عالية الإنتاجية المقايسة من الحدود الحرارية الحرجة في الحشرات

Summary

الحدود الحرارية يمكن التنبؤ البيئات التي تتسامح مع الكائنات الحية، وهي معلومات قيمة في مواجهة التغير المناخي السريع. يتم وصفها هنا بروتوكولات عالية الإنتاجية لتقييم الحد الأدنى الحراري الحرج ووقت الضربة القاضية للحرارة في الحشرات. البروتوكولين تكبير الإنتاجية وتقليل تكلفة المقايسات.

Abstract

والحدود الحرارية العليا والدنيا للنباتات والحيوانات هي مؤشرات هامة لأدائها وبقائها وتوزيعاتها الجغرافية، وهي ضرورية للتنبؤ بالاستجابات لتغير المناخ. يصف هذا العمل بروتوكولين عاليي الإنتاجية لقياس الحدود الحرارية للحشرات: أحدهما لتقييم الحد الأدنى الحراري الحرج (CT_min)والآخر لتقييم الحرارة يهدم الوقت (KDT) استجابةً لجهد حراري ثابت. في_{المقايسة} الدقيقة CT، يتم وضع الأفراد في عمود أكريليك سترة، تخضع لتراجع درجة الحرارة المنحدر، وتحسب لأنها تقع من قعقعتهم باستخدام جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء. في اختبار KDT الحرارة ، يتم احتواء الأفراد في لوحة 96 بئرًا ، توضع في حاضنة تم تعيينها إلى درجة حرارة ساخنة ومجهدة ، والفيديو المسجل لتحديد الوقت الذي لم يعد بإمكانهم البقاء فيه منتصبين والتحرك. توفر هذه البروتوكولات مزايا على التقنيات الشائعة الاستخدام. كل من المقايسات هي منخفضة التكلفة ويمكن أن تكتمل بسرعة نسبيا (~ 2 ح). _{المقايسة} الدقيقة CT يقلل من خطأ المجرب ويمكن قياس عدد كبير من الأفراد في وقت واحد. يولد بروتوكول KDT الحرارة سجل فيديو لكل مقايسة وبالتالي يزيل التحيز المجرب والحاجة إلى مراقبة الأفراد باستمرار في الوقت الحقيقي.

Introduction

الحدود الحرارية للحشرات
الاختلاف في الظروف البيئية، بما في ذلك درجة الحرارة، هو عامل رئيسي يؤثر على الأداء واللياقة البدنية والبقاء على قيد الحياة والتوزيع الجغرافي للكائنات الحية^1،2. تحدد الحدود الحرارية العليا والدنيا النطاق النظري للبيئات التي يمكن أن يتسامح معها الكائن الحي ، وبالتالي ، فإن هذه الحدود هي تنبؤات مهمة لتوزيع النباتات والحيوانات ، خاصة في مواجهة تغير المناخ^3،4. وهكذا، فإن البروتوكولات لقياس الحدود الحرارية بدقة هي أدوات مهمة لعلماء البيئة، وعلم وظائف الأعضاء، وعلماء الأحياء التطورية، وعلماء الأحياء المحافظة، من بين آخرين.

كما الحيوانات البرية الأكثر وفرة وتنوعا، وغالبا ما تستخدم الحشرات لقياس الحدود الحرارية. ويشيع استخدام الحد الأقصى الحراري الحرج (CT_max)وصغر حجم الحرارة الحرجة (CT_min)لتقييم الاختلاف داخل وفيما بين القطاعات في التسامح الحراري^5،6،7. في حين_يمكن قياس الحد_الأقصى للأشعة المقطعية و المقطعية للنوعات الظاهرية متعددة، بما في ذلك النمو، والإخراج الإنجابي، والسلوك، يتم تطبيقها الأكثر شيوعاً على وظيفة الحركي^5،6،7. وهكذا ، فإن الحد الأقصى للتصوير_{المقطعي} (يسمى أيضا الحرارة المنهزة) وMasct_min غالبا ما يتم تعريفه على أنه درجات الحرارة العالية والمنخفضة التي تفقد فيها الحشرات الوظيفة الحركية وغير قادرة على البقاء منتصبة^{5،6،7،8،9،10،11}. CT_min يتزامن مع بداية الغيبوبة الباردة، وهو شلل عكسي الناجمة عن درجات الحرارة الباردة⁶. في حين أن الشلل عند الحدود الحرارية غالبا ما يكون عكسها، استمرار التعرض لهذه درجات الحرارة يؤدي إلى الموت الإيكولوجي⁵.

