Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques

Résumé

Ce protocole illustre 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir du muscle gastrocnémien de souris adulte ainsi que 2) la purification et la caractérisation des exosomes à l’aide d’une méthode d’ultracentrifugation différentielle combinée à des gradients de densité de saccharose suivis d’analyses par western blot.

Résumé

Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires libérées par pratiquement toutes les cellules et sécrétées dans tous les fluides biologiques. De nombreuses méthodes ont été développées pour l’isolement de ces vésicules, notamment l’ultracentrifugation, l’ultrafiltration et la chromatographie d’exclusion de taille. Cependant, tous ne sont pas adaptés à la purification et à la caractérisation des exosomes à grande échelle. Voici un protocole pour l’établissement de cultures de fibroblastes primaires isolés à partir de muscles squelettiques de souris adultes, suivis de la purification et de la caractérisation des exosomes à partir des milieux de culture de ces cellules. La méthode est basée sur l’utilisation d’étapes de centrifugation séquentielles suivies de gradients de densité de saccharose. La pureté des préparations exosomiques est ensuite validée par des analyses par transfert Western à l’aide d’une batterie de marqueurs canoniques (c’est-à-dire Alix, CD9 et CD81). Le protocole décrit comment isoler et concentrer des exosomes bioactifs pour la microscopie électronique, la spectrométrie de masse et les expériences d’absorption pour les études fonctionnelles. Il peut facilement être mis à l’échelle ou réduit et adapté pour l’isolement d’exosomes à partir de différents types de cellules, de tissus et de fluides biologiques.

Introduction

Les exosomes sont des vésicules extracellulaires hétérogènes dont la taille varie de 30 à 150 nm. Ils sont des acteurs clés établis dans les processus physiologiques et pathologiques, étant donné leur distribution omniprésente dans les tissus et les organes ^1,2. Les exosomes transportent une cargaison complexe de protéines, de lipides, de types d’ADN et de types d’ARN, qui varient selon le type de cellules dont ils sont dérivés ^1,2,3. Les exosomes sont enrichis en protéines qui ont des fonctions différentes (c’est-à-dire que les tétraspanines, y compris CD9 et CD63) sont responsables des événements de fusion. Par exemple, les protéines de choc thermique HSP70 et HSP90 sont impliquées dans la liaison et la présentation de l’antigène. De plus, Alix, Tsg101 et la flottilline participent à la biogenèse et à la libération des exosomes et sont largement utilisés comme marqueurs de ces nanovésicules ^2,3,4.

Les exosomes contiennent également une variété d’ARN (c’est-à-dire des microARN, de longs ARN non codants, des ARN ribosomiques) qui peuvent être transférés aux cellules réceptrices, où ils influencent la signalisation en aval³. Étant entourés d’une seule unité de membrane, la bioactivité des exosomes dépend non seulement de la cargaison de protéines et d’acides nucléiques, mais aussi des composants lipidiques de la membrane limitante¹. Les membranes exosomiques sont enrichies en phosphatidylsérine, en acide phosphatidique, en cholestérol, en sphingomyéline, en acide arachidonique et en autres acides gras, qui peuvent tous influencer la stabilité des exosomes et la topologie membranaire ^2,3. En raison de l’arrangement de la cargaison et des lipides, les exosomes initient des voies de signalisation dans les cellules réceptrices et participent au maintien d’une physiologie tissulaire normale 1,2,4,5. Dans certaines conditions pathologiques (c’est-à-dire la neurodégénérescence, la fibrose et le cancer), il a été démontré qu’ils déclenchent et propagent des stimuli pathologiques 4,6,7,8,9,10,11.

