Ensayos de alto rendimiento de límites térmicos críticos en insectos

Resumen

Los límites térmicos pueden predecir los ambientes que toleran los organismos, que es información valiosa frente al rápido cambio climático. Aquí se describen protocolos de alto rendimiento para evaluar el mínimo térmico crítico y el tiempo de derribo del calor en los insectos. Ambos protocolos maximizan el rendimiento y minimizan el costo de los ensayos.

Resumen

Los límites térmicos superiores e inferiores de plantas y animales son importantes predictores de su rendimiento, supervivencia y distribuciones geográficas, y son esenciales para predecir las respuestas al cambio climático. Este trabajo describe dos protocolos de alto rendimiento para medir los límites térmicos de insectos: uno para evaluar el mínimo térmico crítico (CT_min)y el otro para evaluar el tiempo de desmoción de calor (KDT) en respuesta a un factor de estrés térmico estático. En el ensayo_mínimo de TC, los individuos son colocados en una columna con camisa de acrílico, sometidos a una rampa de temperatura decreciente, y contados a medida que caen de sus perchas usando un sensor infrarrojo. En el ensayo de KDT de calor, los individuos están contenidos en una placa de 96 pozos, colocada en una incubadora ajustada a una temperatura estresante, caliente, y vídeo grabado para determinar el tiempo en el que ya no pueden permanecer erguidos y moverse. Estos protocolos ofrecen ventajas sobre las técnicas de uso común. Ambos ensayos son de bajo costo y se pueden completar con relativa rapidez (2 h). El ensayo_mínimo de TC reduce el error del experimentador y puede medir un gran número de individuos a la vez. El protocolo KDT de calor genera un registro de vídeo de cada ensayo y, por lo tanto, elimina el sesgo del experimentador y la necesidad de monitorear continuamente a las personas en tiempo real.

Introducción

Límites térmicos de insectos
La variación en las condiciones ambientales, incluida la temperatura, es un factor importante que influye en el rendimiento, la aptitud, la supervivencia y la distribución geográfica de los organismos^1,,2. Los límites térmicos superiores e inferiores determinan el rango teórico de ambientes que un organismo puede tolerar, y, por lo tanto, estos límites son importantes predictores de las distribuciones vegetales y animales, especialmente frente al cambio climático^3,,4. Por lo tanto, los protocolos para medir con precisión los límites térmicos son herramientas importantes para ecologistas, fisiólogos, biólogos evolutivos y biólogos de conservación, entre otros.

Como los animales terrestres más abundantes y diversos, los insectos se utilizan con frecuencia para las mediciones de los límites térmicos. Los máximos térmicos críticos (CT_max)y los mínimos térmicos críticos (CT_min)se utilizan comúnmente para evaluar la variación intra e interespecífica en la tolerancia térmica^5,6,7. Mientras que la TC_max y la TC_min se pueden medir para múltiples fenotipos, incluyendo el crecimiento, la producción reproductiva y el comportamiento, se aplican más comúnmente a la función locomotora^5,,6,7. Por lo tanto, CT_max (también llamada temperatura de derribo de calor) y CT_min se definen a menudo como las altas y bajas temperaturas a las que los insectos pierden la función motora y son incapaces de permanecer erguidos^{5,6,7,8,9,10,11}. CT_min coincide con la aparición del coma frío, una parálisis reversible provocada por temperaturas frías⁶. Si bien la parálisis en los límites térmicos es a menudo reversible, la exposición continua a estas temperaturas conduce a la muerte ecológica⁵.

Métodos comunes para medir los límites térmicos
Se han utilizado diversos aparatos para medir los límites térmicos (resumidos en Sinclair et al.) ^6.Brevemente, los insectos se calientan o enfrían en incubadoras^12,13, recipientes sumergidos en baños fluidos^11,14,15,16, bloques de aluminio^10,17, o contenedores enchatados¹⁸, y monitoreados hasta que cesa la locomoción. Para controlar los insectos durante el ensayo, el método más común es la observación directa, en la que los individuos son monitoreados continuamente en tiempo real o retrospectivamente con vídeo grabado^{6,,9,10,11,15,17}. Si bien los métodos de observación directa tienen requisitos mínimos de equipo, consumen mucha mano de obra y limitan el rendimiento. Alternativamente, los insectos pueden ser observados indirectamente mediante la recolección de individuos en momentos discretos ya que caen de las perchas^6,19,20,21 o utilizando monitores de actividad¹³.

