היממה של דרוסופילה מלנוגסטר

Summary

כאן, אנו מפרטים כיצד לסנכרן את דרוסופילה ליום ביולוגי. זהו הצעד הראשון והחשוב ביותר הנחוץ ללימוד מקצבים ביולוגיים ותרונוביולוגיה.

Abstract

כמעט אוניברסלי בין אורגניזמים, מקצבים ביולוגיים לתאם פעילות ביולוגית למסלול של כדור הארץ סביב השמש. כדי לזהות גורמים היוצרים קצב זה ולהבין את הפלטים המתווצרים, נדרשת צורך בהתענות של אורגניזמים מודלים לנקודות זמן ביולוגיות מוגדרות. כאן אנו מפרטים הליך להדרך Drosophila רבים לקצב היממה מוגדר. יתר על כן, אנו מפרטים שלבים לאחר ההתעמלות כדי להכין דגימות עבור immunofluorescence, חומצה גרעין, או ניתוח מבוסס מיצוי חלבון.

Introduction

כמעט לכל האורגניזמים על פני כדור הארץ, מהגדול ביותר ועד לתא יחיד, יש שעון ביולוגי פנימי עם מחזור של יום אחד. זה ידוע בשם השעון הביולוגי (טבע בשנת 1953 על ידי פרנץ Halberg מן המונחים הלטיניים circa = על / בערך ו "מת" = יום)^1. למרות שמרכיבים של שעון הליבה ידועים ומנגנוני התפקוד הבסיסיים שלהם מושגים, עדיין יש הרבה מה להבין על איך מקצבים ביולוגיים נשמרים בכל הגוף. חשוב לציין, רגולציה שגויה של מקצבים ביולוגיים קשורה לתוצאות בריאותיות גרועות כולל היווצרות זיכרון לקוי, הפרעות שינה, הפרעה השפעה עונתית, דיכאון, הפרעה דו קוטבית, סוכרת, השמנת יתר, ניוון עצבי,^{וסרטן 2,,3,,4,5}.

Drosophila הוא מודל מבוסס היטב לחקירה של הביולוגיה היממה. ניתן להסבת גנטית וביוכימית, מספרים גדולים מאומנים בקלות (כפי שיהיה מוצג). למעשה, כל שבעת הפרסומים שצוטטו כפרסומים מרכזיים של תמיכה בהענקת פרס נובל לגילוי מקצבים ביולוגיים מינפו את החוזקות הללו של^{דרוסופילה מודל 6,,7,,8,,9,,10,,11,,12}.

בנוסף, אנו מציגים אסטרטגיות יעילות לאיסוף זבובים מאולפים למטרות של אימון מלוד, חומצה גרעין, או ניתוח מבוסס מיצוי חלבונים. באמצעות אסטרטגיות אלה, ניתן לעבד ולאחסן כמויות גדולות יותר של דגימות לניתוח בעתיד. שיטות אלה הן יתרון מאוד בכך שהם לשחזור יכול להניב מאות זבובים מיומנים שיכולים להיות חלק מ מאגר נתונים גדול.

Protocol

1. פליי ייצור מזון

1. לכל 1 L של מים, להכין מזון זבובים המורכב 4.69 גרם של מולסה מיובשת, 19.70 גרם של שמרים פעילים יבשים, 87.22 גרם של ארוחת תירס ו 7.83 גרם אגר.
2. שלבו את התוכן המפורט לעיל ב- crockpot והפכו את החום ל- 250°F. מערבבים היטב את המרכיבים.
3. יש לשמור את המכסה על התערה בזמן שהמזון המעופף מתחמם תוך כדי ערבוב התוכן כל 10 דקות עד שהוא מגיע לרתיחה מתגלגלת. מניחים לרתיחה המתגלגלת להימשך 20 דקות לפני כיבוי החום.
4. מוסיפים 83.60 מ"ל מים ושמור על מכסה התרגרות כשהמזון מתקרר.
5. מערבבים ומתוקלטים את טמפרטורת המזון כל 10 דקות עם מדחום זכוכית. הימנעו מלתת לשכבת פילם להתיישב על גבי האוכל.
6. לאחר שהמזון התקרר ל-60°C, הוסף 10.44 מ"ל של Tegosept ו-5.51 מ"ל של חומצה פרופיונית לליטר מים (ראה שלב 1.1).
7. מערבבים היטב והופכים את החום ל-60 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהמזון להיות קריר מדי.
8. לשאוב את מזון לטוס לפי הצורך באמצעות מילוי Droso.
9. עבור בקבוקונים צרים, משאבה 10 מ"ל עבור 6 oz בקבוקים תחתית ריבוע משאבה 60 מ"ל.

