مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي

Summary

مقايسة الجسم الحي السابق المذكورة في هذه الدراسة باستخدام مستخلصات التجانس الأمعاء وتلطيخ المناعة الفلوريس يمثل طريقة جديدة لدراسة التشكل الواصل من المبيضات albicans في الجهاز الهضمي. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في الإشارات البيئية التي تنظم التحول المورفوجينيك في القناة الهضمية.

Abstract

المبيضات albicans الواصلة morphogenesi في الجهاز الهضمي (GI) يتم التحكم بإحكام من قبل مختلف الإشارات البيئية، ويلعب دورا هاما في نشر والعوامل المسببة للأمراض الفطرية الانتهازية. ومع ذلك، طرق لتصور هيفا الفطرية في الجهاز الهضمي في الجسم الحي هي التحدي الذي يحد من فهم الإشارات البيئية في السيطرة على عملية تكوين هذه المورفون. البروتوكول الموصوف هنا يوضح طريقة رواية ex vivo للتصور من المورفينجينيات الواصلة في مقتطفات متجانسة الأمعاء. باستخدام مقايسة الجسم الحي السابق ، توضح هذه الدراسة أن محتويات cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ، ولكن ليس من فئران التحكم غير المعالجة ، تعزز تولد الواصلة C. alphcans في محتوى الأمعاء. وعلاوة على ذلك، إضافة مجموعات محددة من الأيض الأمعاء مرة أخرى إلى محتويات cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ينظم بشكل تفاضلي الفرتال morphogenesis السابقين. يمثل هذا البروتوكول، الذي يُؤخذ معًا، طريقة جديدة لتحديد الإشارات البيئية التي تتحكم في التشكل الواصلي C. albicans في الجهاز الهضمي والتحقيق فيها.

Introduction

المبيضات albicans هو الانتهازية ، متعدد الأشكال المسببة للأمراض الفطرية التي عادة ما تكون commensal ، ولكن يمكن أن تخضع لتغيير مورفولوجية في شكل خبيث قادر على التسبب في التهابات تهدد الحياة في الأفراد المناعة^{1،2،3،4،5،6،8،9،11،12،13}. C. albicans هو السبب الرئيسي للعدوى الانسومية الجهازية، مع معدل وفيات 40\u201260٪ حتى مع العلاج المضاد للفطريات^2،14،15. على الرغم من أن C. albicans يقيم في مختلف المنافذ المضيفة بما في ذلك الجهاز التناسلي الإناث^16,17, تجويف الفم من الأفراد الأصحاء¹⁸ والجهاز الهضمي (GI) المسالك^19,20, الغالبية العظمى من الالتهابات الجهازية تنشأ من الجهاز الهضمي وعلاوة على ذلك, وكثيرا ما أكد مصدر العدوى الجهازية أن الجهاز الهضمي^{21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32،33،34}. C. تتأثر الإمراضية albicans في الجهاز الهضمي بمجموعة واسعة من العوامل; ومع ذلك ، فإن السمة الرئيسية الضرورية للوعاء هي الانتقال من مورفولوجيا خلية الخميرة إلى مورفولوجيا الخلايا الواصلة^{35،36،37،38،39،40،41،42،43،44}. C. albicans التعلق والنشر من الجهاز الهضمي أثناء العدوى يرتبط بشدة مع قدرته على الانتقال من خميرة commensal إلى hyphae ضراوة، مما يسمح للفطريات أن تسبب الأمراض الغازية^{44،45،46،47،48،49،}50^،51،52،53.