Los métodos indirectos para medir los límites térmicos son generalmente de mayor rendimiento y potencialmente menos propensos a errores que los métodos de observación directa. El método más común para el monitoreo indirecto utiliza una columna con camisa de temperatura controlada^{columna 6,8,19,20,21}. Los insectos se colocan dentro de una columna con perchas, y la temperatura de la cámara interior se controla bombeando líquido desde un baño de fluidos con temperatura controlada a través del revestimiento enchacado de la columna. Los individuos que alcanzan su límite térmico caen de su percha y se recogen a temperaturas discretas o intervalos de tiempo. Mientras que este método funciona bien para CT_min,se ha encontrado inadecuado para CT_max,porque las moscas salen voluntariamente de la parte inferior de la columna cuando la temperatura aumenta. El nuevo método descrito aquí elude este problema al contener individualmente moscas durante las mediciones automatizadas.

Además del método de observación, se utilizan comúnmente dos tipos de regímenes de temperatura para evaluar los límites térmicos superiores. Los ensayos dinámicos consisten en aumentar gradualmente la temperatura hasta que se pierde la función motora; que la temperatura es la TC dinámica_máxima^7,8,9,13. Por el contrario, los ensayos estáticos consisten en una temperatura estresante constante hasta que se pierde la función motora; ese punto de tiempo es el tiempo de derribo de calor (calor KDT), también llamado CT_{estático max} (sCT_max) en un artículo reciente por J-rgensen et al.^7,8,9,16,22. Aunque los ensayos CT_max y heat knockdown (ensayos de KD térmico) producen métricas con diferentes unidades, el modelado matemático de los dos rasgos indica que proporcionan información comparable sobre la tolerancia al calor y ambos son ecológicamente relevantes^8,,9. Los ensayos dinámicos producen una temperatura que se puede comparar con las condiciones ambientales, y son preferibles cuando hay grandes diferencias en la tolerancia al calor, como las comparaciones entre especies con nichos térmicos muy diferentes. Sin embargo, debido al alto Q10 para la acumulación de lesiones por calor, un ensayo estático puede ser preferible para detectar tamaños de efectos pequeños, como la variación intraespecífica en la tolerancia al calor⁹. Además, prácticamente hablando, un ensayo estático requiere un equipo menos sofisticado que un ensayo dinámico.

Objetivo
El objetivo de este artículo es formalizar métodos para ensayos_de KD de CT min y calor que se pueden utilizar en futuras investigaciones para evaluar los límites térmicos de los insectos móviles. Los protocolos se adaptan a partir de metodologías previamente establecidas y están diseñados para ser de alto rendimiento, automatizados y rentables. Ambos ensayos se pueden completar en un corto período de tiempo (2 h), lo que significa que se pueden llevar a cabo varios experimentos en un solo día, produciendo grandes cantidades de datos sin sacrificar la repetibilidad ni la precisión. Con esta configuración, la tolerancia al calor de 96 moscas se puede medir simultáneamente, mientras que la columna para CT_min puede contener más de 100 moscas, siempre que haya una superficie adecuada para posarse.

El método de alto rendimiento para observar CT_min modifica la metodología común de columnas encapuchadas con la adición de un sensor infrarrojo para contar automáticamente las moscas. El uso de un sensor infrarrojo para el recuento fue propuesto por primera vez por Shuman et al. en 1996^23, pero no ha sido ampliamente adoptado. La adición del sensor infrarrojo permite la generación de datos continuos en lugar de recopilar datos a intervalos discretos. Este protocolo también minimiza el error del experimentador al eliminar la entrada manual de datos y la necesidad de cambiar manualmente los tubos de recolección por debajo de la columna jacked en puntos de tiempo discretos.