En raison de leur capacité à propager des signaux à des sites voisins ou éloignés, les exosomes sont devenus des biomarqueurs précieux pour le diagnostic ou le pronostic des maladies. De plus, les exosomes ont été utilisés expérimentalement comme véhicules de composés thérapeutiques ^2,12. L’application potentielle de ces nanovésicules en clinique rend la méthode d’isolement de plus en plus importante afin d’obtenir un rendement, une pureté et une reproductibilité maximum. Différentes techniques d’isolement des exosomes ont été développées et mises en œuvre. En général, les exosomes peuvent être isolés à partir de milieux de culture cellulaire conditionnés ou de fluides corporels par centrifugation différentielle, chromatographie d’exclusion de taille et capture immunitaire (à l’aide de kits disponibles dans le commerce). Chaque approche présente des avantages et des inconvénients uniques qui ont été discutés précédemment 1,2,13,14.

Le protocole décrit se concentre sur 1) l’isolement et la culture de fibroblastes primaires à partir de muscles gastrocnémiens de souris adultes et 2) la purification et la caractérisation des exosomes libérés dans le milieu de culture par ces cellules. Il n’existe actuellement pas de protocole bien établi pour l’isolement des exosomes des fibroblastes primaires dans le cadre d’études fonctionnelles. Les fibroblastes primaires ne sécrètent pas de grandes quantités d’exosomes, ce qui rend le processus d’isolement et de purification difficile. Ce protocole décrit la purification de grandes quantités d’exosomes purs à partir de grands volumes de culture tout en maintenant leur intégrité morphologique et leur activité fonctionnelle. Des exosomes purifiés obtenus à partir d’un milieu conditionné ont été utilisés avec succès dans des expériences d’absorption in vitro pour induire des voies de signalisation spécifiques dans les cellules réceptrices. Ils ont également été utilisés pour des analyses protéomiques comparatives de cargaisons exosomiques provenant de plusieurs échantillons biologiques⁴.

Protocole

Toutes les procédures chez la souris ont été effectuées selon des protocoles sur les animaux approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital de recherche pour enfants St. Jude et les directives des National Institutes of Health.

1. Préparation des solutions et des milieux

1. Préparer la solution de digestion en mélangeant 15,4 mL de PBS avec 2,5 mL de collagénase P à 20 mg/mL (concentration finale de 5 mg/mL), 2 mL de dispase II à 11 U/mL (concentration finale de 1,2 U/mL) et 100 μL de CaCl₂ à 1,0 M (concentration finale de 5 mM).
