Un essai ex vivo pour étudier Candida albicans Hyphal Morphogenesis dans le tractus gastro-intestinal

Résumé

L’analyse ex vivo décrite dans cette étude à l’aide d’extraits d’homogénéisation intestinale et de taches d’immunofluorescence représente une nouvelle méthode pour examiner la morphogenèse hyphale de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les signaux environnementaux régulant la transition morphogenétique dans l’intestin.

Résumé

Candida albicans morphogenèse hyphale dans le tractus gastro-intestinal (GI) est étroitement contrôlée par divers signaux environnementaux, et joue un rôle important dans la diffusion et la pathogénie de cet agent pathogène fongique opportuniste. Cependant, les méthodes pour visualiser l’hyphe fongique dans le tractus gastro-intestinal in vivo sont difficiles, ce qui limite la compréhension des signaux environnementaux dans le contrôle de ce processus de morphogenèse. Le protocole décrit ici démontre une nouvelle méthode ex vivo pour la visualisation de la morphogenèse hyphale dans les extraits d’homogénéisation intestinale. À l’aide d’un essai ex vivo, cette étude démontre que le contenu cécal des souris traitées aux antibiotiques, mais pas des souris témoins non traitées, favorise la morphogenèse hyphale de C. albicans dans la teneur en intestin. En outre, l’ajout de groupes spécifiques de métabolites intestinaux au contenu cécal des souris traitées aux antibiotiques régule différemment la morphogenèse hyphale ex vivo. Pris ensemble, ce protocole représente une nouvelle méthode pour identifier et étudier les signaux environnementaux qui contrôlent la morphogenèse hyphale de C. albicans dans le tractus gastro-intestinal.

Introduction

Candida albicans est un pathogène fongique opportuniste et polymorphe qui est normalement proportionnel, mais qui peut subir un changement morphologique en une forme virulente capable de causer des infections potentiellement mortelles chez les personnes immunocompromisées^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}. C. albicans est l’une des principales causes d’infections nosocomiales systémiques, avec un taux de mortalité de 40\u201260%, même avec un traitement antifongique^2,14,15. Bien que C. albicans réside dans différents créneaux d’accueil, y compris le système^{reproducteur féminin 16,17}, la cavité buccale des personnes en bonne santé¹⁸ et le tractus gastro-intestinal (GI)^19,20, la majorité des infections systémiques proviennent du tractus gastro-intestinal et en outre, la source de l’infection systémique est souvent confirmée pour être le^{tractus gastro-intestinal 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}. La pathogénie de C. albicans dans le tractus gastro-intestinal est influencée par un large éventail de facteurs; cependant, une caractéristique majeure nécessaire à la virulence est la transition d’une morphologie des cellules de levure en une morphologie virulente des cellules hyphaliques^{35,36,37,38,39,40,41,42,43,44}. C. albicans attachement et la diffusion du tractus gastro-intestinal pendant l’infection est fortement associée à sa capacité à passer d’une levure proportionnelle à hyphe virulente, permettant aux champignons de causer des maladies invasives^{44,45,46,47,48,49,50,51,52,53}.

Une variété de facteurs dans l’intestin, y compris n-acétylglucosamine, réguler la formation d’hyphal par C. albicans. Par conséquent, il est crucial de réduire l’écart dans la connaissance concernant la morphogenèse hyphale de cet agent pathogène fongique dans le^{tractus gastro-intestinal 54,55,56}. Des preuves récentes indiquent que divers métabolites intestinaux contrôlent différemment la morphogenèse hyphale de C. albicans in vitro^57,58,59,60. Cependant, les contraintes techniques présentent des problèmes lorsqu’on tente d’étudier la formation d’hyphes de C. albicans dans des échantillons intestinaux in vivo, en particulier la coloration des cellules de levure et d’hyphes et l’analyse quantitative du développement hyphal. Pour comprendre la morphogenèse hyphale de C. albicans dans le tractus gastro-intestinal, une méthode ex vivo a été développée à l’aide d’extraits solubles de contenu intestinal homogénéisé de souris pour étudier l’effet des métabolites sur la morphogenèse hyphale fongique. Utilisant des échantillons d’intestin de souris résistantes et sensibles à l’infection par l’IG de C. albicans, cette méthode aidera à identifier et à étudier l’effet des métabolites, des antibiotiques et des xénobiotiques sur la morphogenèse hyphale fongique dans le tractus gastro-intestinal.

Protocole

Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) tel que décrit^{avant 57}. Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Midwest a approuvé cette étude en vertu du Protocole IACUC de l’UTW #2894. Les politiques de soins aux animaux de l’UTW suivent la Politique du Service de santé publique (SSP) sur les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et les politiques énoncées dans la Loi sur le bien-être des animaux (AWA).

