Analisi ad alta velocità di produzione dei limiti termici critici negli insetti

Riepilogo

I limiti termici possono prevedere gli ambienti che gli organismi tollerano, che sono informazioni preziose di fronte al rapido cambiamento climatico. Qui descritti sono protocolli ad alto rendimento per valutare il minimo termico critico e il tempo di abbattimento del calore negli insetti. Entrambi i protocolli massimizzano la velocità effettiva e riducono al minimo il costo dei test.

Abstract

I limiti termici superiori e inferiori di piante e animali sono importanti predittori delle loro prestazioni, sopravvivenza e distribuzioni geografiche e sono essenziali per prevedere le risposte ai cambiamenti climatici. Questo lavoro descrive due protocolli ad alto rendimento per misurare i limiti termici degli insetti: uno per la valutazione della minima termica critica (CT_min)e l'altro per la valutazione del tempo di down del calore (KDT) in risposta a uno stress termico statico. Nel_saggio min CT, gli individui sono collocati in una colonna acrilica-jacketed, sottoposti a una rampa di temperatura decrescente, e contati come cadono dai loro posatoi utilizzando un sensore a infrarossi. Nel saggio termico KDT, gli individui sono contenuti in una piastra di 96 porri, collocata in un'incubatrice impostata su una temperatura stressante e calda e video registrato per determinare il momento in cui non possono più rimanere in posizione verticale e muoversi. Questi protocolli offrono vantaggi rispetto alle tecniche di uso comune. Entrambi i test sono a basso costo e possono essere completati relativamente rapidamente (2 h). Il saggio_{CT min} riduce l'errore dello sperimentatore e può misurare un gran numero di individui contemporaneamente. Il protocollo termo-KDT genera una registrazione video di ogni saggio e quindi rimuove la distorsione dello sperimentatore e la necessità di monitorare continuamente gli individui in tempo reale.

Introduzione

Limiti termici degli insetti
La variazione delle condizioni ambientali, compresa la temperatura, è un fattore importante che influenza le prestazioni, la forma fisica, la sopravvivenza e la distribuzione geografica degli^{organismi 1,2}. I limiti termici superiori e inferiori determinano la gamma teorica di ambienti che un organismo può tollerare e, pertanto, questi limiti sono importanti predittori delle distribuzioni vegetali e animali, soprattutto di fronte ai cambiamenti^{climatici 3,4}. Pertanto, i protocolli per misurare con precisione i limiti termici sono strumenti importanti per ecologisti, fisiologi, biologi evoluzionisti e biologi della conservazione, tra gli altri.

Come gli animali terrestri più abbondanti e diversi, gli insetti sono spesso utilizzati per misurazioni dei limiti termici. Le maxima termiche critiche (CT_max) e la minima termica critica (CT_min)sono comunemente utilizzate per valutare le variazioni intra e interspecifiche nella tolleranza^{termica 5,6,7}. Mentre CT_{max e} CT_{min possono} essere misurati per più fenotipi, tra cui la crescita, la produzione riproduttiva e il comportamento, sono più comunemente applicati alla funzione locomotore^5,6,7. Così, CT_max (chiamato anche temperatura di knockdown di calore) e CT_min sono spesso definiti come le alte e basse temperature a cui gli insetti perdono la funzione motoria e non sono in grado di rimanere in posizione^{verticale 5,6,7,8,9,10,11}. CT_min coincide con l'insorgenza del coma freddo, una paralisi reversibile causata da temperature fredde⁶. Mentre la paralisi ai limiti termici è spesso reversibile, l'esposizione continua a queste temperature porta alla morte ecologica⁵.