طرق مشتركة لقياس الحدود الحرارية
وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الأجهزة لقياس الحدود الحرارية (ملخصة في Sinclair et al.) ^6.لفترة وجيزة، يتم تسخين الحشرات أو تبريدها في الحاضنات^12،13، حاويات مغمورة في حمامات السوائل^{11،14،15،16}، كتل الألومنيوم^10،17، أو حاويات مغطاة¹⁸، ومراقبتها حتى تتوقف الحركة. لرصد الحشرات أثناء الفحص ، فإن الطريقة الأكثر شيوعًا هي المراقبة المباشرة ، حيث يتم مراقبة الأفراد بشكل مستمر في الوقت الفعلي أو بأثر رجعي مع الفيديو المسجل^{6،9،10،11،15،17}. وفي حين أن أساليب المراقبة المباشرة لديها الحد الأدنى من متطلبات المعدات، إلا أنها تتطلب كثافة في العمالة والحد من الإنتاجية. بدلا من ذلك ، يمكن ملاحظة الحشرات بشكل غير مباشر عن طريق جمع الأفراد في أوقات منفصلة لأنها تقع من جثم^{6،19،20،21} أو استخدام رصد النشاط¹³.

11- إن الطرق غير المباشرة لقياس الحدود الحرارية هي عموماً أعلى إنتاجية وربما تكون أقل عرضة للخطأ من طرق المراقبة المباشرة. الأسلوب الأكثر شيوعاً للرصد غير المباشر يستخدم العمود سترة درجة الحرارة التي تسيطر عليها^{6،8،19،20،21.} يتم وضع الحشرات داخل عمود مع الجثم ، ويتم التحكم في درجة حرارة الغرفة الداخلية عن طريق ضخ السوائل من حمام السوائل التي يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة من خلال البطانة المبسترة للعمود. الأفراد الذين يصلون إلى حد الحرارة يسقطون من جثمهم ويتم جمعهم في درجات حرارة منفصلة أو فترات زمنية. في حين أن هذه الطريقة تعمل بشكل جيد للتصوير_{المقطعي دقيقة}، فقد وجد غير مناسب_{للأشعة المقطعية ماكس}، لأن الذباب يمشي طوعا من الجزء السفلي من العمود عندما تزيد درجة الحرارة. والطريقة الجديدة الموصوفة هنا تتحايل على هذه المسألة من خلال احتواء الذباب بشكل فردي أثناء القياسات الآلية.

وبالإضافة إلى طريقة المراقبة، يشيع استخدام نوعين من نظم الحرارة لتقييم الحدود الحرارية العليا. تتكون الأقوال الديناميكية من زيادة درجة الحرارة تدريجياً حتى يتم فقدان وظيفة المحرك. أن درجة الحرارة هي دينامية CT_ماكس^7،8،9،13. في المقابل، تتكون المقايسات الثابتة من درجة حرارة مرهقة ثابتة حتى يتم فقدان الوظيفة الحركية. أن نقطة الوقت هي الحرارة ضربة قاضية الوقت (KDT الحرارة)، وتسمى أيضا_ماكس CT ثابت_{(sCT ماكس)}في ورقة حديثة من قبل يورغنسن وآخرون^{7،,8،,9،,16،,22}. على الرغم من أن_{CT ماكس} والحرارة المقايسات الضربة القاضية (الحرارة KD المقايسات) تنتج المقاييس مع وحدات مختلفة، النمذجة الرياضية من الصفات اثنين يشير إلى أنها تعطي معلومات قابلة للمقارنة على التسامح الحرارة وكلاهما ذات الصلة بيئيا^8،9. تؤدي المقايسات الديناميكية إلى درجة حرارة يمكن مقارنتها بالظروف البيئية ، وهي أفضل عندما تكون هناك اختلافات كبيرة في تحمل الحرارة ، مثل المقارنات بين الأنواع ذات المنافذ الحرارية المختلفة على نطاق واسع. ومع ذلك ، بسبب Q10 عالية لتراكم إصابات الحرارة ، قد يكون من الأفضل إجراء فحص ثابت للكشف عن أحجام التأثير الصغيرة ، مثل الاختلاف داخل معينة في تحمل الحرارة⁹. أيضا ، من الناحية العملية ، يتطلب الفحص الثابت معدات أقل تطورا من الفحص الديناميكي.