El método de alto rendimiento para el registro de calor KDT se modifica de dos estudios previos de tolerancia al calor en insectos^10,,12. Las moscas individuales se almacenan en una placa de 96 pozos en una incubadora con temperatura controlada y se graba vídeo. Este protocolo minimiza el sesgo del experimentador para determinar el KDT de calor porque los experimentos se pueden revisar y verificar reproduciendo la grabación. Este protocolo también proporciona un conjunto de scripts de Python personalizados que se pueden utilizar para acelerar el análisis de vídeo. El uso de pozos individuales elimina la interferencia que puede ocurrir cuando otros individuos se mueven o caen, lo que puede ser un problema cuando se observan grupos de individuos en la misma arena^10,,17. Además, la incubadora de temperatura controlada proporciona una temperatura estable en los 96 pozos, a diferencia del gradiente de temperatura que a veces se observa en un bloque de aluminio¹⁰con temperatura controlada. También tenga en cuenta que el método de grabación de pozos 96 se puede adaptar para medir la TC dinámica_máxima y potencialmente CT_min (ver Discusión).

Para demostrar cada protocolo, se compararon los límites térmicos de las hembras Drosophila melanogaster adultas de líneas selectas del Panel de Referencia Genética de Drosophila melanogaster (DGRP)²⁴. Estas líneas se seleccionaron porque los experimentos preliminares indicaban diferencias significativas en la tolerancia térmica. Estos ensayos demostraron ser métodos robustos para discriminar las diferencias en la tolerancia térmica. Los dos protocolos siguientes, el ensayo_mínimo de CT de alto rendimiento (sección 1) y el ensayo de KD térmico de alto rendimiento (sección 2), describen las acciones necesarias para producir datos de KDT_min y de calor para cualquier etapa de vida de insectos móviles capaz de encajar en los aparatos, como Drosophilaadulta. Para CT_min también es esencial que el insecto sea capaz de posarse. Aquí, cada ensayo se demuestra en Drosophila melanogasteradulto. Sin embargo, pueden ser necesarias modificaciones para otros taxones o etapas de vida⁶. Los cambios menores pueden incluir el uso de material de posado con aberturas más grandes para acomodar especímenes más grandes en el ensayo_min ct o el uso de una cámara de mayor calidad para discernir el KDT sutil de un insecto en movimiento lento o etapa de vida en el ensayo de KD de calor. Este protocolo no describe los métodos para preparar moscas, pero es importante estandarizar los protocolos de cría para garantizar la repetibilidad²⁵ (véase García y Teets²⁶ y Teets y Hahn^27). Los protocolos proporcionados incluyen información sobre cómo construir y configurar los aparatos, cómo registrar mediciones y una breve descripción del análisis de datos.