Metodi comuni per misurare i limiti termici
Una varietà di apparati sono stati utilizzati per misurare i limiti termici (riepilogo in Sinclair et al.) ⁶. Brevemente, gli insetti vengono riscaldati o raffreddati in incubatrici^12,13, contenitori sommersi in bagni fluidi^11,14,15,16, blocchi di alluminio^10,17, o contenitori con giubbotto¹⁸, e monitorati fino a quando la locomozione cessa. Per monitorare gli insetti durante il test, il metodo più comune è l'osservazione diretta, in cui gli individui sono continuamente monitorati in tempo reale o retrospettivamente con video^{registrati 6,9,10,11,15,17}. Mentre i metodi di osservazione diretta hanno requisiti minimi di equipaggiamento, sono ad alta intensità di manodopera e limitano la produttività. In alternativa, gli insetti possono essere osservati indirettamente raccogliendo individui in momenti discreti quando cadono dai posatoi^6,19,20,21 o utilizzando monitor di attivit๳.

I metodi indiretti per la misurazione dei limiti termici sono generalmente più elevati e potenzialmente meno soggetti a errori rispetto ai metodi di osservazione diretta. Il metodo più comune per il monitoraggio indiretto utilizza una colonna con temperatura^{controllata 6,8,19,20,21}. Gli insetti sono posizionati all'interno di una colonna con posatoi, e la temperatura della camera interna è controllata da pompaggio di liquido da un bagno fluido a temperatura controllata attraverso il rivestimento con la giacca della colonna. Gli individui che raggiungono il loro limite termico cadono dal loro tresico e vengono raccolti a temperature discrete o intervalli di tempo. Mentre questo metodo funziona bene per CT_min, è stato trovato inadatto per CT_max, perché le mosche camminano volontariamente fuori dal fondo della colonna quando la temperatura aumenta. Il nuovo metodo qui descritto elude questo problema mediante la condilenza individuale dei mosche durante le misurazioni automatizzate.

Oltre al metodo di osservazione, due tipi di regimi di temperatura sono comunemente utilizzati per valutare i limiti termici superiori. I saggi dinamici consistono nell'aumentare gradualmente la temperatura fino alla perdita della funzione motoria; che la temperatura è la dinamica CT_max^7,8,9,13. Al contrario, i saggi statici consistono in una temperatura costante stressante fino alla perdita della funzione motoria; quel punto di tempo è il tempo di knockdown di calore (heat KDT), chiamato anche il CT_max statico (sCT_max) in un recente documento di J'rgensen et al.^7,8,9,16,22. Anche se_{i test} di TC max e heat knockdown (analisi di calore KD) producono metriche con unità diverse, la modellazione matematica dei due tratti indica che danno informazioni comparabili sulla tolleranza al calore e sono entrambi ecologicamente^{rilevanti 8,9}. I saggi dinamici producono una temperatura che può essere paragonata alle condizioni ambientali, e sono preferibili quando ci sono grandi differenze nella tolleranza al calore, come i confronti tra specie con nicchie termiche molto diverse. Tuttavia, a causa dell'elevato Q10 per l'accumulo di lesioni termico, un saggio statico può essere preferibile per rilevare piccole dimensioni di effetto, come la variazione intraspecifica nella tolleranza al^{calore 9}. Inoltre, in pratica, un saggio statico richiede attrezzature meno sofisticate di un saggio dinamico.

Obiettivo
L'obiettivo di questo documento è formalizzare i metodi per i test_{TC min} e heat KD che possono essere utilizzati nella ricerca futura per valutare i limiti termici degli insetti motile. I protocolli sono adattati da metodologie precedentemente stabilite e sono progettati per essere ad alta velocità effettiva, automatizzati e convenienti. Entrambi i test possono essere completati in un breve lasso di tempo (2 h), il che significa che più esperimenti possono essere condotti in un solo giorno, producendo grandi quantità di dati senza sacrificare ripetibilità o precisione. Con questa configurazione, la tolleranza al calore di 96 mosche può essere misurata contemporaneamente, mentre la colonna per CT_min può contenere più di 100 mosche, a condizione che vi sia una superficie adeguata per appollaiare.