2. איסוף זבובים בגיל מוגדר

1. צג בקבוקים מסוג בר זבובים מאוחסנים ב 25 ° C במשך 5-7 ימים עד כמויות גדולות של גלם (כ 200 גופה) מחוברים לצד של הבקבוק. הבקבוקים המשמשים הם 6 oz בקבוקי מלאי Drosophila עם תחתית מרובעת.
2. נקה מבוגרים קיימים מהבקבוק. או להטות את המבוגרים לבקבוק חדש או למקם אותם ב-70% אתנול. השתמש בקצה המשעמם של #0 צבע כדי לדחוף את כל המבוגרים הנותרים לתוך האוכל לטוס. הקפד לנגב את מברשת הצבע עם 70% אתנול לפני ואחרי שימושים.
3. אפשרו לבקבוקים נקיים לשבת במשך 3 ימים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לדור הבא להתקלקל. זבובים אלה יהיו בני 0 עד 3 ימים.

3. הפרדת זבובים

1. לאחר 3 ימים, להפריד זכרים מן הנקבות ולאסוף את המספר הרצוי עבור כל מין עבור כל אחת מארבע נקודות הזמן. זבובים יכולים להיות מבדילים על ידי מין על ידי בדיקת איברי מין; לזכרים יש איברי מין מעוגלים כהים ואילו לנקבות יש איברי מין בהירים ומחודדים יותר. הנקבות גם הרבה יותר גדולות מזבובים זכרים.
   1. השתמש כרית הרדמה CO₂ כדי להפריד ביעילות את הזבובים ולהבדיל בין המינים. להזיז את הזבובים עם מברשות צבע כדי למנוע להרוג אותם.
   2. לאסוף 100 זכרים ו 100 נקבות עבור כל נקודת זמן, עם 50 זכרים לכל בקבוקון ו 100 נקבות לכל בקבוקון. זכרים נוטים להיות אגרסיביים יותר והאינטראקציות החברתיות שלהם להוביל הרבה מקרי מוות כאשר יש 100 אנשים במבעון. הנקבות, עד 100 אנשים, אינן מושפעות בזמן שהן נמצאות במבעון.
2. בצע את האוספים בנקודות הזמן הבאות: ZT1, ZT7, ZT13 ו- ZT19 (טבלה 1). שים לב כי אוספים המנוונים בחושך (ZT12-ZT24) רגישים לאור ואילו אוספי ZT0-ZT11 נעשים בשעות תאורה ואורות החדר עשויים להיות דולקים. אנא שימו לב כי שתי אינקובטורים נפרדים משמשים עם דפוסי אור הפוכים של 12 שעות כדי לאפשר לכל האוספים להתרחש במהלך היום ולא בלילה.
3. השתמשו בזבובים עודפים כדי ליצור בקבוקי זבובים חדשים לאמוניה עתידית. מניחים 25 נקבות עם 5-7 זכרים בכל בקבוק חדש וממקמים באינקובטור ב-25°C.

4. דגירה זבובים

1. לאפשר לזבובים להישאר באינקובטורים מוסדרים אור במשך 3-5 ימים כדי לאפשר את ההמולה היממה להתרחש. ודא כי האינקובטורים הם אור הדוק כי אפילו כמויות קטנות של זיהום אור יפריעו לאמוניה.

