Циркадная обучение Дрозофилы Меланогастер

Резюме

Здесь мы подробно, как синхронизировать Drosophila в циркадный день. Это первый и самый важный шаг, необходимый для изучения биологических ритмов и хронобиологии.

Аннотация

Почти универсальные среди организмов циркадные ритмы координируют биологическую активность на околоземной орбите вокруг Солнца. Для выявления факторов, создающих этот ритм, и для понимания полученных результатов требуется увлечение модельных организмов определенными циркадными точками времени. Здесь мы подробно процедуры для окутывать многие Drosophila в определенный циркадный ритм. Кроме того, мы подробно описаны шаги после вовлечения для подготовки образцов для иммунофторесценции, нуклеиновой кислоты или анализа на основе извлечения белка.

Введение

Почти все организмы на Земле, от крупнейших до одноклеточных, имеют внутренние биологические часы с циклом около одного дня. Это известно как циркадный ритм (придуманный в 1953 году Францем Халбергом из латинских терминов около й о/приблизительно и "умирает"^{и день) 1}. Хотя компоненты основных часов известны и их рудиментарные механизмы функции концептуализированы, есть еще много, чтобы понять о том, как биологические ритмы поддерживаются по всему телу. Важно отметить, что неправильное регулирование биологических ритмов связано с плохими результатами для здоровья, включая плохое формирование памяти, расстройства сна, сезонное расстройство влияет, депрессия, биполярное расстройство, диабет, ожирение, нейродегенерация, и рак^2,3,4,5.

Дрозофила является устоявшейся моделью для исследования циркадной биологии. Генетически и биохимически уместным, большое количество легко перенапряжены (как будет показано). В самом деле, все семь публикаций цитируется в качестве ключевых публикаций поддержки в присуждении Нобелевской премии за открытие циркадных ритмов использовали эти сильные стороны модели Drosophila^{6,7,8,9,10,11,12}.

Кроме того, мы показываем эффективные стратегии сбора поглощенных мух для целей иммунофлуоресценции, нуклеиновой кислоты или анализа на основе извлечения белка. Используя эти стратегии, можно обрабатывать и хранить большие объемы образцов для анализа в будущем. Эти методы очень выгодны тем, что они воспроизводятся и могут дать сотни поглощенных мух, которые могут быть частью большого пула данных.

протокол

1. Производство продуктов питания на лету

1. На каждые 1 л воды готовят мухомо пищу, состоящую из 4,69 г сушеной патоки, 19,70 г сухих активных дрожжей, 87,22 г кукурузной муки и 7,83 г агара.
2. Объедините содержимое, перечисленное выше, в кастрюле и поверните тепло до 250 градусов по Фаренгейту. Хорошо перемешать, как ингредиенты добавляются.
3. Держите крышку на кастрюлю, как муха пища нагревается, а также смешивания содержимого каждые 10 минут, пока не достигнет кипения. Разрешить прокатки кипения продолжать в течение 20 минут, прежде чем выключить огонь.
4. Добавьте 83,60 мл воды и держите крышку кастрюли, как пища охлаждается.
5. Смешайте и замитмите температуру пищи каждые 10 минут со стеклянным термометром. Не позволяйте слой пленки оседают на верхней части пищи.
6. После того, как пища остынет до 60 градусов по Цельсию, добавьте 10,44 мл тегосепта и 5,51 мл пропионовой кислоты на литр добавленной воды (см. шаг 1.1).
7. Хорошо перемешайте и поверните нагреть до 60 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить слишком прохладное питание.
8. Насос летать пищи по мере необходимости с помощью Droso-наполнителя.
9. Для узких флаконов, насос 10 мл и для 6 унций квадратных нижних бутылок насоса 60 мл.

2. Сбор мух определенного возраста

1. Монитор бутылки диких мух типа хранится при 25 градусов по Цельсию в течение 5-7 дней, пока большое количество куколки (около 200 куколок) прилагаются к стороне бутылки. Бутылки используются 6 унций Drosophila фондовых бутылок с квадратным дном.
2. Очистим существующих взрослых от бутылки. Либо наконечник взрослых в новую бутылку или поместите их в 70% этанола. Используйте унылый конец #0, чтобы подтолкнуть оставшихся взрослых в пищу мухи. Будьте уверены, чтобы протереть краску щеткой вниз с 70% этанола до и после использования.
3. Разрешить очищены бутылки сидеть в течение 3 дней в инкубаторе 25 градусов по Цельсию, чтобы для следующего поколения, чтобы исключить. Этим мухам будет от 0 до 3 дней.