Il metodo ad alta velocità effettiva per osservare CT_min modifica la metodologia comune delle colonne con l'aggiunta di un sensore a infrarossi per contare automaticamente le mosche. L'uso di un sensore a infrarossi per il conteggio è stato²³ proposto per la prima volta da Shuman et al. L'aggiunta del sensore a infrarossi consente la generazione di dati continui anziché la raccolta di dati a intervalli discreti. Questo protocollo riduce anche al minimo l'errore dello sperimentatore eliminando l'immissione manuale dei dati e la necessità di passare manualmente i tubi di raccolta sotto la colonna jacked in punti di tempo discreti.

Il metodo ad alto rendimento per la registrazione del KDT termico viene modificato da due studi precedenti sulla tolleranza al calore negli^{insetti 10,12}. Le singole mosche vengono conservate in una piastra di 96 po 'in un'incubatrice a temperatura controllata e viene registrato il video. Questo protocollo riduce al minimo la distorsione dello sperimentatore nel determinare il KDT termico perché gli esperimenti possono essere rivisti e verificati eseguendo la riproduzione della registrazione. Questo protocollo fornisce anche una serie di script Python personalizzati che possono essere utilizzati per velocizzare l'analisi video. L'uso di singoli pozzi elimina le interferenze che possono verificarsi quando altri individui si muovono o cadono, che può essere un problema quando gruppi di individui sono osservati nella stessa arena^10,17. Inoltre, l'incubatrice a temperatura controllata fornisce una temperatura stabile in tutti i 96 pozzi, a differenza del gradiente di temperatura talvolta osservato in un blocco di alluminio controllato dalla^{temperatura 10}. Si noti inoltre che il metodo di registrazione dei 96 well può essere adattato per misurare la CT_max dinamica e potenzialmente LA CT_min (vedi Discussione).

Per dimostrare ogni protocollo, i limiti termici delle femmine adulte di Drosophila melanogaster da alcune linee del Pannello di riferimento genetico drosophila melanogaster (DGRP) sono stati^{confrontati 24}. Queste linee sono state selezionate perché gli esperimenti preliminari hanno indicato differenze significative nella tolleranza termica. Questi saggi si sono rivelati metodi robusti per discriminare le differenze nella tolleranza termica. I seguenti due protocolli, il saggio CT_{min ad alta velocità} (sezione 1) e il saggio KD termico ad alta velocità (sezione 2), descrivono le azioni necessarie per produrre dati KDT TC_min e heat per qualsiasi fase di vita degli insetti motile in grado di adattarsi agli apparati, come la Drosophilaadulta. Per CT_{min è} anche essenziale che l'insetto sia in grado di persico. Qui, ogni saggio è dimostrato in adulto Drosophila melanogaster. Tuttavia, possono essere necessarie modifiche per altre fasi di taxa o di vita⁶. Piccoli cambiamenti potrebbero includere l'utilizzo di materiale appollaiato con aperture più grandi per ospitare campioni più_grandi nel saggio min CT o l'utilizzo di una fotocamera di qualità superiore per discernere il sottile KDT di un insetto in movimento lento o di una fase di vita nel saggio KD di calore. Questo protocollo non descrive i metodi per la preparazione dei mosche, ma è importante standardizzare i protocolli di allevamento per garantire la ripetibilità²⁵ (vedi Garcia e Teets²⁶ e Teets e Hahn²⁷). I protocolli forniti includono informazioni su come costruire e impostare gli apparati, come registrare le misurazioni e una breve descrizione dell'analisi dei dati.