مجموعة متنوعة من العوامل في الأمعاء، بما في ذلك ن أسيتيلغلوسكامين، تنظيم تشكيل الواصلة من قبل C. albicans . ولذلك، فمن الأهمية بمكان لتضييق الفجوة في المعرفة فيما يتعلق بتشكل الغشاء الواصل لهذا الممرض الفطري في الجهاز الهضمي^54،55،56. تشير الأدلة الحديثة إلى أن مختلف الأيضات الأمعاء السيطرة بشكل تفاضلي في morphogenesis الواصلة من C. albicans في المختبر^57,58,59,60. ومع ذلك، تشكل القيود التقنية قضايا عند محاولة دراسة تكوّن الأمعاء في عينات الأمعاء الحية في العينات، خاصة تلطيخ الخميرة وخلايا الواصلة والتحليل الكمي لتطوير الواصلة. لفهم C. albicans الواصلة morphogenesis في الجهاز الهضمي، تم تطوير طريقة فيفو السابق باستخدام مقتطفات قابلة للذوبان من محتوى الأمعاء المتجانسة من الفئران لدراسة تأثير الأيض على تكوين الواصلات الفطرية. استخدام عينات الأمعاء من الفئران التي هي مقاومة وعرضة لعدوى ج. albicans GI، وهذه الطريقة سوف تساعد على تحديد ودراسة تأثير الأيض والمضادات الحيوية وxenobiotics على تكوين الحمى الفطرية في الجهاز الهضمي.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوان من قبل جامعة الغرب الأوسط لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدام (IACUC) كما هو موضح قبل⁵⁷. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في جامعة الغرب الأوسط على هذه الدراسة بموجب بروتوكول MWU IACUC #2894. وتتبع سياسات رعاية الحيوانات في وزارة المياه والحيوانات سياسة خدمات الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية والسياسات المنصوص عليها في قانون رعاية الحيوان.

1. الفئران دراسة البروتوكول القياسي

1. استخدام الفئران C57BL/6J الذكور والإناث على الأقل ستة أسابيع من العمر. تكملة لهم مع الماء المعقم مع أو بدون cefoperazone (0.5 ملغ / مل).
   1. شارك الفئران في مجموعات من 5 ، مع كل قفص يحتوي إما على جميع الفئران الذكور أو جميع الإناث. توفير الفئران الماوس القياسية تشاو والمياه (عن طريق زجاجة 400 مل) في جميع الأوقات.
   2. تحقق من الأقفاص يومياً لضمان أن تكون مستويات الطعام والماء كافية، وفحص الفئران بحثًا عن علامات الضيق.
2. استبدال المياه مع cefoperazone كل 48 ح لضمان توفير المضادات الحيوية الطازجة بغض النظر عن المياه المتبقية في زجاجات التغذية القفص.
3. بعد 5\u20127 أيام من العلاج cefoperazone، القتل الرحيم الفئران عن طريق CO₂ الاختناق مراقبة بروتوكول IACUC المنشأة. تأكيد الموت عن طريق خلع عنق الرحم.
4. تشريح الفئران باستخدام مقص حاد معقم الأوتوكلاف الحادة والملقط المعقم الأوتوكلاف.
   1. بعد القتل الرحيم ، قم بتأمين الحيوان على سطح تشريح عن طريق تثبيت جميع الأطراف بحيث يتعرض البطن.
   2. رش منطقة البطن مع الإيثانول 70٪ لمنع الفراء من الالتصاق بالملقط، مقص، أو أقسام الأمعاء أثناء تشريح.
   3. استخدام ملقط لقرصة ورفع قسم من الجلد في قاعدة البطن وخلق شق صغير من خلال الجلد واللفافة الكامنة باستخدام مقص. اتخاذ الحذر الشديد عند إجراء هذا الشق لتجنب ثقب الأعز أو جدار الأمعاء.
   4. تمديد هذا قطع إلى القفص الصدري، وفضح جزئيا تجويف البريتوني. جعل خفض بدءا من نقطة الشق الأولي على جانبي تمتد صعودا وشقيا.
   5. سحب هذه اللوحات بشكلٍ ثنائية، ودبوس على السطح المُشَرِّح لفضح التجويف البريتوني بشكل كامل.
5. استخراج الجهاز الهضمي باستخدام ملقط، في حين استخدام مقص لجعل تخفيضات متفوقة على المعدة وفي منطقة القاصي من الأمعاء الغليظة لضمان جمع أكبر قدر من محتوى الأمعاء من كل قسم.
6. عند إزالة الجهاز الهضمي، يجب الحرص على تجنب تمزق المكونات الفردية. فصل المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة والأمعاء الغليظة بشكل فردي باستخدام مقص في نهاياتها القريبة وفص.
7. لجمع كل محتويات الأمعاء من كل قسم، وجعل شق واحد في نهاية بعيدة من كل قسم باستخدام مقص، تليها يدويا طرد محتوى القناة الهضمية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل باستخدام ملقط.
8. تخزين محتويات القناة الهضمية في -80 درجة مئوية لجراسيس الجسم الحي السابق.