3. Разделение мух

1. Через 3 дня отделяем самцов от самок и собираем нужное количество для каждого пола для каждого из четырех пунктов времени. Мухи могут быть дифференцированы по полу путем изучения гениталий; мужчины имеют темные округлые гениталии в то время как женщины имеют более светлые, более остроконечные гениталии. Самки также намного крупнее самцов мух.
   1. Используйте CO₂ анестезии площадку эффективно отделить мух и различать полов. Перемещение мух с краской кисти, чтобы избежать их убийства.
   2. Соберите 100 мужчин и 100 женщин для каждой точки времени, с 50 мужчин на флакон и 100 женщин на флакон. Мужчины, как правило, более агрессивным и их социальные взаимодействия приводят к много смертей, когда Есть 100 человек во флаконе. Самки до 100 особей не затрагиваются, находясь во флаконе.
2. Выполняем коллекции в следующих точках времени: NoT1, NoT7, ЗТ13 и ЗТ19(таблица 1). Обратите внимание, что коллекции, выполненные в темное время суток (ЗТ12-ЗТ24), светочувствительны, в то время как коллекции ЗТ0-ЗТ11 выполнены во время освещения и света комнаты. Обратите внимание, что два отдельных инкубатора используются с обратными 12-часовыми световыми узорами, позволяющими всем коллекциям происходить в течение дня, а не на ночь.
3. Используйте лишние мухи, чтобы создать новые бутылки мух для будущего вовренности. Поместите 25 самок с 5-7 самцами в каждую новую бутылку и поместите в инкубатор при 25 градусов по Цельсию.

4. Инкубация мух

1. Разрешить мухам оставаться в свет регулируется инкубаторов в течение 3-5 дней, чтобы циркадные увлечение происходит. Убедитесь, что инкубаторы светоемкие, потому что даже небольшое количество светового загрязнения будет беспокоить увлечение.

5. Фиксация иммунофлюоресценции

1. После заезда подготовьте новые флаконы фиксационерного раствора для образцов, которые будут использоваться для иммунофлуоресценции. Перед удалением мух из инкубатора добавьте 4,8 мл 4% формальдегида, разбавленного в 1x PBS, и 0,1% Tween-20 к каждому новому узкому флакону на каждые 100 мух, которые должны быть зациклены. Каждый флакон будет в доме 100 мужчин или 100 женщин circadian заключенных мух. Поместите узкие флаконы во льду.

6. Коллекция иммунофлуоресценции

1. При сборе мух из инкубатора для иммунофлуоресценции, удалить крышку бутылки и быстро инвертировать бутылку в воронку. Аккуратно нажмите мух в раствор через воронку, чтобы помочь направлять мух во флакон; объединить две трубки из 50 мужчин в общей сложности 100 мужчин в одном флаконе и использовать одну трубку из 100 женщин для другого флакона.
2. Выполняем коллекции Т13 и Т19 в темноте; использовать красный свет для того, чтобы увидеть, как дрозофила гораздо менее чувствительны к этим длинам волн света и, следовательно, менее склонны к световому^{загрязнению 13}. Криптохромный белок, в частности, особенно чувствителен к синему свету, которого следует^{избегать 14.}
   1. Чтобы уменьшить воздействие света, убедитесь, что комната сбора свет плотно с любыми источниками света заблокированы или покрыты. Оберните эти флаконы в фольгу так, чтобы мухи ЗТ13 и ЗТ19 не подвергались воздействию света при размещении на гайке смесителя на следующем этапе. Мухи ЗТ1 и ЗТ7 не светочувствительны и могут быть помещены на смеситель без покрытия фольгой.

