Um ensaio ex vivo para estudar candida albicans Hórgênese Háfal no Trato Gastrointestinal

Resumo

O ensaio ex vivo descrito neste estudo utilizando extratos de homogeneização intestinal e coloração de imunofluorescência representa um novo método para examinar a morfogênese húfa de Candida albicans no trato GI. Este método pode ser utilizado para investigar os sinais ambientais que regulam a transição morfogenética no intestino.

Resumo

A morfogênese húfala candida albicans no trato gastrointestinal (GI) é fortemente controlada por vários sinais ambientais, e desempenha um papel importante na disseminação e patogênese deste patógeno fúngico oportunista. No entanto, os métodos para visualizar a hifa fúngica no trato GI in vivo são desafiadores, o que limita a compreensão dos sinais ambientais no controle desse processo de morfogênese. O protocolo aqui descrito demonstra um novo método ex vivo para visualização da morfogênese hifal em extratos homogeneizados intestinais. Usando um ensaio ex vivo, este estudo demonstra que o conteúdo cecal de camundongos tratados com antibióticos, mas não de camundongos de controle não tratados, promovem a morfogênese háfagênese C. albicans no conteúdo intestinal. Além disso, adicionar de volta grupos específicos de metabólitos intestinais ao conteúdo cecal de camundongos tratados com antibióticos regula diferencialmente a morfogênese hifalina ex vivo. Em conjunto, este protocolo representa um novo método para identificar e investigar os sinais ambientais que controlam a morfogênese húfa cofálica no trato GI.

Introdução

Candida albicans é um patógeno fúngico oportunista e polimórfico que normalmente é commensal, mas pode sofrer uma alteração morfológica em uma forma virulenta capaz de causar infecções fatais em indivíduos imunocomprometidos^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}. C. albicans é uma das principais causas de infecções nosocomiais sistêmicas, com uma taxa de mortalidade de 40\u201260% mesmo com tratamento antifúngico^2,14,15. Embora os albicanos residam em diferentes nichos hospedeiros, incluindo o sistema reprodutivo feminino^16,17, a cavidade oral de indivíduos saudáveis¹⁸ e o trato gastrointestinal (GI)^19,20, a maioria das infecções sistêmicas originárias do trato GI e, além disso, a fonte de infecção sistêmica é frequentemente confirmada como o trato GI^{21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}. C. a patogenicidade dos albicanos no trato GI é influenciada por uma ampla gama de fatores; no entanto, uma característica importante necessária para a virulência é a transição de uma morfologia celular levedura para uma morfologia de células hífas virulenta^{35,36,37,38,39,40,41,42,43,44}. C. o apego e disseminação do trato de GI durante a infecção está altamente associado à sua capacidade de transição de uma levedura commensal para hifa virulenta, permitindo que os fungos causem doença invasiva^{44,45,46,47,48,49,50,51,52,53}.

Uma variedade de fatores no intestino, incluindo n-acetilglucosamina, regulam a formação hifáfal por C. albicans. Portanto, é crucial diminuir a lacuna de conhecimento sobre a morfogênese hifal deste patógeno fúngico no trato GI^54,55,56. Evidências recentes indicam que vários metabólitos intestinais controlam diferencialmente a morfogênese háfa de C. albicans in vitro^57,58,59,60. No entanto, as restrições técnicas apresentam problemas ao tentar estudar a formação de c. albicans hyphae em amostras in vivo, especialmente a coloração de leveduras e células de higia e análise quantitativa do desenvolvimento de higificos. Para entender a morfogênese hábica de C. albicans no trato GI, um método ex vivo foi desenvolvido utilizando extratos solúveis de conteúdo intestinal homogeneizado de camundongos para estudar o efeito de metabólitos na morfogênese húfa fúngica. Utilizando amostras intestinais de camundongos resistentes e suscetíveis à infecção por C. albicans GI, este método ajudará a identificar e estudar o efeito de metabólitos, antibióticos e xenobióticos na morfogênese húfa fúngica no trato GI.

Protocolo

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Centro-Oeste (IACUC), conforme descrito antes^{de 57}. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Centro-Oeste aprovou este estudo sob o Protocolo MWU IACUC #2894. As políticas de atenção animal da MWU seguem a Política de Atenção e Uso de Animais de Laboratório do Serviço Público de Saúde (PHS) e as políticas previstas na Lei de Bem-Estar Animal (AWA).