الهدف
الهدف من هذه الورقة هو إضفاء الطابع الرسمي على أساليب المقايسات_{المقطعية الدقيقة} والحرارة KD التي يمكن استخدامها في البحوث المستقبلية لتقييم الحدود الحرارية للحشرات المتحركة. ويتم تكييف البروتوكولات من منهجيات سبق وضعها، وهي مصممة بحيث تكون عالية الإنتاجية، وآلية، وفعالة من حيث التكلفة. يمكن إتمام كل من الأقوال في فترة زمنية قصيرة (~2 ساعة)، مما يعني أنه يمكن إجراء تجارب متعددة في يوم واحد، مما ينتج كميات كبيرة من البيانات دون التضحية بالتكرار أو الدقة. مع هذا الإعداد، يمكن قياس تحمل الحرارة من 96 الذباب في وقت واحد، في حين_أن العمود ل دقيقة CT يمكن أن تعقد أكثر من 100 الذباب، شريطة أن يكون هناك مساحة سطحية كافية لتجثم.

طريقة عالية الإنتاجية لمراقبة CT_min بتعديل منهجية العمود المبستر المشترك مع إضافة مستشعر الأشعة تحت الحمراء لحساب الذباب تلقائيًا. وقد اقترح شومان وآخرون استخدام جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء للعد لأول مرة في عام 1996²³ ولكن لم يتم اعتماده على نطاق واسع. إضافة جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء يسمح لتوليد البيانات المستمرة بدلا من جمع البيانات على فترات منفصلة. كما يقلل هذا البروتوكول من خطأ المجرب عن طريق التخلص من إدخال البيانات اليدوي والحاجة إلى تبديل أنابيب التجميع يدويًا أسفل العمود المُقَدَّد عند نقاط زمنية منفصلة.

يتم تعديل طريقة عالية الإنتاجية لتسجيل KDT الحرارة من دراستين سابقتين من التسامح الحراري في الحشرات^10،12. يتم تخزين الذباب الفردي في لوحة 96 بئر في حاضنة درجة الحرارة يتم تسجيل الفيديو. يقلل هذا البروتوكول من تحيز المجرب في تحديد KDT الحرارة لأنه يمكن مراجعة التجارب والتحقق من ذلك عن طريق تشغيل التسجيل مرة أخرى. كما يوفر هذا البروتوكول مجموعة من البرامج النصية Python المخصصة التي يمكن استخدامها لتسريع تحليل الفيديو. استخدام الآبار الفردية يزيل التداخل الذي يمكن أن يحدث عندما يتحرك الأفراد الآخرين أو يسقطون ، والتي يمكن أن تكون مشكلة عندما يتم ملاحظة مجموعات من الأفراد في نفس الساحة^10،17. وعلاوة على ذلك، فإن الحاضنة التي يتم التحكم فيها بدرجة حرارة توفر درجة حرارة مستقرة عبر جميع الآبار الـ 96، على عكس تدرج درجة الحرارة الذي لوحظ أحيانًا عبر كتلة ألمنيوم يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة¹⁰. لاحظ أيضاً أنه يمكن تكييف طريقة تسجيل 96 جيداً لقياس_{الحد الأقصى} الديناميكي للتصوير المقطعي المحوسب ويحتمل أن يكون CT_min (انظر المناقشة).

لإثبات كل بروتوكول، تم مقارنة الحدود الحرارية للإناث الزميل Drosophila الكبار من خطوط مختارة من الفريق المرجعي الوراثي Drosophila melanogaster (DGRP)²⁴. وقد تم اختيار هذه الخطوط لأن التجارب الأولية أشارت إلى اختلافات كبيرة في التسامح الحراري. وقد أثبتت هذه الأقوال أنها أساليب قوية للتمييز بين الاختلافات في التسامح الحراري. البروتوكولين التاليين ، عالية الإنتاجية CT_min المقايسة (القسم 1) وعالية الإنتاجية الحرارة KD مقايسة (القسم 2) ، ووصف الإجراءات اللازمة لإنتاج CT_min والحرارة KDT البيانات عن أي مرحلة حياة الحشرات motile قادرة على تركيب في الأجهزة ، مثل Drosophilaالكبار . للتصوير_{المقطعي دقيقة} من الضروري أيضا أن تكون الحشرة قادرة على جثم. هنا, كل مقايسة هو موضح في الكبار Drosophila melanogaster. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات لـ "تصنيف" آخر أو مراحل الحياة⁶. قد تشمل التغييرات الطفيفة استخدام مواد جثم مع فتحات أكبر لاستيعاب عينات أكبر في_{مقايسة دقيقة} CT أو استخدام كاميرا ذات جودة أعلى لتمييز KDT خفية من حشرة بطيئة الحركة أو مرحلة الحياة في اختبار KD الحرارة. هذا البروتوكول لا يصف أساليب إعداد الذباب ، ولكن من المهم توحيد بروتوكولات تربية لضمان تكرار²⁵ (انظر غارسيا وتيتس²⁶ وتيتس وهان^27). وتشمل البروتوكولات المقدمة معلومات عن كيفية بناء الأجهزة وإعدادها، وكيفية تسجيل القياسات، ووصف موجز لتحليل البيانات.