2. إعداد الخميرة استخراج بيبتون ديكستروز (YPD) لوحات أجار

1. إلى زجاجة 1 لتر إضافة 25 غرام من الخميرة استخراج بيبتون ديكستروز مرق مسحوق, 10 غرام من أجار, والمياه فائقة الخطورة إلى حجم النهائي من 500 مل.
2. أوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على دورة سائلة لتعقيم الوسائط.
3. تحت غطاء تدفق لارينار، صب ما يقرب من 20 مل من وسائل الإعلام أجار في لوحة بيتري العقيمة. 500 مل من وسائل الإعلام أجار ينبغي أن تسفر عن لوحات 25 تقريبا.
4. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.

3. السابقين فيفو الإعدادية لم مقايسة الغشاء الواصل

1. 11 ثقافة جديدة من C. albicans SC5314 على لوحة YPD أجار واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
2. اختيار اثنين إلى ثلاثة مستعمرات الفردية المتوسطة الحجم من بين عشية وضحاها نمت C. albicans SC5314 الثقافة وإعادة تعليق في 1 مل من الفوسفات المالحة المخزنة (PBS).
3. استرداد محتويات الأمعاء المجمدة من -80 درجة مئوية والفريزر وذوبان في 25 درجة مئوية.
4. تزن حوالي 150 ملغ من محتويات الأمعاء في أنبوب جديد 1.5 مل.
5. إعادة تعليق محتويات القناة الهضمية مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (محتوى القناة الهضمية وبرنامج تلفزيوني في 1:1 الوزن إلى نسبة حجم).
6. دوامة بسرعة عالية لمدة 30 s لتجانس محتويات الأمعاء والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة تقريبا.
7. الطرد المركزي المتجانس في 1000 س ز لمدة 3 دقائق.
8. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
9. كرر الخطوتين 3.7 و3.8 لإزالة كل الحطام في المُنَاط.
10. إضافة 10 μL من C. albicans SC5314 inoculum أعدت أعلاه لهذا مكبر
11. تخلط جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 4 إلى 5 ساعات.

4. إضافة خارجية من المستقلبات إلى مستخلصات الأمعاء المتجانسة لم مقايسة المورفينية الواصلية

1. استرداد محتويات الأمعاء المجمدة من -80 درجة مئوية والفريزر وإعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني بنسبة 1:1 (الوزن: حجم).
2. إضافة التركيز المطلوب من الأيض الأمعاء لمحتوى الأمعاء وخليط برنامج تلفزيوني.
3. دوامة بسرعة عالية لمدة 30 s لتجانس محتويات الأمعاء التي تحتوي على الأيض والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
4. الطرد المركزي المتجانس في 1000 س ز لمدة 3 دقائق.
5. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 1.5 مل. كرر الخطوتين 4.4 و 4.5 لإزالة كل الحطام في المُنَاط.
6. إضافة 10 ميكرولتر من C. albicans SC5314 inoculum أعدت أعلاه لهذا مكبر. تخلط جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 4 إلى 5 ساعات.