2. Préparer 500 mL de milieu de fibroblastes primaires (DMEM complet) en mélangeant 440 mL de DMEM avec 50 mL de FBS (10 %), 5,0 mL de stylo/streptocoque (100 U/mL et 100 μg/mL, respectivement) et 5,0 mL de supplément de glutamine (2 mM). Filtrez et stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre à vide de 0,22 μm.
3. Préparer le sérum exempt d’exosomes par ultracentrifugation de FBS pendant la nuit dans des tubes en polypropylène de 38,5 mL à 100 000 x g à 4 °C et transférer le surnageant dans un nouveau tube.
4. Préparez 500 mL de milieu exempt d’exosomes en mélangeant 440 mL de DMEM avec 50 mL de sérum sans exosomes (10 %), 5 mL de stylo/streptocoque (100 U/mL et 100 μg/mL) et 5 mL de supplément de glutamine (2 mM). Filtrez et stérilisez le milieu à l’aide d’un filtre à vide de 0,22 μm.
5. Préparer 0,5 M de Tris-HCl (pH 7,4) en dissolvant 6,057 g de base de Tris dans 90 mL de dH 2 O et en ajustant le pH à 7,4 avec HCl. Régler le volume à 100 mL avec dH₂O.
6. Préparer une solution de 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM de Mg(Ac)2 (solution de travail du saccharose) en mélangeant 97,9 mL de dH 2 Oavec 2 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH = 7,4) et 100 μL de 1 M Mg(Ac)₂. Ajoutez des inhibiteurs de protéase à la solution juste avant l’utilisation et conservez la solution sur de la glace.
7. Préparer des solutions de gradient de densité de saccharose sur de la glace conformément au tableau 1. Ces solutions sont suffisantes pour préparer deux tubes de gradient de saccharose.
8. Préparez 100 % de TCA en ajoutant 40 mL de dH₂O à 100 g de poudre de TCA et mélangez jusqu’à dissolution complète. Réglez le volume final avec dH₂O à 100 mL.
9. Préparer de l’éthanol à 80 % en mélangeant 20 mL de dH₂O avec 80 mL d’éthanol à 100 %.
10. Préparer le tampon de Western Blot en mélangeant 1,8 L de dH₂O avec 200 mL de tampon de fonctionnement 10x.
11. Préparer le tampon de transfert Western Blot en mélangeant 1,4 L de dH₂O avec 200 mL de tampon de transfert 10x et 400 mL de méthanol. Prérefroidir le tampon de transfert à 4 °C.
12. Préparer 20 fois une solution saline tamponnée Tris (TBS) en dissolvant 122 g de base Tris et 180 g de chlorure de sodium dans 850 mL de dH₂O (pH 8,0). Réglez le volume à 1 L avec dH₂O.
13. Préparer le tampon de blocage en dissolvant 5 g de lait écrémé en poudre avec 1 mL de Tween-20 à 10 %, 5 mL de 20x TBS et 94 mL de dH₂O.
14. Préparer le tampon d’anticorps en dissolvant 3 g de BSA avec 1 mL de Tween-20 à 10 %, 5 mL de 20x TBS et 94 mL de dH₂O.
15. Préparer le tampon de lavage en mélangeant 100 mL de 20x TBS et 20 mL de 10% Tween-20 (10x) avec 1,88 L de dH₂O.
16. Préparer la solution de développement en mélangeant 1 volume de luminol/enhance avec 1 volume de tampon de peroxyde stable.