Protocol

1. عالية الإنتاجية CT_دقيقة المقايسة

1. تجميع العمود المعطف (الشكل 1أ، الشكل 2)
   1. قطع أوسع (7 سم × 6.35 سم × 0.3 سم) وأضيق (5.7 سم × 5.1 سم × 0.3 سم) أنابيب الاكريليك إلى أطوال متساوية (31.5 سم) مع المنشار (الشكل 2أ). هذه الأنابيب اثنين سيكون الخارجي والأعمق الجدران من العمود سترة.
   2. قطع حلقتين (2 سم واسعة) من متوسطة الized (6.35 سم × 5.7 سم × 0.3 سم) أنبوب الاكريليك مع المنشار (الشكل 2أ). وسوف يكون هذان الحلقتان الفواصل بين الأنابيب الداخلية والخارجية، مما يخلق مساحة بين أنبوبي الأكريليك الطويلين لتدفق السوائل.
   3. حفر بعناية اثنين من الثقوب في الخارجي (أوسع) أنبوب الاكريليك، ثقب واحد في الجزء العلوي وواحد في الجزء السفلي. تأكد من أن كل ثقب هو 3.5 سم من نهاية الأنبوب. حفر الثقوب على طرفي نقيض من الأنبوب (الشكل 2B).
   4. للحد من تكسير, وضع الشريط على أنبوب على بقعة من ثقب المستقبل وحفر ببطء شديد على أدنى وضع عزم الدوران من الحفر.
   5. باستخدام الصنبور خيوط، الخيط على حد سواء الثقوب بحيث يمكن أن يكون مشدود محولات خرطوم في اثنين من الثقوب من أنبوب الخارجي. للحد من تكسير، واستخدام مواد التشحيم، والخيط ببطء باليد.
   6. الشريحة اثنين من الفواصل على سترة الداخلية، واحد في كل نهاية (أسفل وأعلى). اترك مساحة صغيرة (0.5 سم) بين المسافة ونهاية السترة الداخلية (الشكل 2ب).
   7. قم بحام الفواصل في مكانها باستخدام أسمنت الأكريليك.
   8. بعد الاسمنت على أنبوب الداخلية ومجموعات الفواصل، الشريحة هذا البناء في أنبوب الخارجي أكبر مع الثقوب. تأكد من أن الأنابيب الخارجية والداخلية هي دافق على كلا الطرفين. وسوف تكون الفواصل 0.5 سم من نهاية, تشكيل خنادق صغيرة على طرفي العمود (الشكل 2ج).
   9. قم بحام الأنبوب الخارجي إلى الفواصل باستخدام الأسمنت الأكريليك، وذلك باستخدام المشابك الفولاذية القابلة للتعديل لعقد الجهاز معا. انتظر حتى ينضبط الإسمنت.
   10. خيط محولات خرطوم في ثقوب الأنبوب الخارجي المضمون الآن إلى الفواصل والانبوب الداخلي.
       ملاحظة: يجب أن يكون مؤشر المحولات في الأنبوب الخارجي فقط وليس في المساحة المفتوحة بين الأنابيب الداخلية والأُمَرِية. إذا كان مؤشر ترابط محولات الخرطوم بعيداً جداً في, تقصير لهم إلى طول المناسبة مع المنشار.
   11. ختم محولات خرطوم في المواضيع الخاصة بهم على أنبوب الخارجي مع تسرب السيليكون.
   12. ملء الخنادق اثنين بين الأنابيب الداخلية والأعدى في كلا طرفي العمود سترة مع تسرب السيليكون.
   13. لاختبار العمود، قم بتوصيل أنابيب قطرها 0.6 سم بمحولات الخرطوم. قم بتوصيل المحول الموجود في أسفل العمود بمصدر مياه مع أنابيب، والمحول الموجود أعلى العمود إلى هجرة مع قطعة أنابيب مختلفة.
   14. تشغيل المياه من خلال الجهاز من أسفل إلى أعلى والتحقق من تسرب. إذا كان هناك تسرب، وتحديد من أين هم قادمون وختم مع السيليكون.
2. إعداد العمود المُغلف وشاشة قمع Drosophila (DFM)
   1. تأمين العمود سترة إلى موقف معوج مع مشبك معوجة من ثلاثة محاور. محاذاة العمود عموديا مع نهاية واحدة مفتوحة على السقف والأخرى مفتوحة على مقاعد البدلاء مختبر (الشكل 1B).
   2. قم بتوصيل مدخلات السوائل والإخراج من حمام مبرد يتم التحكم فيه بدرجة حرارة إلى فوهات المحول للعمود بقطر 0.6 سم من الأنابيب البلاستيكية (الشكل 1B). قم بتوصيل مدخل السوائل بالزهة الموجودة في أسفل العمود وإخراج السائل بالوزية الموجودة أعلى العمود.
   3. قطع اثنين من المقابس العازلة دائرية رغوة 3 سم سميكة (نفس محيط كما افتتاح المقصورة الأعمق من العمود). تأكد من أن المقابس تناسب بشكل مريح وختم العمود الأعمق عند إدراجها في كلا الطرفين(الشكل 1B).
   4. ثقب ثقب من خلال مركز واحد من المقابس والخيط نهاية عارية من ثيرموكوبل من خلال ثقب حوالي 5 سم وآمنة مع الشريط. قم بتوصيل الطرف الآخر من الثيرموكوببل في مسجل بيانات ثيرموبل.
   5. قم بتوصيل مسجل بيانات ثيرموبل بالكمبيوتر.
   6. إسفين قطعتين من البلاستيك مزراب حارس (5 سم × 7 سم، مع فتحات قطرها 0.5 سم) داخل العمود لتعمل كمادة جثم. ضع قطعة واحدة من الحرس 2/3^rds من أعلى العمود و 1/3^{الثالثة} الأخرى من أعلى العمود (الشكل 1B).
   7. تأمين المكونات السفلية (دون thermocouple) والمكونات العلوية (مع thermocouple). عندما يتم إدراج المكونات في أعلى العمود، تأكد من أن ثيرموكوببل لا تلمس جوانب العمود.
   8. ضبط ارتفاع العمود على موقف معوجة بحيث يكون هناك مسافة 25 سم بين أسفل العمود وأعلى مقاعد البدلاء.