5. קיבעון אימונו-השפלה

1. לאחר אימון, להכין בקבוקונים חדשים של פתרון קיבעון עבור דגימות שישמשו עבור immunofluorescence. לפני הסרת הזבובים מהאינקובטור, להוסיף 4.8 מ"ל של 4% פורמלדהיד מדולל 1x PBS + 0.1% Tween-20 לכל בקבוקון צר חדש עבור כל 100 זבובים כי הם להיות מקובע. כל בקבוקון יכן 100 זבובים זכרים או 100 נקבות היממה. מניחים את הבקבוקונים הצרים בקרח.

6. אוסף אימונולוסיות

1. בעת איסוף הזבובים מהאינקובטור לצורך אימונופלואורסצנטי, הסירו את פקק הבקבוק והפכו במהירות את הבקבוק למשפך. תקיש בעדינות את הזבובים לתוך התמיסה דרך המשפך כדי לעזור להנחות את הזבובים לתוך הבקבוקון; לשלב שני צינורות של 50 זכרים עבור סך של 100 זכרים במבחנה אחת ולהשתמש בצינור יחיד של 100 נקבות עבור הבקבוקון השני.
2. בצע אוספי ZT13 ו- ZT19 בחושך; השתמשו באור אדום כדי לראות כמו drosophila הם הרבה פחות רגיש לאורכי גל אור אלה ולכן נוטים פחות זיהום אור¹³. חלבון קריפטוכרום, בפרט, רגיש במיוחד לאור כחול, אשר יש להימנע^14.
   1. כדי להפחית את החשיפה לאור, ודא שחדר האיסוף יהיה בהיר עם מקורות אור חסונים או מכוסים. עטו בקבוקונים אלה בנייר כסף כך שזבובי ZT13 ו-ZT19 לא ייחשפו לאור כאשר הם מונחים על מערבל האגוזים בשלב הבא. זבובי ZT1 ו-ZT7 אינם רגישים לאור ותוכלים למצוא ם על המיקסר ללא כיסוי נייר כסף.

7. מערבל ואחסון Nutating

1. לאחר איסוף הזבובים, הדביקו את החלק העליון של הבקבוקונים המכילים קיבעון כדי למנוע שפיכה והניחו אותם על מערבל האגוזים ב-165 סל"ד ב-4°C למשך 4 שעות. הזבובים כבר אינם רגישים לאור לאחר שלב קיבעון זה, כך שנייר הכסף עשוי להיות מוסר כדי לוודא שהפתרון זז וזבובים שקועים במתקן.
2. לאחר הסרת הזבוב המכיל בקבוקונים מערבל אגוז להסיר את הפורמלדהיד ולשטוף שלוש פעמים עם 3,000 μL של 1x PBS, היפוך הבקבוקון עם כל שטיפה.
3. אחסן את הבקבוקונים הנושאים דגימות אימונו-לורה ב-4°C כדי להמתין^{ל-15 מעלות.}

8. איסוף להפקת חלבונים

1. הכן ארבעה צינורות 50 מ"ל וDewar המכיל חנקן נוזלי לשימור דגימות להפקת חלבון
2. לאיסוף זבובים להפקת חלבון או חומצה נוקלית, להעביר זבובים מהבקבוקים לצינור באותו אופן כמו בשלב 6.1 במהירות לכסות את הצינור כדי למנוע את שחרורו של זבובים ולמקם את הצינור לתוך חנקן נוזלי כדי להקפיא הצמד.

9. אחסון להפקת חלבונים

1. לאחסן דגימות קפואות להפקת חלבונים ב-80°C. אלה יכולים להיות מעובדים על פי פרוטוקול הפקת חלבון המתאים לניתוח במורד הזרם, כולל immunoblotting¹⁶.

