Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Resumen

Aquí, detallamos cómo sincronizar Drosophila a un día circadiano. Este es el primer paso, y el más importante necesario para el estudio de los ritmos biológicos y la cronobiología.

Resumen

Casi universal entre los organismos, los ritmos circadianos coordinan la actividad biológica a la órbita terrestre alrededor del sol. Para identificar los factores que crean este ritmo y comprender las salidas resultantes, se requiere el arrastre de los organismos modelo a los puntos de tiempo circadianos definidos. Aquí detallamos un procedimiento para entrenar a muchos Drosophila a un ritmo circadiano definido. Además, detallamos los pasos posteriores al entrenamiento para preparar muestras para análisis a base de inmunofluorescencia, ácido nucleico o extracción de proteínas.

Introducción

Casi todos los organismos de la Tierra, desde el más grande hasta el de una sola célula, tienen un reloj biológico interno con un ciclo de aproximadamente un día. Esto se conoce como el ritmo circadiano (acuñado en 1953 por Franz Halberg de los términos latinos circa / aproximadamente y "muere" - día)¹. Aunque los componentes del reloj central son conocidos y sus mecanismos rudimentarios de la función conceptualizada, todavía hay mucho que entender acerca de cómo se mantienen los ritmos biológicos en todo el cuerpo. Es importante destacar que la mala regulación de los ritmos biológicos se asocia con malos resultados de salud, incluyendo mala formación de la memoria, trastornos del sueño, trastorno de afectación estacional, depresión, trastorno bipolar, diabetes, obesidad, neurodegeneración, y cáncer^2,,3,4,5.

Drosophila es un modelo bien establecido para la investigación de la biología circadiana. Genética y bioquímicamente manejable, grandes números se entrenan fácilmente (como se mostrará). De hecho, las siete publicaciones citadas como publicaciones clave de apoyo en la concesión del Premio Nobel por el descubrimiento de ritmos circadianos aprovecharon estas fortalezas del modelo Drosophila^{6,,7,8,9,10,11,12}.

Además, mostramos estrategias eficaces para recolectar moscas entrenadas para fines de inmunofluorescencia, ácido nucleico o análisis basado en extracción de proteínas. Usando estas estrategias, uno puede procesar y almacenar grandes cantidades de muestras para su análisis en el futuro. Estos métodos son muy ventajosos en el momento en que son reproducibles y pueden producir cientos de moscas entrenadas que pueden formar parte de un gran grupo de datos.

Protocolo

1. Volar la producción de alimentos

1. Por cada 1 L de agua, preparar alimentos para moscas que consistan en 4,69 g de melaza seca, 19,70 g de levadura activa seca, 87,22 g de harina de maíz y 7,83 g de agar.
2. Combine el contenido mencionado anteriormente en un crockpot y gire el calor a 250 oF. Se añaden mezclas e ingredientes.
3. Mantenga la tapa en el crockpot mientras el alimento para moscas se calienta mientras que también mezcla el contenido cada 10 minutos hasta que llegue a un hervor rodante. Deje que el hervor continúe durante 20 minutos antes de apagar el fuego.
4. Añadir 83,60 ml de agua y mantener la tapa de la olla se enfríe mientras se enfría la comida.
5. Mezclar y registrar la temperatura del alimento cada 10 minutos con un termómetro de vidrio. Evite dejar que una capa de película se asiente encima de la comida.
6. Una vez que el alimento se haya enfriado a 60 oC, añadir 10,44 ml de Tegosept y 5,51 ml de ácido propiónico por litro de agua añadido (ver paso 1.1).
7. Mezcle bien y gire el calor hasta 60 oC para evitar que los alimentos se vuelvan demasiado fríos.
8. Bombee los alimentos para moscas según sea necesario utilizando el Droso-filler.
9. Para viales estrechos, bombee 10 ml y para botellas inferiores cuadradas de 6 oz bombee 60 ml.

2. Recolectar moscas de la edad definida

1. Monitorear las botellas de moscas de tipo salvaje almacenadas a 25 oC durante 5-7 días hasta que se adhieran grandes cantidades de pupa (alrededor de 200 pupa) al lado de la botella. Las botellas utilizadas son botellas drosophila de 6 oz con fondos cuadrados.
2. Borre a los adultos existentes de la botella. O bien inclina a los adultos en una botella nueva o colóquelos en 70% etanol. Usa el extremo opaco de un pincel #0 para empujar a los adultos restantes a los alimentos para moscas. Asegúrese de limpiar el cepillo de pintura con 70% de etanol antes y después de los usos.
3. Deje que las botellas despejadas se sienten durante 3 días en una incubadora de 25 oC para permitir que la próxima generación se eclose. Estas moscas tendrán entre 0 y 3 días de edad.