   9. تأمين حلقة معوجة (5 سم قطر) إلى موقف معوج 5 سم تحت الجزء السفلي من العمود وتدوير الحلقة قبالة إلى جانب العمود.
   10. تعيين سوق دبي المالي مباشرة على حلقة معوجة (الشكل 1B). قم بتوصيل كافة المكونات الإلكترونية: مصدر الطاقة، واجهة مصدر الطاقة، والكمبيوتر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   11. بمجرد توصيل المكونات، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لإنهاء إعداد برنامج سوق دبي المالي وDFM.
3. Ct_دقيقه تحليل
   1. بدوره صمامات المدخلات والمخرجات من حمام السوائل إلى مواقف مفتوحة.
   2. اضغط على زر الطاقة لتشغيل حمام السوائل التي يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة ثم اضغط على زر التشغيل لتشغيل برنامج رفع والحفاظ على درجة حرارة الحمام إلى 25 درجة مئوية. إعطاء حمام السائل والعمود 5-10 دقيقة للوصول والحفاظ على 25 درجة مئوية.
   3. قم بإزالة المكونات في أعلى العمود واستبدله بعمود (قطر 5.08 سم؛ انظر الشكل 1ج).
   4. انقر على الذباب من قارورة الطعام الخاصة بهم في العمود.
   5. إزالة القمع واستبداله مع المكونات العلوي بسرعة، والحرص على عدم السماح للذباب الهروب. إعطاء الذباب 5 دقيقة لتسوية، التنصت أحيانا على المكونات السفلية لتشجيع الذباب على الصعود.
   6. اضغط على زر البدء على حمام السوائل وابدأ برنامج التدّهّد_{بالدقيقة} CT (25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 25 درجة مئوية إلى 10 درجات مئوية عند 0.5 درجة مئوية/دقيقة؛ 10 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ ثم 10 درجات مئوية إلى -10 درجة مئوية عند 0.25 درجة مئوية/دقيقة).
      ملاحظة: يمكن استخدام اختلافات أخرى من هذا البروتوكول CT_min المنحدرة اعتمادا على مسألة البحث (على سبيل المثال، مقارنات آثار معدلات المنحدرات المختلفة على CT_دقيقة^28).
   7. انقر فوق فتح برنامج تسجيل ثيرموكوب على الكمبيوتر ثم انقر فوق رمز التسجيل لبدء تسجيل درجة الحرارة داخل العمود كل ثانية لمدة الفحص. تأكد من أن كل تسجيل درجة حرارة يتضمن طابعًا زمنيًا خاصًا بالثاني، بحيث يمكن دمج بيانات درجة الحرارة لاحقًا مع بيانات من سوق دبي المالي.
   8. إضافة 5 مل من 90٪ الإيثانول إلى أنبوب أجهزة الطرد المركزي المخروطية 15 مل ووضعها في رف تحت العمود.
   9. في بعض الأحيان، انقر فوق المكونات السفلية من العمود لإغراء أي الذباب في الجزء السفلي لتسلق. معظم الذباب سيكون على جثم أو بالقرب من أعلى العمود بنسبة 15 درجة مئوية.
   10. عند 15 درجة مئوية، قم بإزالة المكونات السفلية وجمع أي ذباب لا يزال على المكونات السفلية في الإيثانول. عد ولاحظ أن هذه الذباب تم جمعها في 15 درجة مئوية ولكن الأشعة_{المقطعية min} غير معروفة.
       ملاحظة: ينبغي أن تقرر درجة الحرارة التي تتم إزالة المكونات السفلية قبل الفحص واستنادا إلى_دقيقة CT المتوقعة من الأنواع اختبار أو العلاج. لهذا الفحص، تم اختيار 15 درجة مئوية على أساس_دقيقة CT من هذه الخطوط DGRP خاصة وجدت في المقايسات الأولية.
   11. ضع قمعًا زجاجيًا قطره 75 مم في سوق دبي المالي. اضبط حلقة المُعوَّد، وDFM، و القمع بحيث تكون تحت العمود. تأكد من أن الشفة من القمع الأختام تماما أسفل العمود (الشكل 1D).
   12. أدخل الجزء السفلي من القمع في أنبوب جمع 15 مل (الشكل 1D).
   13. افتح برنامج سوق دبي المالي على الكمبيوتر بالنقر على رمز البرنامج. البرنامج سيبدأ على الفور تسجيل الوقت / التاريخ الذي الذباب تصل إلى دقيقة الأشعة_{المقطعية}الخاصة بهم . الذباب الذي يصل إلى_دقيقة الأشعة المقطعية يفقد وظيفته العصبية العضلية ويسقط من جثم، وبعد ذلك من خلال سوق دبي المالي.
   14. رصد ما إذا كان قد وصلت جميع الذباب بهم الأشعة_{المقطعية دقيقة} كما تنخفض درجة الحرارة عن طريق التحقق من المكونات العليا والجثم لمعرفة ما إذا كان أي الذباب لا تزال جاثمة (أي لا تزال تحافظ على وظيفة عصبية عضلية). تنتهي المحاكمة عندما وصلت جميع الذباب بهم CT_دقيقة.
   15. في نهاية التجربة، قم بضبط سوق دبي المالي وإبعاد فتحة العمود. بعض الذباب قد تصل إلى_دقيقة الأشعة المقطعية الخاصة بهم ولكن لا تزال عالقة في العمود (أي إسفين في جثم أو تتدلى من قبل خطاف واحد tarsal). افتح المكونات العلوية وأزل هذه الذبابات. _دقيقة CT من هذه الذباب غير معروف.
   16. الجمع بين ملفات إخراج .txt من برنامج تسجيل الثيرموكوب (أي درجة الحرارة والتاريخ والوقت) وبرنامج DFM (أي عدد الذباب خلال القمع والتاريخ والوقت) باستخدام أمر دمج في RStudio. دمج الملفين استناداً إلى متغير التاريخ/الوقت المشترك.