Protocollo

1. Analisi CT min ad_alta velocità effettiva

1. Assemblaggio della colonna con la giacca(Figura 1A, Figura 2)
   1. Tagliare i tubi acrilici più larghi (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) e più stretti (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) a lunghezze uguali (31,5 cm) con un seghetto(Figura 2A). Questi due tubi saranno le pareti esterne e più interne della colonna con la giacca.
   2. Tagliare due anelli (2 cm di larghezza) dal tubo acrilico di medie dimensioni (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) con un seghetto(Figura 2A). Questi due anelli saranno i distanziali tra i tubi interni e più esterni, creando uno spazio tra i due lunghi tubi acrilici per il fluido a fluire.
   3. Praticare con cura due fori nel tubo acrilico esterno (più largo), un foro in alto e uno in basso. Assicurarsi che ogni foro sia di 3,5 cm dalla fine del tubo. Forare i fori sui lati opposti del tubo (Figura 2B).
   4. Per ridurre la fessurazione, posizionare il nastro sul tubo sul punto del foro futuro e praticare molto lentamente sull'impostazione della coppia più bassa del trapano.
   5. Utilizzando il rubinetto di filettatura, infilare entrambi i fori in modo che gli adattatori del tubo tubo possano essere avvitati nei due fori del tubo esterno. Per ridurre la fessurazione, utilizzare il lubrificante e filo lentamente a mano.
   6. Far scorrere i due distanziatori sulla giacca interna, uno ad ogni estremità (in basso e in alto). Lasciare un piccolo spazio (0,5 cm) tra il distanziale e la fine della giacca interna (Figura 2B).
   7. Saldare i distanziali in posizione utilizzando cemento acrilico.
   8. Dopo il cemento sulla tubo d'aria e distanziali set, far scorrere questo costrutto nel tubo esterno più grande con i fori. Assicurarsi che le estremità esterne e interne siano a filo su entrambe le estremità. I distanziatori saranno di 0,5 cm dalla fine, formando piccole trincee su entrambe le estremità della colonna (Figura 2C).
   9. Saldare il tubo esterno ai distanziali utilizzando cemento acrilico, utilizzando morsetti in acciaio regolabili per tenere insieme l'apparecchio. Attendere che il cemento si set.
   10. Infilare gli adattatori del tubo tubo nei fori del tubo esterno ora fissati ai distanziali e alla tubo interno.
       NOTA: Gli adattatori devono solo infilare nel tubo esterno e non nello spazio aperto tra i tubi interni ed esterni. Se gli adattatori tubo si infilano troppo, accorciarli alla lunghezza appropriata con un seghetto.
   11. Sigillare gli adattatori del tubo in fili sul tubo esterno con sigillante in silicone.
   12. Riempire le due trincee tra i tubi interni ed esterni ad entrambe le estremità della colonna con la giacca con sigillante in silicone.
   13. Per testare la colonna, collegare tubi di diametro 0,6 cm agli adattatori del tubo. Collegare l'adattatore nella parte inferiore della colonna a una fonte d'acqua con tubi e l'adattatore nella parte superiore della colonna a uno scarico con un altro pezzo di tubazione.
   14. Eseguire l'acqua attraverso l'apparato dal basso verso l'alto e verificare la presenza di perdite. Se ci sono perdite, identificare da dove provengono e sigillare con silicone.
2. Impostazione della colonna con la giacca e del monitor a imbuto Drosophila (DFM)
   1. Fissare la colonna con la giacca a un supporto di ristoro con un morsetto a tre prong retort. Allineare la colonna verticalmente con un'estremità aperta al soffitto e l'altra aperta al banco di laboratorio (Figura 1B).
   2. Collegare l'ingresso fluido e l'uscita da un bagno refrigerato a temperatura controllata agli ugelli dell'adattatore della colonna con tubi di plastica di 0,6 cm di diametro (Figura 1B). Collegare l'input fluido all'ugello nella parte inferiore della colonna e l'uscita del fluido all'ugello nella parte superiore della colonna.
   3. Tagliare due spine isolanti circolari spesse 3 cm (la stessa circonferenza dell'apertura del compartimento più interno della colonna). Assicurarsi che le spine si adattino perfettamente e sigillare la colonna più interna quando vengono inserite a entrambe le estremità (Figura 1B).
   4. Forare un foro attraverso il centro di uno dei tappi e infilare l'estremità nuda di un termocoppia attraverso il foro di circa 5 cm e fissare con nastro adesivo. Collegare l'altra estremità del termocopo in un registratore di dati termocoppia.
   5. Collegare il registratore di dati termocoppia al computer.
   6. Incuneare due pezzi di protezione di grondaia di plastica (5 cm x 7 cm, con aperture di diametro di 0,5 cm) all'interno della colonna per funzionare come materiale per arrotoglie. Posizionare un pezzo di protezione 2/3^rds dalla parte superiore della colonna e l'altro 1/3^rd dalla parte superiore della colonna (Figura 1B).
   7. Fissare la spina inferiore (senza termocoppia) e la spina superiore (con un termocoppia). Quando la spina viene inserita nella parte superiore della colonna, assicurarsi che il termocoppia non tocchi i lati della colonna.