Protocolo

1. Ensayo_mínimo de CT de alto rendimiento

1. Montaje de la columna revestida (Figura 1A, Figura 2)
   1. Cortar los tubos de acrílico más anchos (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) y más estrechos (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) a longitudes iguales (31,5 cm) con una sierra de corte(Figura 2A). Estos dos tubos serán las paredes exteriores e internas de la columna con chaqueta.
   2. Cortar dos anillos (2 cm de ancho) del tubo de acrílico de media (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) con una sierra de corte(Figura 2A). Estos dos anillos serán los espaciadores entre los tubos interiores y exteriores, creando un espacio entre los dos tubos acrílicos largos para que el fluido fluya.
   3. Taladre cuidadosamente dos orificios en el tubo de acrílico exterior (más ancho), un agujero en la parte superior y otro en la parte inferior. Asegúrese de que cada orificio esté a 3,5 cm del extremo del tubo. Taladre los orificios en lados opuestos del tubo (Figura 2B).
   4. Para reducir el agrietamiento, coloque la cinta en el tubo sobre el punto del orificio futuro y taladre muy lentamente en el ajuste de par más bajo de la broca.
   5. Usando el grifo roscado, enhebrar ambos orificios para que los adaptadores de manguera se puedan atornillar en los dos orificios del tubo exterior. Para reducir el agrietamiento, utilice lubricante y enhebrar lentamente a mano.
   6. Deslice los dos espaciadores sobre la chaqueta interior, uno en cada extremo (abajo y arriba). Deje un espacio pequeño (0,5 cm) entre el espaciador y el extremo de la chaqueta interior (Figura 2B).
   7. Soldar los espaciadores en su lugar utilizando cemento acrílico.
   8. Después de que el cemento en el tubo interior y los espaciadores conjuntos, deslice esta construcción en el tubo exterior más grande con los agujeros. Asegúrese de que los tubos exteriores e interiores estén al ras en ambos extremos. Los espaciadores serán de 0,5 cm desde el final, formando pequeñas trincheras en ambos extremos de la columna (Figura 2C).
   9. Soldar el tubo exterior a los espaciadores utilizando cemento acrílico, utilizando abrazaderas de acero ajustables para mantener el aparato unido. Espera a que se ponga el cemento.
   10. Enrosque los adaptadores de manguera en los orificios del tubo exterior ahora fijados a los espaciadores y al tubo interior.
       NOTA: Los adaptadores sólo deben enhebrar en el tubo exterior y no en el espacio abierto entre los tubos interior y exterior. Si los adaptadores de manguera se enhebran demasiado, acortenlos a la longitud adecuada con una sierra.
   11. Selle los adaptadores de manguera en sus roscas en el tubo exterior con sellador de silicona.
   12. Llene las dos trincheras entre los tubos interior y exterior en ambos extremos de la columna revestida con sellador de silicona.
   13. Para probar la columna, conecte tubos de 0,6 cm de diámetro a los adaptadores de manguera. Conecte el adaptador en la parte inferior de la columna a una fuente de agua con tubo, y el adaptador en la parte superior de la columna a un drenaje con una pieza diferente de tubo.
   14. Pasa el agua a través del aparato desde la parte inferior hasta la parte superior y comprueba si hay fugas. Si hay fugas, identifique de dónde vienen y selle con silicona.
2. Configuración de la columna con chaqueta y el monitor de embudo Drosophila (DFM)
   1. Fije la columna enchatada a un soporte de réplica con una abrazadera de retorta de tres puntas. Alinee la columna verticalmente con un extremo abierto al techo y el otro abierto al banco de laboratorio (Figura 1B).
   2. Conecte la entrada y salida de fluido de un baño refrigerado con temperatura controlada a las boquillas del adaptador de la columna con tubos de plástico de 0,6 cm de diámetro(Figura 1B). Conecte la entrada de fluido a la boquilla en la parte inferior de la columna y la salida de fluido a la boquilla en la parte superior de la columna.
   3. Corte dos tapones aislantes de espuma circular de 3 cm de espesor (la misma circunferencia que la abertura del compartimento más interior de la columna). Asegúrese de que los enchufes encajen perfectamente y selle la columna más interna cuando se inserte en ambos extremos(Figura 1B).
   4. Perforar un agujero a través del centro de uno de los enchufes y enhebrar el extremo desnudo de un termopar a través del agujero unos 5 cm y asegurar con cinta. Enchufe el otro extremo del termopar en un registrador de datos de termopar.
   5. Conecte el registrador de datos del termopar al ordenador.
   6. Cuña dos piezas de protector de alcantarilla de plástico (5 cm x 7 cm, con aberturas de 0,5 cm de diámetro) dentro de la columna para funcionar como material de posado. Coloque una pieza de protección 2/3^rds desde la parte superior de la columna y la otra 1/3^rd desde la parte superior de la columna (Figura 1B).
   7. Asegure el enchufe inferior (sin termopar) y el tapón superior (con un termopar). Cuando el enchufe se inserte en la parte superior de la columna, asegúrese de que el termopar no toque los lados de la columna.