2. عالية الإنتاجية الحرارة KD مقايسة

1. جهاز التجميع والإعداد
   1. مع لاصقة، وإصلاح شبكة سلكية المنسوجة الصلب (~ 1.5 mm الفتحة) إلى الجزء السفلي من 96 جيدا لا أسفل لوحة.
   2. نعلق المغناطيس إلى الجانبين المعاكس من الجزء السفلي من 96 جيدا لا أسفل لوحة مع بندقية الغراء الساخن والغراء الساخن(الشكل 3).
   3. لصياغة غطاء septum مخصص مع فيلم لاصق مصمم للوحات 96 بئر ، عصا اثنين من الأفلام الجانبين لزجة معا لتشكيل ورقة بلاستيكية المتطاولة.
   4. ضع الصفائح البلاستيكية على لوحة 96 جيدا واستخدام الشريط للتمسك بها إلى جميع الجوانب الأربعة من لوحة. على الفتحة إلى كلّ بئر على اللوحة, يقطع 'x' في الورقة بلاستيكيّة مع صندوق قطع ([إي.], 96 إجماليّة [إكس]).
   5. تخدير الذباب مع CO₂ وتحميلها بشكل فردي في كل بئر من 96 تعديل جيدا لا أسفل لوحة مع التعرق وغطاء الحاجز. إزالة غطاء الحاجز من لوحة 96 جيدا في حين يتم تخدير الذباب مع CO₂ واستبداله مع غطاء واضح ضيق المناسب.
   6. وضع 96 جيدا لا أسفل لوحة محملة الذباب ومع غطاء واضح ضيق المناسب على الغذاء. ضمان الذباب لديها على الأقل 48 ح بين CO₂ تخدير وبداية المقايسة (الخطوات 2.2.1-2.2.5).
      ملاحظة: الجزء السفلي من 96 جيدا تعديل لوحات لا القاع مصنوع من شبكة، حتى الذباب مخدر مع CO₂ يمكن تحميلها وتركها على المواد الغذائية لمدة 48 ساعة على الأقل قبل أن تبدأ المحاكمة. يمكن استخدام أي حاوية بلاستيكية > 8.5 سم عرض × 13 سم طويلة التي لا يقل عن 2 سم عميق لاستيعاب طبقة عميقة 1 سم من المواد الغذائية.
   7. إصلاح كاميرا ويب إلى الجزء السفلي من داخل حاضنة درجة الحرارة التي تسيطر عليها مع الشريط. نقطة الكاميرا مباشرة إلى أعلى (الشكل 4). تأمين رف حاضنة حوالي 10 سم فوق الكاميرا.
      ملاحظة: الكاميرا تشير إلى أعلى ويسجل لوحة 96 جيدا من أسفل لضمان أكبر قدر من سطح البئر هو في طريقة العرض ممكن (على سبيل المثال، لم يتم حظر الخروج من عرض من قبل الجدران بئر من لوحة). عندما يصل الذباب إلى KDT يسقطون إلى قاع البئر؛ في هذه الحالة، فإن الجانب الأقرب إلى كاميرا ويب، وبالتالي فهي في طريقة العرض بغض النظر عن مدى ابتعادها عن مركز الرؤية.
   8. قم بتوصيل كاميرا ويب بالكمبيوتر.
   9. مع الشريط، نعلق ورقة بيضاء من الورق (8.5 سم × 13 سم؛ المساحة الدقيقة من الجزء السفلي من لوحة 96 بئر) إلى أسفل الجرف (الشكل 4). تأكد من أن الورقة تملأ الإطار بأكمله عند عرضها من خلال كاميرا الويب.
   10. وضع مصدر الضوء في الحاضنة. استخدم الورق أو المواد الأخرى لتخمين الإضاءة وتقليل الوهج.
       ملاحظة الخطوة 2.1.10 هي خاصة لكل حاضنة لأن الإضاءة والتأملات تختلف بين الحاضنات. والهدف هو الحصول على إضاءة كافية في الحاضنة لتوفير تباين جيد بين الذباب في كل بئر وورقة بيضاء من الورق خلف اللوحة عند مشاهدتها مع كاميرا الويب.