   8. Regolare l'altezza della colonna sul supporto di ritort in modo che ci sia una distanza di 25 cm tra la parte inferiore della colonna e la parte superiore della panca.
   9. Fissare un anello di risposta (diametro 5 cm) al supporto di risposta 5 cm sotto la parte inferiore della colonna e ruotare l'anello sul lato della colonna.
   10. Impostare il DFM direttamente sull'anello di ristoro (Figura 1B). Collegare tutti i componenti elettronici: l'alimentatore, l'interfaccia di alimentazione e il computer in base al protocollo del produttore.
   11. Una volta collegati i componenti, seguire il protocollo del produttore per completare la configurazione del software DFM e DFM.
3. Ct_Minimo Saggio
   1. Ruotare le valvole di ingresso e uscita del bagno fluido nelle posizioni aperte.
   2. Premere il pulsante di alimentazione per accendere il bagno fluido a temperatura controllata e quindi premere il pulsante di riproduzione per eseguire un programma di sollevamento e mantenere la temperatura del bagno a 25 gradi centigradi. Dare il bagno fluido e la colonna 5-10 min per raggiungere e mantenere 25 gradi centigradi.
   3. Rimuovere la spina nella parte superiore della colonna e sostituirla con un imbuto (diametro 5,08 cm; vedere la figura 1C).
   4. Tap vola dalla loro fiala alimentare nella colonna.
   5. Rimuovere l'imbuto e sostituirlo rapidamente con la spina superiore, facendo attenzione a non lasciare che le mosche sfuggise. Dare le mosche 5 minuti per stabilirsi, di tanto in tanto toccando la spina inferiore per incoraggiare le mosche a salire.
   6. Premere il pulsante di avvio sul bagno fluido e iniziare il programma di rampa CT_min (25 gradi centigradi per 5 minuti; da 25 a 10 gradi centigradi a 0,5 gradi centigradi; 10 gradi centigradi per 2 min; quindi da 10 gradi centigradi a -10 gradi centigradi a 0,25 gradi centigradi/ min).
      NOTA: Altre varianti di questo protocollo di rampa CT_min possono essere utilizzate a seconda della domanda di ricerca (ad esempio, confronti degli effetti dei diversi tassi di rampa su CT_min²⁸).
   7. Fare clic su apri il software di registrazione termocoppia sul computer, quindi fare clic sull'icona Registra per iniziare a registrare la temperatura all'interno della colonna ogni secondo per la durata del saggio. Assicurarsi che ogni registrazione della temperatura includa un timestamp specifico per il secondo, in modo che i dati di temperatura possano essere successivamente uniti ai dati del DFM.
   8. Aggiungere 5 mL del 90% di etanolo a un tubo di centrifuga conica da 15 mL e posizionarlo in un rack sotto la colonna.
   9. Occasionalmente, tocca la spina inferiore della colonna per invogliare le mosche sul fondo a salire. La maggior parte delle mosche sarà su un tresico o vicino alla parte superiore della colonna di 15 gradi centigradi.
   10. A 15 gradi centigradi, rimuovere la spina inferiore e raccogliere eventuali mosche ancora sulla spina inferiore nell'etanolo. Contare e notare che queste mosche sono state raccolte a 15 gradi centigradi, ma il loro_{min CT} è sconosciuto.
       NOTA: La temperatura alla quale viene rimossa la spina inferiore deve essere decisa prima del saggio e in base al min CT_{previsto della} specie di prova o del trattamento. Per questo saggio, è stato scelto 15 gradi centigradi in base al CT_min di queste particolari linee DGRP trovate nei saggi preliminari.
   11. Inserire un imbuto di vetro di 75 mm di diametro esterno nel DFM. Regolare l'anello di ristoro, DFM e imbuto in modo che siano sotto la colonna. Assicurarsi che il labbro dell'imbuto sigilli completamente la parte inferiore della colonna (Figura 1D).
   12. Inserire la parte inferiore dell'imbuto nel tubo di raccolta di 15 mL (Figura 1D).
   13. Aprire il software DFM sul computer facendo clic sull'icona Software. Il software inizierà immediatamente a registrare l'ora / data in cui i voli raggiungono il loro CT_min. Le mosche che raggiungono la_{loro TC min} perdono la funzione neuromuscolare e cadono dai loro posatoi, e successivamente attraverso il DFM.
   14. Monitorare se tutte le mosche hanno raggiunto il loro_{CT min} come la temperatura diminuisce controllando la spina superiore e posatoi per vedere se eventuali mosche sono ancora arroccati (cioè, mantenendo ancora la funzione neuromuscolare). La prova termina quando tutte le mosche hanno raggiunto il loro CT_min.
   15. Al termine della prova, regolare il DFM e allontanarlo dall'apertura della colonna. Alcune mosche possono raggiungere il loro CT_min ma rimangono bloccate nella colonna (cioè incuneate in un tresico o penzolanti da un singolo gancio tarsale). Aprire la spina superiore e rimuovere queste mosche. Il CT_min di queste mosche è sconosciuto.
   16. Combinare i file di output .txt del software di registrazione termocoppia (ad esempio, temperatura, data e ora) e il software DFM (ad esempio, il numero di mosche attraverso l'imbuto, la data e l'ora) utilizzando il comando Merge in RStudio. Unire i due file in base alla variabile di data/ora condivisa.