2. Dissection du muscle gastrocnémien (GA) de la souris^15,16

1. Préparer des tubes de 50 ml contenant 10 ml de PBS sur glace.
2. Euthanasier les souris dans une chambre de CO₂ suivie d’une luxation cervicale.
3. Retirez le muscle gastrocnémien des deux jambes et transférez-les dans le tube avec PBS sur glace.
   REMARQUE : Retirez le muscle soléaire du muscle GA avant de transférer le muscle GA au PBS.

3. Isolement et culture de fibroblastes primaires de souris

1. Pesez les muscles et transférez-les dans un plat de 10 cm sous une hotte de biosécurité. Hachez les muscles avec des scalpels jusqu’à ce qu’ils deviennent une pâte fine.
2. Transférez la pâte musculaire finement hachée dans un tube de 50 mL et ajoutez 3,5 fois le volume/mg de tissu de solution de digestion dans le tube et incubez pendant 45 min à 37 °C. Bien mélanger la suspension à l’aide d’une pipette de 5 ml toutes les 10 minutes (cela facilitera la dissociation complète).
   REMARQUE : Alternativement, un dissociateur tissulaire peut être utilisé pour cette étape.
3. Ajouter 20 mL de DMEM complet à la suspension cellulaire pour inactiver la solution de digestion. Transférer dans une crépine en nylon de 70 μm placée sur un tube de 50 ml. Recueillir l’écoulement et laver la crépine cellulaire avec 5 mL supplémentaires de DMEM complet.
4. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g à température ambiante (RT) pendant 10 min et retirer délicatement le surnageant.
5. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL de DMEM complete et ensemencer les cellules dans une boîte de 10 cm.
6. Cultiver les cellules à 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O₂ (passage 0 ou P0).
   REMARQUE : 1) Ces cultures doivent être maintenues à un faible niveau d’oxygène pour garantir des conditions physiologiques similaires (le niveau d’O 2 dans le muscle squelettique est d’environ_2,5 %)¹⁷. 2) Le numéro de passage (p. ex., P0) d’une culture cellulaire est un enregistrement du nombre de fois où la culture a été sous-cultivée. 3) Les fibroblastes primaires à P0 sont systématiquement cultivés jusqu’à 100% de confluence plus 1 jour (et seulement pour P0). Il s’agit de purger d’autres types de cellules et de s’assurer que les cellules présentes dans la culture ne sont que des fibroblastes, appauvris en cellules myogéniques sur la base d’un examen au microscope. Le muscle squelettique d’un animal adulte à l’âge de 2 mois contient environ 2 % de progéniteurs myogéniques⁴. De plus, les progéniteurs myogéniques ne se fixent généralement pas aux plats non enrobés ; Par conséquent, ils sont perdus lors de la sous-culture^18,19,20. Les cellules myogéniques ont besoin d’un milieu différent (F10) complété par 20 % de FBS et de facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)¹⁸. Dans le DMEM complet, les fibroblastes moyens ont un taux de prolifération plus élevé que les cellules myogéniques, ce qui entraîne l’élimination de ces cellules contaminantes avant le premier passage.
7. Rincez les cellules P0 avec du PBS lorsqu’elles sont confluentes à 100 % plus 1 jour. Ajouter 1 mL de solution de trypsinisation et incuber à 37 °C, 5 % de CO 2, 3 % d’O₂ pour détacher les cellules. Arrêtez l’activité enzymatique en utilisant 10 mL de DMEM complet.
8. Centrifuger les alvéoles à 300 x g pendant 10 min à RT et remettre en suspension la pastille dans 20 mL de DMEM complet et semer dans un plat de 15 cm (passage 1 ou P1). Les cellules sont cultivées jusqu’à 80 % à 90 % de confluence et peuvent être étendues jusqu’au passage 3.
   NOTE : Selon les expériences en aval, le passage 1, le passage 2 (P2) ou le passage 3 (P3) peuvent être utilisés.

4. Ensemencement des cellules et collecte du milieu conditionné

1. Laver les fibroblastes (P1, P2 ou P3) avec 10 mL de PBS, ajouter 2,5 mL de solution de trypsinisation aux cellules et incuber à 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O₂. Arrêtez l’activité enzymatique en utilisant 10 mL de DMEM complet.
   REMARQUE : Après le passage 4, les cellules primaires sont jetées et ne doivent pas être utilisées pour d’autres expériences, car elles changent de caractéristiques.
2. Recueillir les cellules et centrifuger à 300 x g à RT pendant 10 min.
3. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu exempt d’exosomes et compter les cellules.
4. Ensemencer les cellules à raison de 1,5–2,0 x 10⁶ cellules par boîte (15 cm) et incuber à 37 °C, 5 % CO 2, 3 % O₂.
5. Recueillir le milieu conditionné entre 16 et 24 h dans des tubes de 50 ml sur de la glace.
   REMARQUE : Si les cellules ne sont pas confluentes à 80 %, un milieu libre exosomal frais peut être ajouté à nouveau et recueilli après une période supplémentaire de 16 à 24 h. Les deux collections peuvent être combinées pour un traitement ultérieur.

5. Purification des exosomes par centrifugation différentielle et ultra-centrifugation

REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à 4 °C ou sur de la glace. Équilibrez le tube avec un tube rempli d’eau si nécessaire.

