Circadian Entrainment من دروسوفيليا ميلانوغاستر

Summary

هنا، نحن بالتفصيل كيفية مزامنة دروسوفيلا إلى يوم circadian. هذه هي الخطوة الأولى والأهم من ذلك لدراسة الإيقاعات البيولوجية وعلم الكرونوبيولوجيا.

Abstract

تقريبا عالمية بين الكائنات الحية، إيقاعات circadian تنسيق النشاط البيولوجي لمدار الأرض حول الشمس. لتحديد العوامل التي تخلق هذا الإيقاع وفهم المخرجات الناتجة ، مطلوب entrainment من الكائنات الحية النموذجية إلى نقاط زمنية circadian محددة. هنا نحن بالتفصيل إجراء لentrain العديد من Drosophila إلى إيقاع circadian محددة. وعلاوة على ذلك، نحن تفاصيل ما بعد entrainment الخطوات لإعداد عينات من الفلورالين المناعية، وحمض نووي، أو تحليل البروتين القائم على استخراج.

Introduction

تقريبا جميع الكائنات الحية على الأرض، من أكبر وصولا إلى خلية واحدة، لديها ساعة البيولوجية الداخلية مع دورة من حوالي يوم واحد. وهذا يعرف باسم إيقاع Circadian (صاغ في عام 1953 من قبل فرانز هالبرغ من العبارات اللاتينية حوالي = حول / تقريبا و "يموت" = يوم)¹. على الرغم من أن مكونات الساعة الأساسية معروفة وآلياتها البدائية للوظيفة مفهومة ، لا يزال هناك الكثير لفهم كيفية الحفاظ على الإيقاعات البيولوجية في جميع أنحاء الجسم. الأهم من ذلك، يرتبط سوء تنظيم الإيقاعات البيولوجية مع النتائج الصحية السيئة بما في ذلك ضعف تكوين الذاكرة، واضطرابات النوم، واضطراب التأثير الموسمي، والاكتئاب، والاضطراب ثنائي القطب، والسكري، والسمنة، والتنكس العصبي، والسرطان^2،3،4،5.

دروسيليا هو نموذج راسخ للتحقيق في البيولوجيا circadian. وراثيا وكيميائيا، يتم تدريب أعداد كبيرة بسهولة (كما سيظهر). في الواقع، جميع المنشورات السبعة المذكورة كمطبوعات رئيسية للدعم في منح جائزة نوبل لاكتشاف إيقاعات circadian الاستفادة من هذه القوة من نموذج Drosophila^{6،7،8،9،10،11،12}.

بالإضافة إلى ذلك، نعرض استراتيجيات فعالة لجمع الذباب المُتَجَنَّع لأغراض إما من الفلورا المناعية، أو الحمض النووي، أو التحليل القائم على استخراج البروتين. وباستخدام هذه الاستراتيجيات، يمكن للمرء أن يعالج ويخزن كميات أكبر من العينات لتحليلها في المستقبل. هذه الأساليب مفيدة جداً في أنها قابلة للتكرار ويمكن أن تسفر عن مئات من الذباب entrained التي يمكن أن تكون جزءاً من تجمع بيانات كبيرة.

Protocol

1. يطير إنتاج الغذاء

1. لكل 1 لتر من الماء، إعداد الطعام ذبابة تتكون من 4.69 غرام من دبس الدم المجفف، 19.70 غرام من الخميرة النشطة الجافة، 87.22 غرام من وجبة الذرة و 7.83 غرام من أجار.
2. الجمع بين المحتويات المذكورة أعلاه في crockpot وتحويل الحرارة إلى 250 درجة فهرنهايت. اخلطي جيدا كما يتم إضافة المكونات.
3. الحفاظ على غطاء على crockpot كما يطير الغذاء هو التدفئة في حين خلط أيضا محتويات كل 10 دقيقة حتى تصل إلى الغليان المتداول. السماح للغلي المتداول على الاستمرار لمدة 20 دقيقة قبل إيقاف الحرارة.
4. إضافة 83.60 مل من الماء والحفاظ على غطاء من crockpot قبالة كما يبرد الطعام.
5. اخلطي درجة حرارة الطعام كل 10 دقائق مع ميزان حرارة زجاجي. تجنب السماح لطبقة من الفيلم يستقر على رأس الطعام.
6. مرة واحدة في الغذاء قد بردت إلى 60 درجة مئوية، إضافة 10.44 مل من Tegosept و 5.51 مل من حمض البرروبيونيك لكل لتر من الماء المضافة (انظر الخطوة 1.1).
7. تخلط جيدا وتدفئة تصل إلى 60 درجة مئوية لمنع الطعام من أن تصبح باردة جدا.
8. ضخ الطعام ذبابة حسب الحاجة باستخدام Droso حشو.
9. بالنسبة للقنينات الضيقة، قم بضخ 10 مل و 6 زجاجات قاع مربعة أوقية تضخ 60 مل.