5. C. albicans morphogenesis فحص (مناعة والتصوير)

1. الطرد المركزي العينات في 1000 س ز لمدة 2 دقيقة والتخلص من افرط عن طريق الأنابيب.
2. إصلاح العينات في 100 ميكرولتر من 2٪ شبهفورمالدهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة.
3. جهاز طرد مركزي في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة والتخلص من افرا عن طريق الأنابيب.
4. غسل العينات مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. لغسل العينات، إعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب بلطف. لا دوامة العينة لأن هذا يمكن أن تلحق الضرر هياكل الواصلة. بعد إعادة التعليق، الطرد المركزي في 1000 س ز لمدة 2 دقيقة والتخلص من افرط عن طريق الأنابيب.
5. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على الأجسام المضادة متعددة النسيلة C. albicans (1:100 تخفيف) لمدة 30 دقيقة.
6. غسل العينات ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: عند استخدام جسم مضاد فلوري، يوصى بأن يتم تنفيذ جميع خطوات التخفيف والغسيل في ضوء خافت لتجنب تبييض الصور وتحسين طول العمر العينة.
7. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على المضادة للأرانب IgG Alexafluor 488 في 1:500 تخفيف. قم بإجراء حضانة في درج أو غرفة مظلمة لتجنب تبييض الصور.
8. غسل العينات ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
9. إعادة تعليق العينات في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى لوحة 96-جيدا للتصوير.
   ملاحظة: عندما لا يتم تصويرها، فمن المستحسن أن لوحة 96-جيدا أن تكون ملفوفة في رقائق الألومنيوم لتجنب تبييض الصورة.
10. الخلايا الفطرية الصورة باستخدام العدسات 20x و 40x الهدف باستخدام مجهر التصوير الفلوري. استخدم فلتر البروتين الفلورسنت الأخضر (الطول الموجي للإثارة 470/40 والطول الموجي للانبعاثات 525/50) للكشف عن الفلوريسنس.

النتائج

هذه النتائج جنبا إلى جنب مع النتائج السابقة من مختبر ثانغاماني⁶⁰ تشير إلى أنه عندما يتم زراعة C. albicans السابقين في مستخلصات تجانس الأمعاء مأخوذة من المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة من السيطرة غير المعالجة والفئران المعالجة بالمضادات الحيوية، C. albicans يتطور عمو...

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا تقدم طريقة جديدة للتحقيق في تأثير المضادات الحيوية، والآثار الغذائية، وxenobiotic والعلاجية على C. albicans الهضاب المورفيجن في الجهاز الهضمي. منذ غالبية الالتهابات الجهازية تنشأ من الجهاز الهضمي^{21،22،23،2...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 - 10 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-454	Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-400	Misc
20 - 200 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-451	Misc
2-methylbutyric acid	Sigma	193070-25G	hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen (Fisher)	A11008	IF Staining secondary ab
Agar	Fisher	BP1423-500	YPD agar component
Automated Imaging Microscope	Keyence	BZX700
Candida Albicans Antibody	Invitrogen (Fisher)	PA1-27158	IF Staining primary ab
cefoperazone	Cayman	16113	antibiotic
deoxycholic acid	Sigma	30960	hyphal-inhibitory compound
D-Glucose	Fisher	D16-500	hyphal-promoting compound
forceps	Fisher	08-885
lactic acid	Alfa Aesar	AAAL13242-06	hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid	Sigma	L6250-10G	hyphal-inhibitory compound
palmitic acid	Sigma	P5585-10G	hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313	IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x	Alfa Aesar	J62692	PBS component
p-tolylacetic acid	SCBT	sc-257959	hyphal-inhibitory compound
sebacic acid	Sigma	283258-250G	hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors	Fisher	28301
sterile Milli-Q water	N/A	N/A	Misc
YPD Broth	BD Biosciences	242810	YPD agar component