1. Centrifuger le milieu conditionné à 300 x g pendant 10 min pour éliminer les cellules vivantes et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL.
2. Éliminer les cellules mortes par centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min et transférer le surnageant dans un tube en polypropylène de 38,5 mL.
3. Centrifuger le surnageant à 10 000 x g pendant 30 min pour l’élimination des organites, des corps apoptotiques et des fragments de membrane. Transvaser le surnageant dans un tube ultra-transparent de 38,5 ml.
4. Ultracentrifuger le surnageant à 100 000 x g pendant 1,5 h pour granuler les exosomes.
5. Jetez soigneusement le surnageant, en laissant environ 1 mL de milieu conditionné, et lavez la pastille d’exosome dans un volume total de 30 mL de PBS glacé.
6. Centrifuger à 100 000 x g pendant 1,5 h et éliminer soigneusement le surnageant par pipetage, en veillant à ne pas perturber la pastille exosomale.
7. Remettre la pastille en suspension dans du PBS glacé (~25 μL par plat de 15 cm) et mesurer la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA et d’un lecteur de microplaques à 562 nm.
   REMARQUE : La concentration en protéines est mesurée par une dilution 1 :2 avec 0,1% de Triton-X100 dans dH₂O. Le rendement des exosomes d’une boîte de 15 cm (20 mL de milieu conditionné) de fibroblastes primaires à 80 % de confluence est de ~3–4 μg.

6. Caractérisation des exosomes par gradient de densité de saccharose

1. Charger le gradient de saccharose dans un tube ultra-clair de 13 mL en pipetant (de bas en haut) les éléments suivants : 1,5 mL de 2,0 M, 2,5 mL de 1,3 M, 2,5 mL de 1,16 M, 2,0 mL de 0,8 M et 2,0 mL de solutions de saccharose 0,5 M.
2. Mélangez 30 à 100 μg d’exosomes avec une solution de saccharose à 0,25 M et ajustez le volume à 1 mL.
3. Chargez soigneusement les exosomes au-dessus des gradients et ultra-centrifugez les échantillons pendant 2,5 h à 100 000 x g et 4 °C.
4. Retirez les tubes de l’ultra-centrifugeuse et placez-les sur de la glace et collectez des fractions de 1,0 ml en commençant par le haut du gradient. Transférez-les dans des tubes de 1,7 ml sur de la glace.
5. Ajouter 110 μL de TCA à 100 % dans chaque tube, bien mélanger et incuber pendant 10 min à RT.
6. Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g et RT et jeter soigneusement le surnageant.
7. Remettre le granulé en suspension dans 500 μL d’éthanol 80 % pré-refroidi et laisser les échantillons à laver pendant 10 min à -20 °C.
8. Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g et 4 °C et jeter le surnageant.
9. Séchez la pastille pendant 10 à 15 minutes à RT et remettez-la en suspension dans du PBS pour des expériences in vitro. Mesurer la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA ou remettre la pastille en suspension directement dans 14,5 μL de dH₂O, 5 μL de tampon Laemmli 4x et 0,5 μL de DTT 1 M pour les analyses par transfert Western.

7. Détection d’exosomes par Western blot

1. Mélanger 5 à 10 μg d’exosomes de l’étape 5.7 avec 5 μL de tampon Laemmli 4x et 0,5 μL de DTT 1 M, puis ajuster le volume final à 20 μL avec dH₂O. Chauffer tous les échantillons, y compris ceux de l’étape 6.9, pendant 5 min à 98 °C.
2. Chargez les échantillons dans un gel anti-taches TGX à 10 % et chargez les échelles de protéines selon les recommandations du fabricant.
   REMARQUE : Choisissez le pourcentage du gel en fonction du poids moléculaire de la protéine d’intérêt.
3. Faire fonctionner le gel à 100 V pendant ~1 h dans le tampon de fonctionnement jusqu’à ce que le colorant de charge se trouve au fond du gel.
   REMARQUE : La durée d’exécution peut varier en fonction de l’équipement utilisé ou du type et du pourcentage de gel.
4. Imagez le gel. Les images des gels sans taches sont utilisées comme contrôle de la charge pour les immunoblots.
5. Transférer le gel à l’aide d’une membrane PVDF pendant 1,5 h à 80 V ou toute la nuit à 30 V à 4 °C.
6. Bloquer les membranes dans le tampon de blocage pendant 1 h à RT.
7. Incuber les membranes pour des anticorps spécifiques (tableau 2) dans un tampon d’anticorps pendant une nuit à 4 °C avec agitation.
8. Laver les membranes dans un tampon de lavage et incuber les membranes avec les anticorps secondaires appropriés (tableau 2) pendant 1 h à RT avec agitation.
9. Lavez les membranes dans un tampon de lavage et imagez les membranes à l’aide d’une solution de développement et d’un imageur basé sur une caméra. Vous pouvez également utiliser un film radiographique pour développer les membranes.