2. جمع الذباب من العمر المحدد

1. رصد زجاجات من نوع البرية الذباب المخزنة في 25 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام حتى يتم إرفاق كميات كبيرة من pupa (حوالي 200 pupa) إلى جانب الزجاجة. الزجاجات المستخدمة هي 6 أوقية دروسفيلا زجاجات الأسهم مع قيعان مربع.
2. مسح البالغين الحاليين من الزجاجة. إما أن يقلب البالغين في زجاجة جديدة أو وضعها في الإيثانول بنسبة 70٪. استخدام نهاية مملة من فرشاة الطلاء #0 لدفع أي الكبار المتبقية في الطعام ذبابة. تأكد من مسح فرشاة الطلاء لأسفل مع 70٪ الإيثانول قبل وبعد الاستخدامات.
3. السماح للزجاجات مسح للجلوس لمدة 3 أيام في حاضنة 25 درجة مئوية للسماح للجيل القادم لeclose. هذه الذباب سيكون بين 0 و 3 أيام من العمر.

3. فصل الطيران

1. بعد 3 أيام، فصل الذكور عن الإناث وجمع العدد المطلوب لكل جنس لكل نقطة من النقاط الزمنية الأربعة. الذباب يمكن تمييزها حسب الجنس عن طريق فحص الأعضاء التناسلية; الذكور لديهم عتمة تقريب الأعضاء التناسلية في حين أن الإناث أخف وزنا، أكثر مدببة الأعضاء التناسلية. الإناث هي أيضا أكبر بكثير من الذباب الذكور.
   1. استخدام وسادة تخدير CO₂ لفصل فعال الذباب والتمييز بين الجنسين. نقل الذباب مع فرش الطلاء لتجنب قتلهم.
   2. جمع 100 من الذكور و100 أنثى لكل نقطة زمنية، مع 50 ذكرا لكل قارورة و 100 أنثى لكل قارورة. الذكور تميل إلى أن تكون أكثر عدوانية وتفاعلاتهم الاجتماعية تؤدي إلى الكثير من الوفيات عندما يكون هناك 100 فرد في قارورة. الإناث تصل إلى 100 فرد- لا تتأثر في حين الواردة في القارورة.
2. تنفيذ المجموعات في نقاط الوقت التالية: ZT1، ZT7، ZT13 وZT19(الجدول 1). لاحظ أن المجموعات التي يتم القيام بها في الظلام (ZT12-ZT24) حساسة للضوء في حين أن مجموعات ZT0-ZT11 يتم القيام به خلال أوقات الإضاءة وأضواء الغرفة يمكن أن تكون على. يرجى ملاحظة أنه يتم استخدام حاضتين منفصلتين مع أنماط الضوء العكسية 12 ساعة للسماح لجميع المجموعات أن تحدث خلال النهار وليس بين عشية وضحاها.
3. استخدام الذباب الزائد لإنشاء زجاجات جديدة من الذباب لentrainment في المستقبل. مكان 25 الإناث مع 5-7 الذكور في كل زجاجة جديدة ومكان في الحاضنة في 25 درجة مئوية.

4. حضانة الطيران

1. السماح للذباب بالبقاء في حاضة حاضنة منظمة لمدة 3-5 أيام للسماح entrainment circadian أن يحدث. تأكد من أن الحاضنات خفيفة الإحكام لأن حتى كميات صغيرة من التلوث الضوئي سوف تزعج entrainment.