2. أداء فحص KD الحرارة
   1. تعيين الحاضنة إلى 37.5 درجة مئوية وانتظر حوالي 30 دقيقة لإعطاء الحاضنة الوقت للوصول والحفاظ على درجة الحرارة المطلوبة. تعتمد درجة الحرارة الدقيقة على تقييم الحشرة وأي اعتبارات أخرى في الوقت.
   2. ضع 96 لوحة مقلوب جيدا في الحاضنة، بحيث الجزء السفلي من لوحة (الجانب شبكة) هو ضد ورقة بيضاء على الجزء السفلي من علبة (الشكل 4). يحيط علما باتجاه الآبار (أسماء الأعمدة والصفوف) على الدرج وفي إطار كاميرا ويب. الشريط الملون على طول جانبي لوحة 96 جيدا وحواف قطعة بيضاء من الورق يمكن التحقق من التوجه (الشكل 4).
      ملاحظة: تأكد من أن درجة حرارة الحاضنة تتسق مع درجة الحرارة داخل لوحة البئر 96 عن طريق تسجيل درجة الحرارة داخل اللوحة مع ثركوسوب أثناء اختبار اختبار اختبار KD الحرارة. ومن الحكمة أيضا أن تحقق من أن هناك تباينا ضئيلا في درجة الحرارة بين آبار 96 بئر مع ثيرموكوبل متعددة قبل إجراء اختبار KD الحرارة.
   3. أغلق باب الحاضنة.
   4. انقر فوق تسجيل على برنامج تسجيل الفيديو.
   5. بعد 2 ساعة، تحقق من التسجيل لمعرفة أن جميع الذباب قد وصلت إلى نقطة الراحة النهائية وتوقفت عن الحركة. بمجرد توقف جميع الذباب عن الحركة ، انقر فوق إيقاف على برنامج تسجيل الفيديو. بالنسبة للنمط الجيني الذي تم اختباره هنا، الذي تم تربيته عند 25 درجة مئوية، يصل معظم الذباب إلى KDT بمقدار 60 دقيقة عند 37.5 درجة مئوية (انظر أيضاً يورغنسن وآخرون^9).
   6. تخلص من الذباب
   7. استخدام البرامج النصية بيثون مخصصة(تكميلية الترميز الملفات 1-3) لتقريب الوقت في الفيديو عندما يصل الذباب KDT الحرارة الخاصة بهم.
      ملاحظة: الخطوة 2.2.7 اختيارية. لتسريع تحليل الفيديو، تم تطوير مجموعة من البرامج النصية Python المخصصة لقياس التغيرات في كثافة البكسل مع مرور الوقت في كل بئر (انظر ملف الترميز التكميلي). عندما يتوقف الذباب عن الحركة، تكون كثافة البكسل ثابتة، ويمكن استخدام مخطط لهذه البيانات لتحديد الوقت التقريبي في الفيديو عندما يتم إسقاط الذباب. في حين أنه قد يكون من الممكن استخدام هذا البرنامج النصي لأتمتة تحليل البيانات ، عيوب طفيفة حاليا في الفيديو يؤدي إلى اختلافات طفيفة بين التغيرات في كثافة بكسل والوقت KD الحقيقي.
   8. انقر فوق فتح ملف الفيديو وتسجيل KDT من كل ذبابة في كل بئر. المقياس الأكثر اتساقا من KDT الحرارة بين التجارب والمراقبين هو تسجيل الوقت الذي تصل ذبابة بقعة الراحة النهائية.
   9. تتبع الفيديو في الاتجاه المعاكس، مع التركيز على بئر واحد، و مشيرا إلى الوقت الذي تتحرك فيه الذبابة لأول مرة قبالة بقعة الراحة النهائية. كرر هذه العملية لكل بئر.