1. Os ratos estudam o protocolo padrão

1. Use camundongos C57BL/6J machos e femininos com pelo menos seis semanas de idade. Suplementá-los com água estéril com ou sem cefoperazone (0,5 mg/mL).
   1. Co-house ratos em grupos de 5, com cada gaiola contendo todos os machos ou todos os ratos fêmeas. Forneça aos ratos comida e água padrão do mouse (através de uma garrafa de 400 mL) o tempo todo.
   2. Verifique as gaiolas diariamente para garantir que os níveis de comida e água sejam suficientes, e para examinar os ratos em busca de sinais de angústia.
2. Substitua a água por cefoperazone a cada 48 horas para garantir que antibióticos frescos sejam fornecidos independentemente da água restante nas garrafas de alimentação da gaiola.
3. Após 5\u20127 dias de tratamento cefoperazone, eutanize camundongos via asfixia de CO₂ observando o protocolo IACUC estabelecido. Confirme a morte por luxação cervical.
4. Disseco camundongos usando tesouras afiadas esterilizadas autoclave e fórceps esterilizados por autoclave.
   1. Após a eutanásia, proteja o animal a uma superfície de dissecção fixando todos os membros de tal forma que o abdômen seja exposto.
   2. Pulverize a região abdominal com 70% de etanol para evitar que os peles grudem em fórceps, tesouras ou seções intestinais durante a dissecção.
   3. Use fórceps para beliscar e levantar uma seção da pele na base do abdômen e criar uma pequena incisão através da pele e fáscia subjacente usando uma tesoura. Tome muito cuidado ao fazer esta incisão para evitar perfurar o ceco ou parede intestinal.
   4. Este corte até a caixa torácica, expondo parcialmente a cavidade peritoneal. Faça um corte a partir do ponto da incisão inicial de ambos os lados estendendo-se para cima e lateralmente.
   5. Puxe estes retalhos lateralmente e fixe na superfície dissecando para expor totalmente a cavidade peritoneal.
5. Extrair o trato GI usando fórceps, ao mesmo tempo em que usar a tesoura para fazer cortes superiores ao estômago e na região distal do intestino grosso para garantir a coleta da maior quantidade de conteúdo intestinal de cada seção.
6. Ao remover o trato GI, tome cuidado para evitar a ruptura dos componentes individuais. Separe o estômago, o intestino delgado, o ceco e o intestino grosso individualmente usando uma tesoura em suas extremidades proximal e distal.
7. Para a coleta de cada conteúdo intestinal de cada seção, faça uma única incisão na extremidade distal de cada seção usando uma tesoura, seguida de expulsão manual do conteúdo intestinal em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL usando fórceps.
8. Armazene o conteúdo intestinal a -80 °C para ensaios ex vivo.

2. Preparação de placas de ágar extrato de levedura-peptone-dextrose (YPD)

1. A uma garrafa de vidro de 1 L adicione 25 g de fermento extrato peptone-dextrose em pó, 10 g de ágar e água ultrauso a um volume final de 500 mL.
2. Autoclave a 121 °C por 30 min em um ciclo líquido para esterilizar a mídia.
3. Sob um capô de fluxo laminar, despeje aproximadamente 20 mL de mídia de ágar em uma placa de Petri estéril. 500 mL de mídia ágar deve render aproximadamente 25 placas.
4. Armazene as placas a 4 °C até ficar pronta para uso.

3. Preparação ex vivo para ensaio de morfogênese hifal

1. Traço uma nova cultura de C. albicans SC5314 em uma placa de ágar YPD e incubar durante a noite a 30 °C.
2. Escolha duas a três colônias individuais de médio porte da cultura C. albicans sc5314 cultivadas durante a noite e suspenda-se em 1 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS).
3. Recupere o conteúdo do intestino congelado do congelador -80 °C e descongele a 25 °C.
4. Pesar cerca de 150 mg de conteúdo intestinal em um novo tubo de 1,5 mL.
5. Suspenda o conteúdo intestinal com 150 μL de PBS (conteúdo intestinal e PBS a uma razão peso/volume de 1:1).
6. Vórtice em alta velocidade por 30 s para homogeneizar o conteúdo intestinal e permitir sentar-se à temperatura ambiente por cerca de um minuto.
7. Centrifugar os homogeneiza em 1000 x g por 3 min.
8. Transfira o supernatante para um novo tubo de 1,5 mL.
9. Repita as etapas 3.7 e 3.8 para remover todos os detritos do supernaspe.
10. Adicione 10 μL do C. albicans SC5314 inóculo preparado acima para este supernatante
11. Misture bem e incubar a 37 °C por 4 a 5 h.