5. تثبيت المناعة

1. بعد entrainment، وإعداد قوارير جديدة من حل التثبيت للعينات التي سيتم استخدامها ل المناعةfluorescence. قبل إزالة الذباب من الحاضنة، إضافة 4.8 مل من 4٪ الفورمالديهايد المخفف في 1X PBS + 0.1٪ Tween-20 إلى كل قارورة ضيقة جديدة لكل 100 الذباب التي سيتم التركيز عليها. كل قارورة ستضم 100 ذكر أو 100 أنثى الذباب Circadian entrained. ضع القنينات الضيقة في الثلج.

6. جمع الفلورة المناعية

1. عند جمع الذباب من الحاضنة للflufluorescence، وإزالة غطاء زجاجة وعكس بسرعة الزجاجة في القمع. الاستفادة بلطف الذباب في الحل عبر القمع للمساعدة في توجيه الذباب في القارورة; الجمع بين أنبوبين من الذكور 50 لمجموع 100 الذكور في قارورة واحدة واستخدام أنبوب واحد من 100 أنثى للقارورة الأخرى.
2. تنفيذ مجموعات ZT13 وZT19 في الظلام؛ استخدام الضوء الأحمر من أجل أن نرى كما drosophila هي أقل حساسية لهذه الأطوال الموجية الخفيفة وبالتالي فهي أقل عرضة للتلوث الضوئي¹³. بروتين كريبتيكروم، على وجه الخصوص، حساس بشكل خاص للضوء الأزرق، والتي يجب تجنبها¹⁴.
   1. للحد من التعرض للضوء، تأكد من أن غرفة المجموعة خفيفة مع أي مصادر للضوء مسدودة أو مغطاة. التفاف هذه القوارير في احباط بحيث لا يتم تعرض الذباب ZT13 وZT19 للضوء عند وضعها على خلاط nutating في الخطوة التالية. ZT1 و ZT7 الذباب ليست حساسة للضوء ويمكن وضعها على خلاط دون احباط تغطي.

7. خلاط Nutating والتخزين

1. بعد أن تم جمع الذباب، الشريط الجزء العلوي من قوارير تحتوي على تثبيت لتجنب انسكاب ووضعها على خلاط nutating في 165 دورة في الدقيقة في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. الذباب لم تعد حساسة للضوء بعد هذه الخطوة التثبيت، لذلك قد تتم إزالة احباط للتحقق من أن الحل يتحرك والذباب يجري غمرها في المثبت.
2. بعد إزالة ذبابة تحتوي على قارورة من خلاط nutating إزالة الفورمالديهايد وغسل ثلاث مرات مع 3000 ميكرولتر من 1X PBS، عكس القارورة مع كل غسل.
3. تخزين قوارير تحمل عينات مناعية في 4 درجة مئوية في انتظار المناعةfluorescence¹⁵في المستقبل .

8. جمع لاستخراج البروتين

1. إعداد أربعة أنابيب 50 مل وديوار يحتوي على النيتروجين السائل للحفاظ على عينات لاستخراج البروتين
2. لجمع الذباب لاستخراج البروتين أو الحمض النووي، نقل الذباب من الزجاجات إلى الأنبوب بنفس الطريقة كما هو الحال في الخطوة 6.1 وسرعة سقف الأنبوب لمنع إطلاق الذباب ووضع الأنبوب في النيتروجين السائل إلى التجميد المفاجئ.

9. تخزين لاستخراج البروتين

1. تخزين عينات المجمدة المفاجئة لاستخراج البروتين في -80 درجة مئوية. ويمكن معالجة هذه وفقا لبروتوكول استخراج البروتين المناسب لتحليل المصب، بما في ذلك¹⁶المناعة.