תוצאות

אימונים ביולוגיים מבוקרים מאפשרים לחוקרים לבחון ביולוגיה בנקודות זמן ספציפיות במהלך היום הביולוגי באמצעות לוחות הזמנים של התזמון ZT1-ZT19 או להוסיף נקודות זמן במידת הצורך. כאן אנו משתמשים באור וחושך כדי להעיר זבובים למחזורים היממה ולאמת את ההתעוות על ידי ניתוח אימונופולוטס וחיסונים של החלבון התקופתי, סמן להמולה ביולוגית(איור 1). עם ההתגייסות הנכונה, חלבונים תקופתיים צריכים להיות בעלי עוצמהוניידות אופייניים (איור 1א')ויש לראותם במקומות ספציפיים במוח ZT1(איור 1ב'). למרות משתנים אחרים, כולל מזון וטמפרטורה, יכולים להשפיע על ההמולה היממה, האור הוא הפשוט ביותר ואמין לשלוט¹⁷. לצורך שיטות אלה, טמפרטורות האינקובטור נשמרות קבועות, תוך הסתמכות על תאי עצב של שעון מוחי המושפעים על ידי אור לארופה¹⁸.

איור 1: אימות של תמלילת. (א)Immunoblotting של תמציות תאים שלמים שהוכנו מראשי זבובים מיומנים מראה דפוסים כנוניים של ניידות חלבון תקופתית ועוצמה^19. 1.4 ראשים נשיים מכל אחד מהזמני Zeitgeber המצוינים (ZT) נותחו באמצעות נוגדן נגד פר. (ב)אימונופלואורסצנציה של מוחות מיומנים שנאספו ב ZT, שם חלבון תקופתי נמצא בתבנית אופיינית (לוחות תחתונים, מחדש מן הלפריץ'-פורסטר^20). מוצגות תמונות שצולמו מחלקים שונים של המוח, לכידת כל הנוירונים צפוי להכיל חלבון תקופה ב ZT1. סרגל קנה מידה הוא 40 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

ZT1 (1)	ZT7 (119)	ZT13 (13)	ZT19 (19)
אור בין השעות 10:00-22:00	אור בין השעות 10:00-22:00	חושך בין השעות 09:00-21:00	חושך בין השעות 09:00-21:00
נאסף בשעה 11:00 לאחר שעה אחת באור	נאסף בשעה 17:00 לאחר 7 שעות באור	נאסף בשעה 10:00 לאחר שעה בחושך	נאסף בשעה 16:00 לאחר 7 שעות בחושך

טבלה 1: ZT1-ZT19 לוחות זמנים לתזמון שעון ביולוגי.

Discussion

החוקרים משתמשים בפרוטוקול תדרם זה עם הצלחה ועקביות. הליך זה מאפשר קיבעון של מאגר דגימה גדול שניתן לאחסן לניתוח עתידי. בנוסף, אסטרטגיה זו משמרת את הדפוסים הנוירולוגיים המושרים על ידי תחומים לבדיקה עתידית.

קיבעון לאחסון הוא מרכיב מרכזי של תהליך ההתעקמה כפי שהוא עוזר לייצב את רקמת המוח וזה מאפשר יותר זמן לנתח כל מוח ממאגר הנתונים ובכך למזער פסולת ממוח שמאבדים את הכדאיות^{בשל גיל 21}. המטרה העיקרית היא להסית כמה שיותר זבובים, כך שיש מלאי רציף זמין עבור דיסטוריראש ובסופו של דבר immunofluorescence או חלבון מיצוי כדי לבחון את הממצאים ולקבוע אם התוצאות הן של ביטחון גבוה. כדי להבטיח כי ההמולה היממה נשמרת באמצעות קיבעון, זה חלק בלתי נפרד כי כל מקור של זיהום אור מחוסל. תהליך קיבעון מאפשר Drosophila להיות מאוחסן תוך שמירה על "מכתם הזמן" הנוירולוגי שלה, כך שהם יכולים להיות לנתח מאוחר יותר וניתח ללא הבדלים מורגש זבובים כי הם נותחו ועברו אימון מאולפת מיד לאחר entraination. למטרות קיבעון לפני אימונו-לודרשות, המעבדה קבעה בעקביות כי זבובים הם קיימא לפחות עד חודש אחד. קיבעון עבור הפקת חלבון כתם המערבי להפוך את המוח קיימא ללא הגבלת זמן כאשר מאוחסנים ב -80 ° C.