4. Adição exógena de metabólitos aos extratos homogeneizantes do intestino para o ensaio de morfogênese hifál

1. Recuperar o conteúdo do intestino congelado do congelador -80 °C e reinsu suspensão na PBS na proporção 1:1 (peso: volume).
2. Adicione a concentração desejada de metabólitos intestinais ao conteúdo intestinal e à mistura de PBS.
3. Vórtice em alta velocidade por 30 s para homogeneizar o conteúdo intestinal contendo metabólitos e permitir sentar-se à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos.
4. Centrifugar os homogeneiza em 1000 x g por 3 min.
5. Transfira o supernatante para um novo tubo de 1,5 mL. Repita as etapas 4.4 e 4.5 para remover todos os detritos do supernaspe.
6. Adicione 10 μL do C. albicans SC5314 inóculo preparado acima a este supernatante. Misture bem e incubar a 37 °C por 4 a 5 h.

5. Ensaio de morfogênese de albicanos (imunostaining e imagem)

1. Centrifugar as amostras a 1000 x g por 2 min e descartar o supernatante através de pipetagem.
2. Fixar as amostras em 100 μL de 2% de paraformaldeído (PFA) por 15 min.
3. Centrifugar a 1000 x g por 2 min e descartar supernaspeuta via pipetação.
4. Lave as amostras duas vezes com 1 mL de PBS. Para lavar amostras, suspenda a pelota em PBS, encanar suavemente. Não vórtice a amostra, pois isso pode danificar estruturas hifais. Após a suspensão, centrífuga a 1000 x g por 2 min e descarte o supernaspeuta através de pipetagem.
5. Incubar as amostras à temperatura ambiente em 100 μL de PBS contendo anticorpo policlonal C. albicans (diluição 1:100) por 30 min.
6. Lave as amostras três vezes com 1 mL de PBS.
   NOTA: Ao usar um anticorpo fluorescente, recomenda-se que todas as etapas de diluição e lavagem sejam realizadas em luz fraca para evitar branqueamento de fotos e melhorar a longevidade da amostra.
7. Incubar as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos em 100 μL de PBS contendo anticorpo anti-Rabbit IgG Alexafluor 488 a 1:500 diluição. Realize a incubação em uma gaveta ou sala escura para evitar branqueamento de fotos.
8. Lave as amostras três vezes com 1 mL de PBS.
9. Suspenda as amostras em 100 μL de PBS e transfira para uma placa de 96 poços para imagem.
   NOTA: Quando não for imageada, recomenda-se que a placa de 96 poços seja enrolada em papel alumínio para evitar branqueamento fotográfico.
10. Células fúngicas de imagem usando lentes objetivas de 20x e 40x usando um microscópio de imagem de fluorescência. Use um filtro de proteína fluorescente verde (GFP) (comprimento de onda de excitação 470/40 e comprimento de onda de emissão 525/50) para detectar fluorescência.

Resultados

Esses resultados, juntamente com os achados anteriores do laboratório Thangamani^60, indicam que quando os albicanos são cultivados ex vivo em extratos homogeneizados intestinais retirados do estômago, intestinos delgados e intestinos grandes de controle não tratado e camundongos tratados com antibióticos, C. albicans geralmente se desenvolve com uma morfologia de levedura(Figura 1B). No entanto, quando cultivados no extrato cecal de camundon...

Discussão

O método descrito aqui apresenta uma nova maneira de investigar o efeito de antibióticos, impactos dietéticos, xenobióticos e terapêuticos na morfogênese hífa de C. albicans no trato GI. Uma vez que a maioria das infecções sistêmicas se origina do trato GI^{21,22,23,24,25,26,27}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 - 10 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-454	Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-400	Misc
20 - 200 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-451	Misc
2-methylbutyric acid	Sigma	193070-25G	hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen (Fisher)	A11008	IF Staining secondary ab
Agar	Fisher	BP1423-500	YPD agar component
Automated Imaging Microscope	Keyence	BZX700
Candida Albicans Antibody	Invitrogen (Fisher)	PA1-27158	IF Staining primary ab
cefoperazone	Cayman	16113	antibiotic
deoxycholic acid	Sigma	30960	hyphal-inhibitory compound
D-Glucose	Fisher	D16-500	hyphal-promoting compound
forceps	Fisher	08-885
lactic acid	Alfa Aesar	AAAL13242-06	hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid	Sigma	L6250-10G	hyphal-inhibitory compound
palmitic acid	Sigma	P5585-10G	hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313	IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x	Alfa Aesar	J62692	PBS component
p-tolylacetic acid	SCBT	sc-257959	hyphal-inhibitory compound
sebacic acid	Sigma	283258-250G	hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors	Fisher	28301
sterile Milli-Q water	N/A	N/A	Misc
YPD Broth	BD Biosciences	242810	YPD agar component