النتائج

يسمح التدريب الإيقاعي المراقب للباحثين بفحص علم الأحياء في نقاط زمنية محددة طوال اليوم الإيقاعي باستخدام جداول توقيت ZT1-ZT19 أو إضافة نقاط زمنية حسب الضرورة. هنا نستخدم الضوء والظلام لentrain الذباب إلى دورات circadian والتحقق من entrainment عن طريق تحليل المناعة و المناعةfluorescence من البروتين الفترة، علامة لentrainment circadian(الشكل 1). عند entrainment الصحيح، يجب أن يكون للبروتينات فترة كثافة مميزة ونمط التنقل (الشكل 1أ) وينبغي أن تكون مرئية في مواقع محددة في الدماغ ZT1 (الشكل 1B). على الرغم من أن المتغيرات الأخرى، بما في ذلك الغذاء ودرجة الحرارة، يمكن أن تؤثر على entrainment circadian، ضوء هو الأكثر بسيطة وموثوق بها للسيطرة على¹⁷. لغرض هذه الطرق، يتم الاحتفاظ درجات الحرارة حاضنة ثابتة، والاعتماد على الخلايا العصبية على مدار الساعة الدماغي التي تتأثر الضوء لentrainment¹⁸.

الشكل 1: التحقق من التدريب. (أ) المناعية مقتطفات الخلية كاملة أعدت من رؤوس الذباب entrained يظهر أنماط الكنسي من حركة البروتين فترة وكثافة¹⁹. 1.4 تم تحليل رؤوس الإناث من كل من أوقات Zeitgeber المشار إليها (ZT) باستخدام جسم مضاد لكل. (ب)immunofluorescence من الأدمغة entrained التي تم جمعها في ZT، حيث تم العثور على البروتين الفترة في نمط مميز (الألواح السفلية، إعادة إنشائها من Helfrich-فورستر²⁰). تظهر هي الصور التي التقطت من أقسام مختلفة من الدماغ, التقاط جميع الخلايا العصبية المتوقع أن تحتوي على بروتين الفترة في ZT1. شريط مقياس هو 40 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ZT1	ZT7	ZT13	ZT19
خفيفة بين 10 صباحاً - 10 مساءً	خفيفة بين 10 صباحاً - 10 مساءً	اظلم بين 9 صباحاً - 9 مساءً	اظلم بين 9 صباحاً - 9 مساءً
يتم جمعها في الساعة 11 صباحا بعد ساعة واحدة في ضوء	يتم جمعها في الساعة 5 مساءً بعد 7 ساعات في الضوء	جمعت في 10 صباحا بعد 1 ساعة في الظلام	تم جمعها في الساعة 4 بعد الظهر بعد 7 ساعات في الظلام

الجدول 1: ZT1-ZT19 جدول مواعيد توقيت إيقاع Circadian.

Discussion

يستخدم الباحثون هذا البروتوكول مع النجاح والاتساق. يسمح هذا الإجراء تثبيت تجمع أخذ العينات كبيرة التي يمكن تخزينها للتحليل في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك، تحافظ هذه الاستراتيجية على الأنماط العصبية الناجمة عن entrainment لفحصها في المستقبل.

التثبيت للتخزين هو عنصر رئيسي في عملية entrainment كما أنه يساعد على استقرار أنسجة الدماغ ويسمح لمزيد من الوقت لتحليل كل دماغ من تجمع البيانات وبالتالي تقليل النفايات من الأدمغة التي تفقد القدرة على البقاء بسبب سن²¹. والهدف الرئيسي هو أن circadian entrain أكبر عدد ممكن من الذباب بحيث يكون هناك مخزون مستمر متاح لتشريح الرأس وفي نهاية المطاف immunofluorescence أو استخراج البروتين لمراقبة النتائج وتحديد ما إذا كانت النتائج هي من الثقة العالية. لضمان الحفاظ على entrainment circadian من خلال التثبيت، فمن جزء لا يتجزأ من أن يتم القضاء على أي مصدر من مصادر التلوث الضوئي. عملية التثبيت يسمح لدروسوروسفيليا ليتم تخزينها مع الحفاظ على العصبية "الطابع الزمني" بحيث يمكن تشريحها في وقت لاحق وتحليلها مع عدم وجود اختلافات ملحوظة للذباب التي يتم تشريحها وخضعت للflufluorescence مباشرة بعد entrainment. لأغراض التثبيت قبل الفلورة المناعية، حدد المختبر باتساق أن الذباب قابل للحياة على الأقل لمدة شهر واحد. تثبيت لاستخراج البروتين البقع الغربية تجعل الأدمغة قابلة للحياة إلى أجل غير مسمى عند تخزينها في -80 درجة مئوية.