2. Analisi KD di calore ad alta velocità

1. Assemblaggio e preparazione dell'apparato
   1. Con un adesivo, fissare la rete metallica intrecciata in acciaio (apertura di 1,5 mm) sul fondo di una piastra 96 ben senza fondo.
   2. Attaccare i magneti ai lati opposti del fondo di una piastra 96 ben senza fondo con una pistola a colla a caldo e colla a caldo (Figura 3).
   3. Per creare un coperchio del setto personalizzato con pellicola adesiva progettata per 96 piastre di pozzo, attaccare due pellicole lati appiccicosi insieme per formare un foglio di plastica snodato.
   4. Posizionare i fogli di plastica sopra la piastra del pozzo 96 e utilizzare il nastro adesivo per aderire a tutti e quattro i lati della piastra. Sopra l'apertura di ogni pozzo sulla piastra, tagliare una 'x' nel foglio di plastica con una taglierina scatola (cioè, 96 x totali).
   5. L'anestesia vola con CO_{2 e} le carica individualmente in ogni pozzo della piastra 96 ben senza fondo modificata con un coperchio aspiratore e setto. Togliere il coperchio del setto dalla piastra del pozzo 96 mentre le mosche sono anetitezzate con CO₂ e sostituirle con un coperchio chiaro aderente.
   6. Posizionare il piatto 96 ben senza fondo caricato con mosche e con un coperchio aderente chiaro sul cibo. Assicurarsi che le mosche abbiano almeno 48 h tra l'anesthetizzazione_co-2 e l'inizio del saggio (punti 2.2.1-2.2.5).
      NOTA: Il fondo delle piastre modificate 96 ben senza fondo è fatto di rete, quindi le mosche anethetized con CO₂ possono essere caricate e lasciate sul cibo per almeno 48 h prima dell'inizio di una prova. Qualsiasi contenitore di plastica >8,5 cm di larghezza x 13 cm di lunghezza che è almeno 2 cm di profondità per ospitare uno strato di cibo profondo 1 cm può essere utilizzato.
   7. Fissare una webcam sul fondo dell'interno di un incubatore a temperatura controllata con nastro adesivo. Puntare la fotocamera direttamente verso l'alto (Figura 4). Fissare uno scaffale dell'incubatrice a circa 10 cm sopra la fotocamera.
      NOTA: La webcam punta verso l'alto e registra la piastra del pozzo 96 dal basso per garantire che la maggior parte della superficie del pozzo sia in vista possibile (ad esempio, non bloccata dalla vista dalle pareti del pozzo della piastra). Quando le mosche raggiungono il loro KDT cadono in fondo al pozzo; in questo caso, il lato più vicino alla webcam, e sono quindi in vista indipendentemente da quanto il loro bene è dal centro di vista.
   8. Collegare la webcam a un computer.
   9. Con il nastro, fissare un foglio bianco di carta (8,5 cm x 13 cm; l'area esatta della parte inferiore della piastra del pozzo 96) alla parte inferiore del ripiano (Figura 4). Assicurarsi che la carta riempia l'intero fotogramma quando viene visualizzata tramite la webcam.
   10. Inserire una fonte di luce nell'incubatrice. Utilizzare carta o altri materiali per smorzare l'illuminazione e ridurre al minimo l'abbagliamento.
       NOTA Il punto 2.1.10 è specifico per ogni incubatrice perché l'illuminazione e i riflessi variano tra le incubatrici. L'obiettivo è quello di avere sufficiente illuminazione nell'incubatrice per fornire un buon contrasto tra le mosche in ogni pozzo e il foglio bianco di carta dietro la piastra quando viene visualizzato con la webcam.