צעד קריטי נוסף הוא סקסינג של הזבובים. חשוב כי צעד זה נעשה במדויק כמו שיש שני המינים באותו בקבוקון לפני קיבעון יכול להוביל הזדווגות, אשר יניב זבובים חדשים כי הם בגיל צעיר ניתוח חלבון מושחת אם זכרים נבדקים בטעות במקום נקבות או להיפך. בנוסף, כאשר sexing חשוב להסיר דגימות זחלים כי הם לפעמים מחוברים לנקבות. זה מונע את התפתחותו של צוויה חדשה בתוך הבקבוקון הנשי שעלול להשחית תוצאות.

השלב הבא עבור פרוטוקול ההתעוות עשוי להיות עם פריטים הקשורים לניתוח נתונים. המוקד של הפרוטוקול הוא ליקוטליזציה של חלבון, אבל אם יש משתנים אחרים מושפעים על ידי הכשרה היממה, הם חייבים להיחקר דרך שדרות חדשות, לעתים קרובות הדורשים חלבון או שאיבת חומצה גרעין. בנוסף, ישנם חלבונים אחרים של המוח כי עדיין ניתן לנתח באמצעות פרוטוקול זה. הניסויים הקשורים בפרוטוקול ניתחו חלבונים מסוימים, אך רשימת הגנים והחלבונים המותחים תפקיד בביולוגיה היממה לא מיצתה את מצבם. הפרוטוקול יעיל בהשגת המטרה של הקמת שעון ביולוגי, עם זאת, היישומים הם רחבים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-1000uL pipette	Eppendorf	ES-1000
10-100uL pipette	Eppendorf	ES-100
16% Paraformaldehyde Solution	15710
1X PBS	Caisson Labs	PBL01-6X100ML
Agar	Fisher Scientific	BP1423500
Anesthesia Filter Connection Kit	World Precision Instruments	EZ-251A
Corn meal	Genesee Scientific	62-100
Dried Molasses	Food Service Direct	OT280504
Droso-filler Food Pump	geneseesci.com	59-169
Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs	geneseesci.com	32-130BF
Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk	geneseesci.com	32-118SB
Dry active yeast	Genesee Scientific	62-103
Ethanol	IBI Scientific	IB15720
EZ Basic Anesthesia System	World Precision Instruments	EZ-175
Falcon Centrifuge tubes	Corning	352097
Falcon round bottom tubes	Corning	352057
Fine point Sharpie marker	Sharpie	30001
Fisherbrand Nutating Mixer	Fisher Scientific	88-861-043
Flugs-Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102
Glass Thermometer	Cole-Palmer	EW-08008-12
Liquid nitrogen hose	Thermo Scientific	398202
Liquid nitrogen tank-Dewar	Cooper Surgical Inc	900109-1
Liquid nitrogen transfer vessel	Electron Mircoscopy Sciences	61891-02
Paintbrushes(Red Sable) Size #0	Electro Microscopy Sciences	66100-00	This is used to separate the flies via sex without causing injury.
Plastic funnel	Plews and Edelmann	570-75-062
Polarizing light microscope	Microscope Central	1100100402241	Used to more clearly view Drosophila during sexing
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-100U
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-1M
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-5M
Propionic Acid	Sigma Aldrich	P1386-1L
Rayon Balls	Genesee Scientific	51-100
Reynolds wrap standard aluminum foil	Staples	1381273
Roaster Oven (Crockpot)	Hamilton Beach	32950
Scotch 810 Magic Tape	Electron Microscopy Sciences	77300
Spray bottle with trigger	US Plastic	66446	Used to spray ethanol to clean work bend areas
Tegosept	Genesee Scientific	20-258
Thermo Scientific Drosophila Incubator	Thermo Scientific	3990FL
Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge	ThermoFisher Scientific	REL7504D
Thermo Scientific Revco Lab Freezer	ThermoFisher Scientific	REL7504A
Tween 20	Anatrace	T1003-1-GA