3. Separación de moscas

1. Después de 3 días, separar los machos de las hembras y recoger el número deseado para cada sexo para cada uno de los cuatro puntos de tiempo. Las moscas se pueden diferenciar por sexo examinando los genitales; los machos tienen genitales redondeados oscuros, mientras que las hembras tienen genitales más claros y puntiagudos. Las hembras también son mucho más grandes que las moscas macho.
   1. Utilice una almohadilla de anestesia de CO₂ para separar eficazmente las moscas y diferenciar entre los sexos. Mueve las moscas con pinceles para evitar matarlas.
   2. Recoger 100 machos y 100 hembras por cada punto de tiempo, con 50 machos por vial y 100 hembras por vial. Los hombres tienden a ser más agresivos y sus interacciones sociales conducen a muchas muertes cuando hay 100 individuos en un vial. Las hembras-hasta 100 individuos- no se ven afectadas mientras están contenidas en el vial.
2. Realice las colecciones en los siguientes puntos de tiempo: ZT1, ZT7, ZT13 y ZT19 (Tabla 1). Tenga en cuenta que las colecciones realizadas en la oscuridad (ZT12-ZT24) son sensibles a las luces, mientras que las colecciones ZT0-ZT11 se realizan durante las horas de encendido y las luces de la habitación pueden estar encendidas. Tenga en cuenta que se utilizan dos incubadoras separadas con patrones de luz inversa de 12 horas para permitir que todas las colecciones se produzcan durante el día y no durante la noche.
3. Usa moscas sobrantes para crear nuevas botellas de moscas para futuras entrainment. Colocar 25 hembras con 5-7 machos en cada botella nueva y colocar en la incubadora a 25oC.

4. Incubación de moscas

1. Permita que las moscas permanezcan en incubadoras reguladas por la luz durante 3-5 días para permitir que se produzca el entrenamiento circadiano. Asegúrese de que las incubadoras sean ligeras porque incluso pequeñas cantidades de contaminación lumínica perturbarán el arrastre.

5. Fijación de inmunofluorescencia

1. Después del entrenamiento, preparar nuevos viales de solución de fijación para muestras que se utilizarán para la inmunofluorescencia. Antes de retirar las moscas de la incubadora, añadir 4,8 ml de 4% de formaldehído diluido en 1x PBS + 0,1% Tween-20 a cada nuevo vial estrecho por cada 100 moscas que se van a fijar. Cada vial albergará 100 moscas circadianas machos o 100 hembras circadianas. Coloque los viales estrechos en hielo.

6. Recolección de inmunofluorescencia

1. Cuando recoja las moscas de la incubadora para la inmunofluorescencia, retire la tapa del frasco e invierta rápidamente la botella en el embudo. Toque suavemente las moscas en la solución a través del embudo para ayudar a guiar a las moscas hacia el vial; combinar dos tubos de los 50 machos para un total de 100 machos en un vial y utilizar un solo tubo de 100 hembras para el otro vial.
2. Realizar colecciones ZT13 y ZT19 en la oscuridad; utilizar una luz roja para ver como drosophila son mucho menos sensibles a estas longitudes de onda de luz y por lo tanto son menos propensos a la contaminación lumínica¹³. La proteína criptocroma, en particular, es especialmente sensible a la luz azul, que debe evitarse¹⁴.
   1. Para reducir la exposición a la luz, asegúrese de que la habitación de recogida esté ligeramente apretada con cualquier fuente de luz bloqueada o cubierta. Envuelva estos viales en papel de aluminio para que las moscas ZT13 y ZT19 no se expongan a la luz cuando se coloquen en el mezclador nutating en el siguiente paso. Las moscas ZT1 y ZT7 no son sensibles a la luz y se pueden colocar en la mezcladora sin cubierta de papel de aluminio.