آخر خطوة بروتوكول حاسم هو جنس الذباب. من المهم أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بدقة حيث أن وجود كلا الجنسين في نفس القارورة قبل التثبيت يمكن أن يؤدي إلى التزاوج ، مما سيؤدي إلى ذباب جديد من عمر أصغر وفساد تحليل البروتين إذا تم فحص الذكور بطريق الخطأ بدلاً من الإناث أو العكس. بالإضافة إلى ذلك ، عند ممارسة الجنس من المهم إزالة عينات اليرقات التي يتم ربطها في بعض الأحيان بالإناث. وهذا يمنع تطوير ذرية جديدة داخل قارورة الإناث التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج فاسدة.

قد تكون الخطوة التالية لبروتوكول entrainment مع العناصر المتعلقة بتحليل البيانات. يركز البروتوكول على توطين البروتين ، ولكن إذا كانت هناك متغيرات أخرى تتأثر بـ entrainment circadian ، فيجب استكشافها من خلال طرق جديدة ، تتطلب غالبًا استخراج البروتين أو الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، هناك بروتينات أخرى من الدماغ التي قد لا تزال يمكن تحليلها عن طريق هذا البروتوكول. وقد حللت التجارب المرتبطة بالبروتوكول بعض البروتينات ولكن قائمة الجينات والبروتينات التي تلعب دورا في البيولوجيا الإيقاعية لم تستنفد بعد. البروتوكول فعال في تحقيق هدف إنشاء إيقاع circadian ، ومع ذلك ، فإن التطبيقات واسعة النطاق.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-1000uL pipette	Eppendorf	ES-1000
10-100uL pipette	Eppendorf	ES-100
16% Paraformaldehyde Solution	15710
1X PBS	Caisson Labs	PBL01-6X100ML
Agar	Fisher Scientific	BP1423500
Anesthesia Filter Connection Kit	World Precision Instruments	EZ-251A
Corn meal	Genesee Scientific	62-100
Dried Molasses	Food Service Direct	OT280504
Droso-filler Food Pump	geneseesci.com	59-169
Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs	geneseesci.com	32-130BF
Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk	geneseesci.com	32-118SB
Dry active yeast	Genesee Scientific	62-103
Ethanol	IBI Scientific	IB15720
EZ Basic Anesthesia System	World Precision Instruments	EZ-175
Falcon Centrifuge tubes	Corning	352097
Falcon round bottom tubes	Corning	352057
Fine point Sharpie marker	Sharpie	30001
Fisherbrand Nutating Mixer	Fisher Scientific	88-861-043
Flugs-Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102
Glass Thermometer	Cole-Palmer	EW-08008-12
Liquid nitrogen hose	Thermo Scientific	398202
Liquid nitrogen tank-Dewar	Cooper Surgical Inc	900109-1
Liquid nitrogen transfer vessel	Electron Mircoscopy Sciences	61891-02
Paintbrushes(Red Sable) Size #0	Electro Microscopy Sciences	66100-00	This is used to separate the flies via sex without causing injury.
Plastic funnel	Plews and Edelmann	570-75-062
Polarizing light microscope	Microscope Central	1100100402241	Used to more clearly view Drosophila during sexing
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-100U
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-1M
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-5M
Propionic Acid	Sigma Aldrich	P1386-1L
Rayon Balls	Genesee Scientific	51-100
Reynolds wrap standard aluminum foil	Staples	1381273
Roaster Oven (Crockpot)	Hamilton Beach	32950
Scotch 810 Magic Tape	Electron Microscopy Sciences	77300
Spray bottle with trigger	US Plastic	66446	Used to spray ethanol to clean work bend areas
Tegosept	Genesee Scientific	20-258
Thermo Scientific Drosophila Incubator	Thermo Scientific	3990FL
Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge	ThermoFisher Scientific	REL7504D
Thermo Scientific Revco Lab Freezer	ThermoFisher Scientific	REL7504A
Tween 20	Anatrace	T1003-1-GA