Résultats

Ce protocole est adapté à la purification d’exosomes à partir de grands volumes de milieu conditionné de manière rentable. La procédure est hautement reproductible et cohérente. La figure 1 montre une image de microscopie électronique à transmission (MET) d’exosomes purifiés à partir du milieu de culture de fibroblastes primaires de souris. La figure 2 montre le profil d’expression protéique des marqueurs exosomaux canoniques et l’absence de ...

Discussion

Une étape cruciale pour l’isolement réussi des exosomes des milieux de culture, telle que décrite dans ce protocole, est l’établissement et le maintien appropriés de cultures primaires de fibroblastes de souris à partir du muscle squelettique adulte. Ces cultures doivent être maintenues à un faible niveau d’oxygène pour garantir des conditions physiologiques similaires (le niveau d’O₂ dans le muscle squelettique est de ~2,5 %)¹⁵. Les fibroblastes primaires changeront de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dishes	Midwest Scientific, TPP	TP93100
15 cm dishes	Midwest Scientific	TP93150
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific, Pierce	23225
Bovine serum albumin Fraction V	Roche	10735094001
CaCl2	Sigma	C1016-100G
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11	Eppendorf	022620659/5427754008
Chemidoc MP imaging system	BioRad	12003154
Collagenase P	Sigma, Roche	11 213 857 001	100 mg
cOmplete protease inhibitor cocktail	Millipore/Sigma, Roche	11697498001
Criterion Blotter with plate electrodes	BioRad	1704070
Criterion TGX stain-free protein gel	BioRad	5678034	10% 18-well, midi-gel
Criterion vertical electrophoresis cell (midi)	BioRad	NC0165100
Dispase II	Sigma, Roche	04 942 078 001	neutral protease, grade II
Dithiothreitol	Sigma/Millipore, Roche	10708984001
Dulbecco’s Modification Eagles Medium	Corning	15-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Corning	352070
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-028
Fluostar Omega multi-mode microplate reader	BMG Labtech
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144S-500
Immobilon-P Transfer membranes	Millipore	IPVH00010
Laemmli sample buffer (4x)	BioRad	1610747
Magnesium acetate solution	Sigma	63052-100ml
Non-fat dry milk	LabScientific	M-0842
O2/CO2 incubator	Sanyo	MC0-18M
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122	10,000 U/ml
Premium microcentrifuge tubes	Fisher Scientific, Midwest Scientific	AVSC1510	1.7 mL
Protected disposable scalpels	Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker	372610
Running buffer	BioRad	1610732
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S271-3
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system	Millipore	S2GPU05RE	500 mL
Sterile cell strainer (70 mm)	Fisher Scientific, Fisher brand	22-363-548
Sucrose	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S5-500
SuperSignal west Femto	Thermo Fisher Scientific	34096
Thin wall Polypropylene tubes	Beckman Coulter	326823
Transfer buffer	BioRad	16110734
Trichloroacetic Acid	Sigma	91228-100G
Tris base	BioRad	1610719
Triton-X100 solution	Sigma	93443-100mL
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific, Gibco	12604-013	No phenol red
Tween-20	BioRad	#1610781
Ultra-centrifuge Optima XPM	Beckman Coulter	A99842
Ultra-clear tube (14x89 mm)	Beckman Coulter	344059
Ultra-clear tubes (25x89 mm)	Beckman Coulter	344058
Water bath Isotemp 220	Fisher Scientific	FS220