7. Mezclador y almacenamiento de nutating

1. Una vez recogidas las moscas, pegue la parte superior de los viales que contienen fijador para evitar derrames y colóquelos en el mezclador nutating a 165 RPM a 4 oC durante 4 h. Las moscas ya no son sensibles a la luz después de este paso de fijación, por lo que la lámina se puede quitar para verificar que la solución se está moviendo y las moscas están siendo sumergidas en el fijador.
2. Después de retirar la mosca que contiene los viales de la mezcladora nutrida, retire el formaldehído y lave tres veces con 3.000 l de 1x PBS, invirtiendo el vial con cada lavado.
3. Almacene los viales con muestras de inmunofluorescencia a 4 oC para esperar la inmunofluorescencia futura¹⁵.

8. Colección para la extracción de proteínas

1. Preparar cuatro tubos de 50 ml y un Dewar que contenga nitrógeno líquido para la preservación de muestras para la extracción de proteínas
2. Para recoger moscas para la extracción de proteínas o ácido nucleico, transfiera las moscas de las botellas al tubo de la misma manera que en el paso 6.1 y tapice rápidamente el tubo para evitar la liberación de moscas y coloque el tubo en nitrógeno líquido para congelar rápidamente.

9. Almacenamiento para la extracción de proteínas

1. Almacene las muestras congeladas para la extracción de proteínas a -80 oC. Estos pueden ser procesados de acuerdo con el protocolo de extracción de proteínas apropiado para el análisis posterior, incluyendo inmunoblotting¹⁶.

Resultados

El entrenamiento circadiano controlado permite a los investigadores examinar la biología en puntos de tiempo específicos a lo largo del día circadiano utilizando los cronogramas ZT1-ZT19 o agregar puntos de tiempo según sea necesario. Aquí utilizamos la luz y la oscuridad para entrenar moscas a los ciclos circadianos y verificar el entrete mediante el análisis de inmunoblotting e inmunofluorescencia de la proteína del período, un marcador para el entrainment circadiano (Figura 1). Tras el ajuste correcto, las proteínas de período deben tener una intensidad característica y un patrón de movilidad (Figura 1A) y deben ser visibles en lugares específicos del cerebro ZT1 (Figura 1B). Aunque otras variables, incluyendo los alimentos y la temperatura, pueden influir en el arrastreo circadiano, la luz es más simple y confiable para controlar¹⁷. A los efectos de estos métodos, las temperaturas de la incubadora se mantienen constantes, confiando en las neuronas del reloj cerebral que están influenciadas por la luz para el arrastre¹⁸.

Figura 1: Verificación del entrainment. (A) La inmunoblotting de extractos de células enteras preparadas a partir de cabezas de moscas entrenadas muestra patrones canónicos de movilidad e intensidad de proteínas de época¹⁹. Se analizaron 1,4 cabezas femeninas de cada uno de los tiempos de Zeitgeber (ZT) indicados utilizando un anticuerpo anti-Per. (B) Inmunofluorescencia de cerebros atrapados en ZT, donde la proteína Period se encuentra en un patrón característico (paneles inferiores, recreados a partir de Helfrich-Forster^20). Se muestran imágenes tomadas de diferentes secciones del cerebro, capturando todas las neuronas que se espera que contengan proteína Period en ZT1. La barra de escala es de 40 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ZT1	ZT7	ZT13	ZT19
Luz entre las 10 am - 10 pm	Luz entre las 10 am - 10 pm	Oscuro entre las 9 am - 9 pm	Oscuro entre las 9 am - 9 pm
Recogido a las 11 am después de 1 hora en la luz	Recogido a las 5 pm después de 7 horas en la luz	Recogido a las 10 am después de 1 hora en la oscuridad	Recogido a las 4 pm después de 7 horas en la oscuridad

Tabla 1: Horarios de temporización del ritmo circadiano ZT1-ZT19.

Discusión

Los investigadores utilizan este protocolo de restricción con éxito y consistencia. Este procedimiento permite la fijación de un grupo de muestreo grande que se puede almacenar para su análisis futuro. Además, esta estrategia preserva los patrones neurológicos inducidos por el arrastre para el examen futuro.