2. Esecuzione del test di calore KD
   1. Impostare l'incubatrice a 37,5 gradi centigradi e attendere circa 30 minuti per dare all'incubatrice il tempo di raggiungere e mantenere la temperatura desiderata. La temperatura esatta dipenderà dall'insetto valutato e da eventuali altre considerazioni di tempo.
   2. Posizionare la piastra del pozzo 96 invertita nell'incubatrice, in modo che il fondo della piastra (lato mesh) sia contro la carta bianca sul fondo del vassoio (Figura 4). Prendere nota dell'orientamento dei pozzetti (nomi di colonne e righe) sul vassoio e nella cornice della webcam. Nastro colorato lungo i lati della piastra del pozzo 96 e bordi del pezzo di carta bianco può verificare l'orientamento (Figura 4).
      NOTA: Assicurarsi che la temperatura dell'incubatrice sia coerente con la temperatura all'interno della piastra del pozzo 96 registrando la temperatura all'interno della piastra con una termocoppia durante una prova di prova del saggio di calore KD. È anche prudente verificare che vi sia una variazione trascurabile della temperatura tra i pozzetti della piastra del pozzo 96 con termocoppie multiple prima di condurre il test di calore KD.
   3. Chiudere lo porta dell'incubatrice.
   4. Fare clic su Registra sul software di registrazione video.
   5. Dopo 2 h, controllare la registrazione per vedere che tutte le mosche hanno raggiunto il loro punto di riposo finale e smesso di muoversi. Una volta che tutte le mosche hanno smesso di muoversi, fare clic su Interrompi sul software di registrazione video. Per i genotipi qui testati, allevati a 25 gradi centigradi, la maggior parte delle mosche raggiunge il proprio KDT di 60 min a 37,5 gradi centigradi (c'è anche il numero di voli (vedere anche J'rgensen et al.⁹).
   6. Smaltire le mosche.
   7. Utilizzare gli script Python personalizzati (Supplementary Coding Files 1-3) per approssimare il tempo nel video quando i mosche raggiungono il loro KDT di calore.
      NOTA: il passaggio 2.2.7 è facoltativo. Per velocizzare l'analisi video, è stato sviluppato un set di script Python personalizzati per misurare le variazioni della densità dei pixel nel tempo in ogni pozzo (vedere File di codifica supplementare). Quando le mosche smettono di muoversi, la densità dei pixel è costante e un grafico di questi dati può essere utilizzato per individuare il tempo approssimativo nel video quando le mosche vengono abbattute. Anche se potrebbe essere possibile utilizzare questo script per automatizzare l'analisi dei dati, attualmente lievi imperfezioni nel video portano a discrepanze minori tra le variazioni nella densità dei pixel e il vero tempo KD.
   8. Fare clic su aprire il file video e registrare il KDT di ogni volo in ogni pozzo. La misura più consistente del KDT di calore tra le prove e gli osservatori è la registrazione del momento in cui una mosca raggiunge il suo punto di riposo finale.
   9. Traccia il video al contrario, concentrandoti su un singolo pozzo e notando il momento in cui la mosca si sposta per prima dal suo punto di riposo finale. Ripetere questo processo per ogni pozzo.