7. Питательный смеситель и хранение

1. После того, как мухи были собраны, лента верхней части флаконов, содержащих фиксатор, чтобы избежать разлива и поместить их на ореховый смеситель при 165 об /мин при 4 градусов по Цельсию в течение 4 ч. Мухи больше не светочувствительны после этого шага фиксации, так что фольга может быть удалена, чтобы проверить решение движется и мухи погружаются в фиксатор.
2. После удаления мухи, содержащей флаконы из орехового смесителя удалить формальдегид и мыть три раза с 3000 йл 1x PBS, инвертирование флакона с каждой стирки.
3. Храните флаконы с образцами иммунофторесценции при 4 градусах Цельсия в ожидании будущего иммунофлюоресценции^15.

8. Сбор для извлечения белка

1. Подготовка четырех трубок объемом 50 мл и двойки, содержащей жидкий азот, для сохранения образцов для извлечения белка
2. Для сбора мух для извлечения белка или нуклеиновой кислоты, передача мух из бутылок в трубку таким же образом, как в шаге 6.1 и быстро крышка трубки, чтобы предотвратить высвобождение мух и поместить трубку в жидкий азот, чтобы оснастки заморозить.

9. Хранение для извлечения белка

1. Храните замороженные образцы для извлечения белка при -80 градусов по Цельсию. Они могут быть обработаны в соответствии с протоколом извлечения белка подходит для анализа вниз по течению, в том числе^{иммуноблоттинг 16}.

Результаты

Контролируемое циркадные обучения позволяет исследователям изучать биологию в определенных точках времени в течение циркадного дня с помощью графиков времени ЗТ1-ЗТ19 или при необходимости добавлять точки времени. Здесь мы используем свет и тьму, чтобы уведить мух до циркадных циклов и проверить увлечение иммуноблоттингом и иммунофлуоресценцией анализа белка периода, маркером циркадного обучения(рисунок 1). При правильном затренчении, период белки должны иметь характерную интенсивность и подвижность картины (Рисунок 1A) и должны быть видны в определенных местах в мозгеNo 1 (рисунок 1B). Хотя другие переменные, включая пищу и температуру, могут влиять на циркадные обучения, свет является наиболее простым и надежным для^{управления 17}. Для целей этих методов, температура инкубатора держится постоянн, полагаясь на нейроны часов мозга которые повлияно на светом для entrainment^18.

Рисунок 1: Проверка натренированности. (A)Иммуноблотирование экстрактов целых клеток, подготовленных из головок обученных мух, показывает канонические закономерности подвижности и интенсивности^{белка периода 19.} 1.4 женские головки от каждого из показанных времен zeitgeber (ЗТ) были проанализированы используя антитело anti-Per. (B) Иммунофлуоресценция перенапряженного мозга, собранного в ЗТ, где белок периода находится в характерном рисунке (нижние панели, воссозданные из Helfrich-Forster²⁰). Показаны изображения, взятые из различных разделов мозга, захватив все нейроны, как ожидается, содержат белок периода на ЗТ1. Шкала бар составляет 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

ЗТ1	ЗТ7	ЗТ13	ЗТ19
Свет с 10:00 до 22:00	Свет с 10:00 до 22:00	Темно с 9 утра до 9 вечера	Темно с 9 утра до 9 вечера
Собрано в 11 утра после 1 часа в свете	Собрано в 17:00 после 7 часов в свете	Собрано в 10 утра после 1 часа в темноте	Собрано в 16:00 после 7 часов в темноте

Таблица 1: Графики времени циркадного ритма NO1-ЗТ19.

Обсуждение

Исследователи используют этот протокол увлечение с успехом и последовательности. Эта процедура позволяет зафиксировать большой пул выборки, который может храниться для будущего анализа. Кроме того, эта стратегия сохраняет неврологические модели, вызванные увлечением для будущего обследования.

Фиксация для хранения является одним из основных компонентов процесса увлечение, как это помогает стабилизировать ткани мозга, и это позволяет больше времени для анализа каждого мозга из пула данных, таким образом, минимизируя отходы из мозга, которые теряют жизнеспособность из-за^{возраста 21}. Основная цель состоит в том, чтобы циркадные увлечение как можно больше мух, как это возможно, так что существует непрерывный инвентаризации доступны для головы вскрытия и в конечном итоге иммунофторесценции или извлечения белка для наблюдения за выводами и определить, если результаты имеют высокую уверенность. Для обеспечения того, чтобы циркадное увлечение сохранясь путем фиксации, является неотъемлемой частью того, что любой источник светового загрязнения устраняется. Процесс фиксации позволяет дрозофилы храниться при сохранении его неврологических "timestamp", так что они могут быть вскрыты позже и проанализированы без каких-либо заметных различий для мух, которые вскрыты и подверглись иммунофлюоресценции сразу после влечения. Для целей фиксации до иммунофлуоресценции, лаборатория определила с консистенцией, что мухи являются жизнеспособными по крайней мере до 1 месяца. Фиксации для западной экстракции белка пятно сделать мозг жизнеспособным на неопределенный срок при хранимом при -80 градусов по Цельсию.