La fijación para el almacenamiento es un componente importante del proceso de entrecimiento, ya que ayuda a estabilizar el tejido cerebral y permite más tiempo para analizar cada cerebro desde el grupo de datos minimizando así los residuos de cerebros que pierden viabilidad debido a la edad^21. El objetivo principal es entrenar circadiano a tantas moscas como sea posible para que haya un inventario continuo disponible para las disecciónes de cabeza y, en última instancia, la inmunofluorescencia o la extracción de proteínas para observar los hallazgos y determinar si los resultados son de alta confianza. Para garantizar que el arrastre circadiano se conserve mediante la fijación, es integral que se elimine cualquier fuente de contaminación lumínica. El proceso de fijación permite almacenar Drosophila manteniendo su "marca de tiempo" neurológica para que puedan ser diseccionadas más tarde y analizarse sin diferencias notables con las moscas que se diseccionan y han sido sometidas a inmunofluorescencia inmediatamente después del entrenamiento. A los efectos de la fijación antes de la inmunofluorescencia, el laboratorio ha determinado con consistencia que las moscas son viables al menos hasta 1 mes. Las fijaciones para la extracción de proteínas de manchas occidentales hacen que los cerebros sean viables indefinidamente cuando se almacenan a -80 oC.

Otro paso crítico del protocolo es el sexado de las moscas. Es importante que este paso se realice con precisión, ya que tener ambos sexos en el mismo vial antes de la fijación puede conducir al apareamiento, lo que producirá nuevas moscas que son de edad más joven y análisis de proteínas corruptos si los machos son examinados accidentalmente en lugar de las hembras o viceversa. Además, al sexar es importante eliminar los especímenes de larvas que a veces están unidos a las hembras. Esto evita el desarrollo de una nueva progenie dentro del vial femenino que potencialmente podría corromper resultados.

El siguiente paso para el protocolo de restricción puede ser con elementos relacionados con el análisis de datos. El enfoque del protocolo es la localización de proteínas, pero si hay otras variables que se ven afectadas por el arrastreo circadiano, deben ser exploradas a través de nuevas vías, a menudo requiriendo extracción de proteínas o ácido nucleico. Además, hay otras proteínas del cerebro que todavía pueden ser analizadas a través de este protocolo. Los experimentos asociados con el protocolo analizaron ciertas proteínas, pero la lista de genes y proteínas que juegan un papel en la biología circadiana no se ha agotado. El protocolo es eficaz en la consecución del objetivo de establecer un ritmo circadiano, sin embargo, las aplicaciones son de amplio alcance.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-1000uL pipette	Eppendorf	ES-1000
10-100uL pipette	Eppendorf	ES-100
16% Paraformaldehyde Solution	15710
1X PBS	Caisson Labs	PBL01-6X100ML
Agar	Fisher Scientific	BP1423500
Anesthesia Filter Connection Kit	World Precision Instruments	EZ-251A
Corn meal	Genesee Scientific	62-100
Dried Molasses	Food Service Direct	OT280504
Droso-filler Food Pump	geneseesci.com	59-169
Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs	geneseesci.com	32-130BF
Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk	geneseesci.com	32-118SB
Dry active yeast	Genesee Scientific	62-103
Ethanol	IBI Scientific	IB15720
EZ Basic Anesthesia System	World Precision Instruments	EZ-175
Falcon Centrifuge tubes	Corning	352097
Falcon round bottom tubes	Corning	352057
Fine point Sharpie marker	Sharpie	30001
Fisherbrand Nutating Mixer	Fisher Scientific	88-861-043
Flugs-Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102
Glass Thermometer	Cole-Palmer	EW-08008-12
Liquid nitrogen hose	Thermo Scientific	398202
Liquid nitrogen tank-Dewar	Cooper Surgical Inc	900109-1
Liquid nitrogen transfer vessel	Electron Mircoscopy Sciences	61891-02
Paintbrushes(Red Sable) Size #0	Electro Microscopy Sciences	66100-00	This is used to separate the flies via sex without causing injury.
Plastic funnel	Plews and Edelmann	570-75-062
Polarizing light microscope	Microscope Central	1100100402241	Used to more clearly view Drosophila during sexing
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-100U
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-1M
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-5M
Propionic Acid	Sigma Aldrich	P1386-1L
Rayon Balls	Genesee Scientific	51-100
Reynolds wrap standard aluminum foil	Staples	1381273
Roaster Oven (Crockpot)	Hamilton Beach	32950
Scotch 810 Magic Tape	Electron Microscopy Sciences	77300
Spray bottle with trigger	US Plastic	66446	Used to spray ethanol to clean work bend areas
Tegosept	Genesee Scientific	20-258
Thermo Scientific Drosophila Incubator	Thermo Scientific	3990FL
Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge	ThermoFisher Scientific	REL7504D
Thermo Scientific Revco Lab Freezer	ThermoFisher Scientific	REL7504A
Tween 20	Anatrace	T1003-1-GA