   8. Ajuste la altura de la columna en el soporte de réplica para que haya una distancia de 25 cm entre la parte inferior de la columna y la parte superior del banco.
   9. Asegure un anillo de réplica (5 cm de diámetro) al soporte de réplica 5 cm por debajo de la parte inferior de la columna y gire el anillo hacia el lado de la columna.
   10. Fije el DFM directamente en el anillo del replicart(Figura 1B). Conecte todos los componentes electrónicos: la fuente de alimentación, la interfaz de la fuente de alimentación y el ordenador de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   11. Una vez conectados los componentes, siga el protocolo del fabricante para finalizar la configuración del software DFM y DFM.
3. Ct_Min Ensayo
   1. Gire las válvulas de entrada y salida del baño de fluidos a las posiciones abiertas.
   2. Pulse el botón de encendido para encender el baño de fluidos con control de temperatura y, a continuación, pulse el botón de reproducción para ejecutar un programa que eleva y mantiene la temperatura del baño a 25 oC. Dar el baño de líquido y la columna 5-10 min para alcanzar y mantener 25 oC.
   3. Retire el enchufe en la parte superior de la columna y reemplácelo con un embudo de conversión (5,08 cm de diámetro; véase la figura 1C).
   4. Toque las moscas de su vial de alimentos en la columna.
   5. Retire el embudo y reemplácelo con el enchufe superior rápidamente, cuidado de no dejar escapar a las moscas. Dar a las moscas 5 minutos para asentarse, de vez en cuando tocando el enchufe inferior para animar a las moscas a subir.
   6. Pulse el botón de inicio en el baño de fluidos e inicie el programa de rampa de CT_min (25 oC durante 5 min; 25 oC a 10 oC a 0,5 oC/min; 10 oC durante 2 min; luego de 10 oC a -10 oC a 0,25 oC/min).
      NOTA: Otras variaciones de este protocolo de rampa_mínima ct se pueden utilizar dependiendo de la cuestión de la investigación (por ejemplo, comparaciones de los efectos de las diferentes tasas de rampa en CT_min²⁸).
   7. Haga clic en abrir el software de grabación de termopar en el ordenador y, a continuación, haga clic en el icono Grabar para comenzar a registrar la temperatura dentro de la columna cada segundo durante el ensayo. Asegúrese de que cada registro de temperatura incluye una marca de tiempo específica para el segundo, de modo que los datos de temperatura se puedan combinar más adelante con los datos del DFM.
   8. Agregue 5 ml de etanol al 90% a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y colóquelo en un bastidor debajo de la columna.
   9. De vez en cuando, toque el tapón inferior de la columna para atraer a las moscas en la parte inferior para subir. La mayoría de las moscas estarán en una percha o cerca de la parte superior de la columna por 15 oC.
   10. A 15 oC, retire el tapón inferior y recoja las moscas que aún estén en el enchufe inferior en el etanol. Cuente y tenga en cuenta que estas moscas fueron recolectadas a 15 oC, pero se desconoce su CT_min.
       NOTA: La temperatura a la que se retira el tapón inferior debe decidirse antes del ensayo y en función de la TC_{prevista min} de la especie de ensayo o tratamiento. Para este ensayo, se eligieron 15 oC en función del_min CT de estas líneas DGRP particulares que se encuentran en los ensayos preliminares.
   11. Coloque un embudo de vidrio de 75 mm de diámetro exterior en el DFM. Ajuste el anillo de réplica, DFM y embudo para que estén debajo de la columna. Asegúrese de que el labio del embudo sella completamente la parte inferior de la columna (Figura 1D).
   12. Inserte la parte inferior del embudo en el tubo de recogida de 15 ml (Figura 1D).
   13. Abra el software DFM en el equipo haciendo clic en el icono Software. El software comenzará inmediatamente a grabar la hora /fecha en la que las moscas alcanzan su CT_min. Las moscas que alcanzan su TC_min pierden la función neuromuscular y caen de sus perchas, y a partir de entonces a través de la DFM.
   14. Supervise si todas las moscas han alcanzado su TC_mín.min a medida que la temperatura disminuye comprobando el tapón superior y las perchas para ver si alguna mosca todavía está encaramada (es decir, manteniendo todavía la función neuromuscular). El juicio termina cuando todas las moscas han alcanzado su CT_min.
   15. Al final de la prueba, ajuste el DFM y el embudo lejos de la abertura de la columna. Algunas moscas pueden alcanzar su tomografía computarizada_min, pero permanecen atascadas en la columna (es decir, encerradas en una percha o colgando por un solo gancho tarsal). Abra el enchufe superior y retire estas moscas. Se desconoce_el tomografía computarizada de estas moscas.
   16. Combine los archivos de salida .txt del software de grabación de termopar (es decir, temperatura, fecha y hora) y el software DFM (es decir, el número de moscas a través del embudo, la fecha y la hora) utilizando el comando Combinar en RStudio. Combine los dos archivos en función de la variable de fecha y hora compartida.