Risultati

I limiti termici (ad esempio, CT_min e heat KDT) delle femmine del Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) sono stati misurati per dimostrare i dati ad alto rendimento generati dai due protocolli descritti. La CT_min è stata analizzata utilizzando le linee DGRP 714 (n - 37) e 913 (n - 45). Heat KDT è stato analizzato e confrontato con le linee DGRP 189 (n - 42) e 461 (n - 42), e i file video sono stati analizzati manualmente. Il tempo totale d...

Discussione

I due metodi descritti in precedenza generano dati ad alta velocità di produzione di metriche ecologicamente rilevanti per i limiti termici superiori e inferiori. Questi protocolli si basano su metodologie precedentemente stabilite comuni alla ricerca sui limiti termici degli insetti (riepilogati in Sinclair et al.) ⁶. Entrambi i protocolli possono essere completati in un breve lasso di tempo (2 h ciascuno), produrre set di dati con grandi dimensioni del campione, non sacrificare la ripetibil...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps)	Thermo Scientific; Waltham, MA	153-5401
C922 Pro Stream Webcam	Logitech; Newark, CA	960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm	Any	Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm	United States Plastic Corp., OH	44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm	United States Plastic Corp., OH	440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm	United States Plastic Corp., OH	44041
Clear silicone sealant	Any	Any
Collection tube (15 ml)	Any	Any
Cordless Drill	Any	Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM)	TriKinetics; Waltham, MA	DFM	Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software	TriKinetics; Waltham, MA		Records data input from the DFM
Fly Storage Lid	FlySorter; Seatle, WA	FS-96LID-5PK	Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate	FlySorter; Seatle, WA	FS-96PLATE-5PK	Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray	FlySorter; Seatle, WA	FS-TRAY-5PK	Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel	Kimax	28950-75	75mm
Gutter guard	Any	Any	~0.5 cm diameter openings
Hacksaw	Any	Any
Heratherm Thermo Scientific incubator	Thermo Scientific; Waltham, MA	OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8	United States Plastic Corp., OH	61135
Hot glue gun and glue	Any	Any
Light Source	Any	Any
Magnets	Any	Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software	OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T)	OMEGA; Norwalk, CT	5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel	Any	Any	2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter	United States Plastic Corp., OH	62852
Retort ring	Any	Any	2" diameter
Retort stand	Any	Any
Retort three-prong clamp	Any	Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9)	TriKinetics; Waltham, MA	PSIU9	Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick)	Any	Any
Tape	Any	Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1)	TriKinetics; Waltham, MA	PS9-1	Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement	United States Plastic Corp., OH	45737