7 mL sobre gelo.
5. Adicione 110 μL de 100% de TCA a cada tubo, misture bem e incube por 10 min no TR.
6. Centrifugar por 10 min a 10.000 x g e RT e descartar cuidadosamente o sobrenadante.
7. Ressuspender o pellet em 500 μL de etanol 80% pré-resfriado e deixar as amostras lavarem por 10 min a -20 °C.
8. Centrifugar por 10 min a 10.000 x g e 4 °C e descartar o sobrenadante.
9. Secar o pellet por 10–15 min em RT e ressuspendê-lo em PBS para experimentos in vitro. Medir a concentração de proteína usando o kit de ensaio de proteína BCA ou ressuspender o pellet diretamente em 14,5 μL de dH₂O, 5 μL de tampão Laemmli 4x e 0,5 μL de TDT 1 M para análises de western blot.

7. Detecção de exossomos por análise de western blot

1. Misturar 5–10 μg de exossomas do passo 5.7 com 5 μL de tampão Laemmli 4x e 0,5 μL de TDT 1 M e, em seguida, ajustar o volume final para 20 μL com dH₂O. Aquecer todas as amostras, incluindo as do passo 6.9, durante 5 minutos a 98 °C.
2. Coloque as amostras em um gel sem coloração TGX a 10% e carregue as escadas de proteína de acordo com as recomendações do fabricante.
   OBS: Escolha a porcentagem do gel de acordo com o peso molecular da proteína de interesse.
3. Passe o gel a 100 V por ~1 h em tampão de corrida até que o corante de carga esteja na parte inferior do gel.
   OBS: O tempo de execução pode variar de acordo com o equipamento utilizado ou tipo e porcentagem de gel.
4. Imagem do gel. Imagens dos géis livres de manchas são usadas como controle de carga para immunoblots.
5. Transfira o gel usando uma membrana de PVDF por 1,5 h a 80 V ou durante a noite a 30 V a 4 °C.
6. Bloquear as membranas em tampão de bloqueio por 1 h na RT.
7. Incubar as membranas para anticorpos específicos (Tabela 2) em tampão de anticorpos durante a noite a 4 °C com agitação.
8. Lavar as membranas em tampão de lavagem e incubá-las com os anticorpos secundários apropriados (Tabela 2) por 1 h na RT com agitação.
9. Lave as membranas no tampão de lavagem e visualize as membranas usando a solução revelação e um imageador baseado em câmera. Alternativamente, use um filme de raios-X para desenvolver as membranas.

Resultados

Este protocolo é adequado para a purificação de exossomos de grandes volumes de meio condicionado de forma custo-efetiva. O procedimento é altamente reprodutível e consistente. A Figura 1 mostra a imagem de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de exossomos purificados do meio de cultura de fibroblastos primários de camundongos. A Figura 2 mostra o padrão de expressão proteica dos marcadores exossômicos canônicos e a ausência de contaminantes ...

Discussão

Um passo crítico para o sucesso do isolamento dos exossomos dos meios de cultura, conforme descrito neste protocolo, é o estabelecimento e a manutenção adequados de culturas primárias de fibroblastos de camundongos do músculo esquelético adulto. Essas culturas precisam ser mantidas em um baixo nível de oxigênio para garantir condições fisiológicas (o nível de O₂ no músculo esquelético é de ~2,5%)¹⁵. Os fibroblastos primários mudam de características quando passados em ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dishes	Midwest Scientific, TPP	TP93100
15 cm dishes	Midwest Scientific	TP93150
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific, Pierce	23225
Bovine serum albumin Fraction V	Roche	10735094001
CaCl2	Sigma	C1016-100G
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11	Eppendorf	022620659/5427754008
Chemidoc MP imaging system	BioRad	12003154
Collagenase P	Sigma, Roche	11 213 857 001	100 mg
cOmplete protease inhibitor cocktail	Millipore/Sigma, Roche	11697498001
Criterion Blotter with plate electrodes	BioRad	1704070
Criterion TGX stain-free protein gel	BioRad	5678034	10% 18-well, midi-gel
Criterion vertical electrophoresis cell (midi)	BioRad	NC0165100
Dispase II	Sigma, Roche	04 942 078 001	neutral protease, grade II
Dithiothreitol	Sigma/Millipore, Roche	10708984001
Dulbecco’s Modification Eagles Medium	Corning	15-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Corning	352070
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-028
Fluostar Omega multi-mode microplate reader	BMG Labtech
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144S-500
Immobilon-P Transfer membranes	Millipore	IPVH00010
Laemmli sample buffer (4x)	BioRad	1610747
Magnesium acetate solution	Sigma	63052-100ml
Non-fat dry milk	LabScientific	M-0842
O2/CO2 incubator	Sanyo	MC0-18M
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122	10,000 U/ml
Premium microcentrifuge tubes	Fisher Scientific, Midwest Scientific	AVSC1510	1.7 mL
Protected disposable scalpels	Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker	372610
Running buffer	BioRad	1610732
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S271-3
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system	Millipore	S2GPU05RE	500 mL
Sterile cell strainer (70 mm)	Fisher Scientific, Fisher brand	22-363-548
Sucrose	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S5-500
SuperSignal west Femto	Thermo Fisher Scientific	34096
Thin wall Polypropylene tubes	Beckman Coulter	326823
Transfer buffer	BioRad	16110734
Trichloroacetic Acid	Sigma	91228-100G
Tris base	BioRad	1610719
Triton-X100 solution	Sigma	93443-100mL
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific, Gibco	12604-013	No phenol red
Tween-20	BioRad	#1610781
Ultra-centrifuge Optima XPM	Beckman Coulter	A99842
Ultra-clear tube (14x89 mm)	Beckman Coulter	344059
Ultra-clear tubes (25x89 mm)	Beckman Coulter	344058
Water bath Isotemp 220	Fisher Scientific	FS220