2. Ensayo de KD térmico de alto rendimiento

1. Montaje y preparación del aparato
   1. Con un adhesivo, fije la malla de alambre tejida de acero (apertura de 1,5 mm) en la parte inferior de una placa sin fondo de 96 pozos.
   2. Fije imanes a los lados opuestos de la parte inferior de una placa sin fondo de 96 pozos con una pistola de pegamento caliente y pegamento caliente (Figura 3).
   3. Para crear una tapa de tabique personalizada con película adhesiva diseñada para 96 placas de pozo, pegue dos películas de lados pegajosos para formar una lámina de plástico.
   4. Coloque las láminas de plástico sobre la placa de 96 pozos y utilice cinta adhesiva para adherirla a los cuatro lados de la placa. Sobre la abertura de cada pozo de la placa, corte una 'x' en la lámina de plástico con un cortador de caja (es decir, 96 x totales).
   5. Anesthetizar las moscas con CO₂ y cargarlas individualmente en cada pozo de la placa de 96 bien sin fondo modificada con un aspirador y tapa del tabique. Retire la tapa del tabique de la placa de 96 pozos mientras las moscas están anestesiadas con_CO2 y reemplácela con una tapa transparente ajustada.
   6. Coloque la placa sin fondo de 96 pozos cargada de moscas y con una tapa clara y ajustada en los alimentos. Asegúrese de que las moscas tengan al menos 48 h entre la anestesia de_CO2 y el inicio del ensayo (pasos 2.2.1-2.2.5).
      NOTA: La parte inferior de las 96 placas sin fondo modificadas está hecha de malla, por lo que las moscas anestesiadas con_CO2 se pueden cargar y dejar en los alimentos durante al menos 48 horas antes de que comience un ensayo. Se puede utilizar cualquier recipiente de plástico >8,5 cm de ancho x 13 cm de largo que tenga al menos 2 cm de profundidad para acomodar una capa de alimento de 1 cm de profundidad.
   7. Fije una cámara web en la parte inferior del interior de una incubadora con cinta adhesiva con cinta. Apunte la cámara directamente hacia arriba (Figura 4). Asegure un estante de incubadora a unos 10 cm por encima de la cámara.
      NOTA: La cámara web apunta y registra la placa de 96 pozos desde abajo para asegurarse de que la mayor parte de la superficie del pozo está a la vista como sea posible (por ejemplo, no bloqueado de la vista por las paredes de pozo de la placa). Cuando las moscas alcanzan su KDT caen al fondo del pozo; en este caso, el lado más cercano a la cámara web, y por lo tanto están a la vista, independientemente de lo lejos que esté su pozo del centro de la vista.
   8. Conecte la cámara web a un ordenador.
   9. Con cinta adhesiva, coloque una hoja blanca de papel (8,5 cm x 13 cm; el área exacta de la parte inferior de la placa de 96 pozos) en la parte inferior del estante(Figura 4). Asegúrese de que el papel llene todo el marco cuando se vea a través de la cámara web.
   10. Coloque una fuente de luz en la incubadora. Utilice papel u otros materiales para humedecer la iluminación y minimizar el deslumbramiento.
       NOTA El paso 2.1.10 es específico de cada incubadora porque la iluminación y los reflejos varían entre las incubadoras. El objetivo es tener suficiente iluminación en la incubadora para proporcionar un buen contraste entre las moscas en cada pozo y la hoja blanca de papel detrás de la placa cuando se ve con la cámara web.
2. Realización de lasay de KD de calor
   1. Ajuste la incubadora a 37,5 oC y espere unos 30 minutos para dar a la incubadora tiempo para alcanzar y mantener la temperatura deseada. La temperatura exacta dependerá del insecto que se evalúe y de cualquier otra consideración de tiempo.
   2. Coloque la placa de 96 pozos invertida en la incubadora, de tal manera que la parte inferior de la placa (lado de malla) esté contra el papel blanco en la parte inferior de la bandeja (Figura 4). Tome nota de la orientación de los pozos (nombres de columna y fila) en la bandeja y en el marco de la cámara web. Cinta de color a lo largo de los lados de la placa de 96 pozos y los bordes de la hoja blanca de papel pueden verificar la orientación (Figura 4).
      NOTA: Asegúrese de que la temperatura de la incubadora sea consistente con la temperatura dentro de la placa de 96 pozos registrando la temperatura dentro de la placa con un termopar durante un ensayo de prueba del ensayo de calor KD. También es prudente comprobar que hay una variación insignificante en la temperatura entre los pozos de la placa de 96 pozos con múltiples termopares antes de realizar el ensayo de KD de calor.
   3. Cierre la puerta de la incubadora.
   4. Haga clic en Grabar en el software de grabación de vídeo.
   5. Después de 2 h, compruebe la grabación para ver que todas las moscas han llegado a su lugar de descanso final y han dejado de moverse. Una vez que todas las moscas han dejado de moverse, haga clic en Detener en el software de grabación de vídeo. Para los genotipos probados aquí, criados a 25 oC, la mayoría de las moscas alcanzan su KDT por 60 min a 37,5 oC (véase también J-rgensen et al.⁹).
   6. Deshágase de las moscas.
   7. Utilice los scripts de Python personalizados (Archivos de codificación suplementarios 1-3) para aproximar el tiempo en el vídeo cuando las moscas alcanzan su calor KDT.
      NOTA: El paso 2.2.7 es opcional. Para acelerar el análisis de vídeo, se desarrolló un conjunto de scripts de Python personalizados para medir los cambios en la densidad de píxeles a lo largo del tiempo en cada pozo (consulte Archivo de codificación suplementario). Cuando las moscas dejan de moverse, la densidad de píxeles es constante, y se puede utilizar una gráfica de estos datos para localizar el tiempo aproximado en el vídeo cuando las moscas son derribadas. Aunque puede ser posible utilizar este script para automatizar el análisis de datos, las ligeras imperfecciones actuales en el vídeo conducen a discrepancias menores entre los cambios en la densidad de píxeles y el tiempo de KD verdadero.
   8. Haga clic en abrir el archivo de vídeo y grabar el KDT de cada mosca en cada pozo. La medida más consistente de KDT de calor entre los ensayos y los observadores es registrar el tiempo en el que una mosca alcanza su punto de descanso final.
   9. Realice un seguimiento del vídeo en sentido inverso, centrándose en un solo pozo, y observando el momento en el que la mosca se mueve primero de su lugar de descanso final. Repita este proceso para cada pozo.