1. Les souris étudient le protocole standard

1. Utilisez des souris C57BL/6J mâles et femelles âgées d’au moins six semaines. Complétez-les avec de l’eau stérile avec ou sans cefoperazone (0,5 mg/mL).
   1. Co-maison souris en groupes de 5, avec chaque cage contenant soit tous les mâles ou toutes les souris femelles. Fournissez aux souris du chow de souris standard et de l’eau (via une bouteille de 400 mL) en tout temps.
   2. Vérifiez les cages quotidiennement pour vous assurer que les niveaux de nourriture et d’eau sont suffisants et pour examiner les souris à la recherche de signes de détresse.
2. Remplacez l’eau par de la cefoperazone toutes les 48 h pour vous assurer que des antibiotiques frais sont fournis, peu importe le reste de l’eau dans les biberons de la cage.
3. Après 5\u20127 jours de traitement de cefoperazone, euthanasiez des souris par asphyxie de CO₂ observant le protocole établi d’IACUC. Confirmer la mort par dislocation cervicale.
4. Disséquer les souris à l’aide de ciseaux pointus autoclave-stérilisés et de forceps autoclave-stérilisés.
   1. Après l’euthanasie, fixez l’animal à une surface de dissection en épinglant tous les membres de sorte que l’abdomen soit exposé.
   2. Vaporiser la région abdominale avec 70% d’éthanol pour empêcher la fourrure de coller aux forceps, ciseaux, ou des sections intestinales pendant la dissection.
   3. Utilisez des forceps pour pincer et soulever une section de peau à la base de l’abdomen et créer une petite incision à travers la peau et fascia sous-jacente à l’aide de ciseaux. Prenez grand soin lors de la fabrication de cette incision pour éviter de percer le cecum ou la paroi intestinale.
   4. Étendre cette coupe à la cage thoracique, exposant partiellement la cavité péritonéale. Faire une coupe à partir du point de l’incision initiale de chaque côté s’étendant vers le haut et latéralement.
   5. Tirez ces volets latéralement et épinglez à la surface disséquante pour exposer complètement la cavité péritonéale.
5. Extraire le tractus gastro-intestinal à l’aide de forceps, tout en utilisant des ciseaux pour rendre les coupures supérieures à l’estomac et à la région distale du gros intestin pour assurer la collecte de la plus grande quantité de contenu intestinal de chaque section.
6. Lors de la suppression du tractus gastro-intestinal, prenez soin d’éviter de rompre les composants individuels. Séparez l’estomac, l’intestin grêle, le cecum et le gros intestin individuellement à l’aide de ciseaux à leurs extrémités proximales et distales.
7. Pour la collecte de chaque contenu intestinal de chaque section, faire une incision unique à l’extrémité distale de chaque section à l’aide de ciseaux, suivie par l’expulsion manuelle de la teneur en intestin dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL à l’aide de forceps.
8. Conserver le contenu de l’intestin à -80 °C pour les analyses ex vivo.

2. Préparation des plaques d’agar extrait-peptone-dextrose (YPD) de levure

1. À une bouteille en verre de 1 L ajouter 25 g d’extrait de levure peptone-dextrose poudre de bouillon, 10 g d’agar, et l’eau ultrapure à un volume final de 500 mL.
2. Autoclave à 121 °C pendant 30 min sur un cycle liquide pour stériliser le média.
3. Sous une hotte d’écoulement laminaire, verser environ 20 mL de supports d’agar dans une plaque de Petri stérile. 500 mL de supports d’agar devraient produire environ 25 plaques.
4. Conserver les assiettes à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.

3. Préparation ex vivo pour l’essai hyphal de morphogenèse

1. Stries d’une culture fraîche de C. albicans SC5314 sur une plaque d’agar YPD et incuber toute la nuit à 30 °C.
2. Choisissez deux à trois colonies individuelles de taille moyenne provenant de la culture C. albicans SC5314 cultivées pendant la nuit et suspendez-les en 1 mL de salin tamponné de phosphate (PBS).
3. Récupérer le contenu des intestins congelés dans le congélateur de -80 °C et décongeler à 25 °C.
4. Pesez environ 150 mg de contenu intestinal dans un nouveau tube de 1,5 mL.
5. Suspendre à nouveau le contenu intestinal avec 150 μL de PBS (teneur en intestin et PBS à un rapport poids/volume de 1:1).
6. Vortex à grande vitesse pendant 30 s pour homogénéiser le contenu de l’intestin et permettre de s’asseoir à température ambiante pendant environ une minute.
7. Centrifugeuse l’homogénéise à 1000 x g pendant 3 min.
8. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
9. Répétez les étapes 3.7 et 3.8 pour enlever tous les débris dans le surnatant.
10. Ajouter 10 μL de l’inoculum C. albicans SC5314 préparé ci-dessus à ce supernatant
11. Bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 4 à 5 h.