Другим важным шагом протокола является сексинг мух. Важно, что этот шаг делается точно, как с обоих полов в том же флаконе до фиксации может привести к спариванию, что даст новые мухи, которые имеют более молодого возраста и коррумпированных анализ белка, если мужчины случайно рассмотрены вместо женщин или наоборот. Кроме того, при половом акте важно удалить образцы личинок, которые иногда прикрепляются к самкам. Это предотвращает развитие нового потомства внутри женского флакона, который потенциально может повредить результаты.

Следующим шагом для протокола обучения могут быть элементы, связанные с анализом данных. Основное внимание в протоколе уделяется локализации белка, но если есть другие переменные, которые влияют на циркадное увлечение, они должны быть изучены с помощью новых путей, часто требующих извлечения белка или нуклеиновой кислоты. Кроме того, Есть другие белки мозга, которые все еще могут быть проанализированы с помощью этого протокола. Эксперименты, связанные с протоколом, анализировали определенные белки, но список генов и белков, которые играют роль в циркадной биологии, не исчерпан. Протокол эффективен в достижении цели установления циркадного ритма, однако, приложения являются широкими.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-1000uL pipette	Eppendorf	ES-1000
10-100uL pipette	Eppendorf	ES-100
16% Paraformaldehyde Solution	15710
1X PBS	Caisson Labs	PBL01-6X100ML
Agar	Fisher Scientific	BP1423500
Anesthesia Filter Connection Kit	World Precision Instruments	EZ-251A
Corn meal	Genesee Scientific	62-100
Dried Molasses	Food Service Direct	OT280504
Droso-filler Food Pump	geneseesci.com	59-169
Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs	geneseesci.com	32-130BF
Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk	geneseesci.com	32-118SB
Dry active yeast	Genesee Scientific	62-103
Ethanol	IBI Scientific	IB15720
EZ Basic Anesthesia System	World Precision Instruments	EZ-175
Falcon Centrifuge tubes	Corning	352097
Falcon round bottom tubes	Corning	352057
Fine point Sharpie marker	Sharpie	30001
Fisherbrand Nutating Mixer	Fisher Scientific	88-861-043
Flugs-Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102
Glass Thermometer	Cole-Palmer	EW-08008-12
Liquid nitrogen hose	Thermo Scientific	398202
Liquid nitrogen tank-Dewar	Cooper Surgical Inc	900109-1
Liquid nitrogen transfer vessel	Electron Mircoscopy Sciences	61891-02
Paintbrushes(Red Sable) Size #0	Electro Microscopy Sciences	66100-00	This is used to separate the flies via sex without causing injury.
Plastic funnel	Plews and Edelmann	570-75-062
Polarizing light microscope	Microscope Central	1100100402241	Used to more clearly view Drosophila during sexing
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-100U
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-1M
ProPette Pipette Tips	MTC Bio Incorporated	P5200-5M
Propionic Acid	Sigma Aldrich	P1386-1L
Rayon Balls	Genesee Scientific	51-100
Reynolds wrap standard aluminum foil	Staples	1381273
Roaster Oven (Crockpot)	Hamilton Beach	32950
Scotch 810 Magic Tape	Electron Microscopy Sciences	77300
Spray bottle with trigger	US Plastic	66446	Used to spray ethanol to clean work bend areas
Tegosept	Genesee Scientific	20-258
Thermo Scientific Drosophila Incubator	Thermo Scientific	3990FL
Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge	ThermoFisher Scientific	REL7504D
Thermo Scientific Revco Lab Freezer	ThermoFisher Scientific	REL7504A
Tween 20	Anatrace	T1003-1-GA