Resultados

Los límites térmicos (es decir, CT_min y KDT de calor) de las hembras del Panel de Referencia Genética de Drosophila melanogaster (DGRP) se midieron para demostrar los datos de alto rendimiento generados a partir de los dos protocolos descritos. El_{CT min} fue ensayado usando las líneas de DGRP 714 (n a 37) y 913 (n a 45). El KDT de calor fue ensayado y comparado con las líneas de DGRP 189 (n x 42) y 461 (n x 42), y los archivos de vídeo se analizaron man...

Discusión

Los dos métodos detallados anteriormente generan datos de alto rendimiento de métricas ecológicamente relevantes para los límites térmicos superior e inferior. Estos protocolos se basan en metodologías previamente establecidas comunes a la investigación sobre los límites térmicos de insectos (resumidas en Sinclair et al.) ^6.Ambos protocolos se pueden completar en un corto período de tiempo (2 h cada uno), producir conjuntos de datos con grandes tamaños de muestra, no sacrificar la r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps)	Thermo Scientific; Waltham, MA	153-5401
C922 Pro Stream Webcam	Logitech; Newark, CA	960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm	Any	Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm	United States Plastic Corp., OH	44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm	United States Plastic Corp., OH	440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm	United States Plastic Corp., OH	44041
Clear silicone sealant	Any	Any
Collection tube (15 ml)	Any	Any
Cordless Drill	Any	Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM)	TriKinetics; Waltham, MA	DFM	Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software	TriKinetics; Waltham, MA		Records data input from the DFM
Fly Storage Lid	FlySorter; Seatle, WA	FS-96LID-5PK	Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate	FlySorter; Seatle, WA	FS-96PLATE-5PK	Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray	FlySorter; Seatle, WA	FS-TRAY-5PK	Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel	Kimax	28950-75	75mm
Gutter guard	Any	Any	~0.5 cm diameter openings
Hacksaw	Any	Any
Heratherm Thermo Scientific incubator	Thermo Scientific; Waltham, MA	OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8	United States Plastic Corp., OH	61135
Hot glue gun and glue	Any	Any
Light Source	Any	Any
Magnets	Any	Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software	OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T)	OMEGA; Norwalk, CT	5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel	Any	Any	2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter	United States Plastic Corp., OH	62852
Retort ring	Any	Any	2" diameter
Retort stand	Any	Any
Retort three-prong clamp	Any	Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9)	TriKinetics; Waltham, MA	PSIU9	Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick)	Any	Any
Tape	Any	Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1)	TriKinetics; Waltham, MA	PS9-1	Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement	United States Plastic Corp., OH	45737