النتائج

تم قياس الحدود الحرارية_{(أي، دقيقة} CT وKDT الحرارية) للإناث من الفريق المرجعي الوراثي Drosophila melanogaster (DGRP) لإثبات البيانات عالية الإنتاجية المتولدة من البروتوكولين الموصوفين. تم فحص_{المقطع المقطعي} باستخدام خطوط DGRP 714 (ن = 37) و913 (ن = 45). تم فحص KDT الحرارة ومقارنتها م?...

Discussion

الطريقتان المفصلتان أعلاه تولدان بيانات عالية الإنتاجية للمقاييس ذات الصلة من الناحية الإيكولوجية للحدود الحرارية العليا والدنيا. وتستند هذه البروتوكولات إلى منهجيات سبق وضعها في البحوث المتعلقة بالقيود الحرارية للحشرات (ملخصة في Sinclair et al.) ^6.يمكن الانتهاء من كل من البروت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps)	Thermo Scientific; Waltham, MA	153-5401
C922 Pro Stream Webcam	Logitech; Newark, CA	960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm	Any	Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm	United States Plastic Corp., OH	44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm	United States Plastic Corp., OH	440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm	United States Plastic Corp., OH	44041
Clear silicone sealant	Any	Any
Collection tube (15 ml)	Any	Any
Cordless Drill	Any	Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM)	TriKinetics; Waltham, MA	DFM	Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software	TriKinetics; Waltham, MA		Records data input from the DFM
Fly Storage Lid	FlySorter; Seatle, WA	FS-96LID-5PK	Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate	FlySorter; Seatle, WA	FS-96PLATE-5PK	Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray	FlySorter; Seatle, WA	FS-TRAY-5PK	Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel	Kimax	28950-75	75mm
Gutter guard	Any	Any	~0.5 cm diameter openings
Hacksaw	Any	Any
Heratherm Thermo Scientific incubator	Thermo Scientific; Waltham, MA	OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8	United States Plastic Corp., OH	61135
Hot glue gun and glue	Any	Any
Light Source	Any	Any
Magnets	Any	Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software	OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T)	OMEGA; Norwalk, CT	5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel	Any	Any	2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter	United States Plastic Corp., OH	62852
Retort ring	Any	Any	2" diameter
Retort stand	Any	Any
Retort three-prong clamp	Any	Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9)	TriKinetics; Waltham, MA	PSIU9	Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick)	Any	Any
Tape	Any	Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1)	TriKinetics; Waltham, MA	PS9-1	Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement	United States Plastic Corp., OH	45737