4. Ajout exogène de métabolites aux extraits homogénéisés d’intestin pour l’essai hyphal de morphogenèse

1. Récupérer le contenu des intestins congelés du congélateur de -80 °C et les suspendre de nouveau en PBS à un rapport de 1:1 (poids : volume).
2. Ajouter la concentration désirée de métabolites intestinaux au contenu intestinal et au mélange PBS.
3. Vortex à grande vitesse pendant 30 s pour homogénéiser le contenu intestinal contenant des métabolites et permettre de s’asseoir à température ambiante pendant environ 10 min.
4. Centrifugeuse l’homogénéise à 1000 x g pendant 3 min.
5. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Répétez les étapes 4.4 et 4.5 pour enlever tous les débris dans le supernatant.
6. Ajouter 10 μL de l’inoculum C. albicans SC5314 préparé ci-dessus à ce supernatant. Bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 4 à 5 h.

5. Essai de morphogenèse de C. albicans (immunostaining et imagerie)

1. Centrifuger les échantillons à 1000 x g pendant 2 min et jeter le supernatant par pipetting.
2. Fixer les échantillons dans 100 μL de 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 15 min.
3. Centrifugeuse à 1000 x g pendant 2 min et jeter le supernatant par pipetting.
4. Lavez les échantillons deux fois avec 1 mL de PBS. Pour laver les échantillons, suspendez la pastille dans PBS en pipetting doucement. Ne pas vortex de l’échantillon car cela peut endommager les structures hyphal. Après la re-suspension, centrifugeuse à 1000 x g pendant 2 min et jeter le supernatant par pipetting.
5. Incuber les échantillons à température ambiante dans 100 μL de PBS contenant de l’anticorps polyclonal C. albicans (1:100 dilution) pendant 30 min.
6. Lavez les échantillons trois fois avec 1 mL de PBS.
   REMARQUE : Lors de l’utilisation d’un anticorps fluorescent, il est recommandé que toutes les étapes de dilution et de lavage soient effectuées en faible lumière afin d’éviter le blanchiment des photos et d’améliorer la longévité de l’échantillon.
7. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 min dans 100 μL de PBS contenant anti-Lapin IgG Alexafluor 488 anticorps à 1:500 dilution. Effectuez l’incubation dans un tiroir ou une pièce sombre pour éviter le blanchiment des photos.
8. Lavez les échantillons trois fois avec 1 mL de PBS.
9. Suspendre à nouveau les échantillons dans 100 μL de PBS et les transférer dans une plaque de 96 puits pour l’imagerie.
   REMARQUE : Lorsqu’elle n’est pas photographiée, il est recommandé d’envelopper la plaque de 96 puits dans du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment des photos.
10. Cellules fongiques d’image utilisant des lentilles objectives 20x et 40x utilisant un microscope d’imagerie de fluorescence. Utilisez un filtre à protéines fluorescentes vertes (longueur d’onde excitation 470/40 et longueur d’onde d’émission 525/50) pour détecter la fluorescence.

Résultats

Ces résultats ainsi que les résultats antérieurs du laboratoire Thangamani⁶⁰ indiquent que lorsque C. albicans est cultivé ex vivo dans des extraits d’homogénéisation intestinale prélevés dans l’estomac, les intestins grêles et les gros intestins de souris témoins non traitées et traitées aux antibiotiques, C. albicans se développe généralement avec une morphologie de levure (figure 1B). Cependant, lorsqu’il est cultivé dans l?...

Discussion

La méthode décrite ici présente une nouvelle façon d’étudier l’effet des impacts antibiotiques, diététiques, xénobiotiques et thérapeutiques sur la morphogenèse hyphale de C. albicans dans le tractus gastro-intestinal. Puisque la majorité des infections systémiques proviennent du tractus^{gastro-intestinal 21,22,23,24,25,}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 - 10 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-454	Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-400	Misc
20 - 200 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-451	Misc
2-methylbutyric acid	Sigma	193070-25G	hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen (Fisher)	A11008	IF Staining secondary ab
Agar	Fisher	BP1423-500	YPD agar component
Automated Imaging Microscope	Keyence	BZX700
Candida Albicans Antibody	Invitrogen (Fisher)	PA1-27158	IF Staining primary ab
cefoperazone	Cayman	16113	antibiotic
deoxycholic acid	Sigma	30960	hyphal-inhibitory compound
D-Glucose	Fisher	D16-500	hyphal-promoting compound
forceps	Fisher	08-885
lactic acid	Alfa Aesar	AAAL13242-06	hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid	Sigma	L6250-10G	hyphal-inhibitory compound
palmitic acid	Sigma	P5585-10G	hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313	IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x	Alfa Aesar	J62692	PBS component
p-tolylacetic acid	SCBT	sc-257959	hyphal-inhibitory compound
sebacic acid	Sigma	283258-250G	hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors	Fisher	28301
sterile Milli-Q water	N/A	N/A	Misc
YPD Broth	BD Biosciences	242810	YPD agar component