JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكول مفصل لتوليد نموذج مورين xenograft من التشوه الوريدي. ويستند هذا النموذج على الحقن تحت الجلد من الخلايا البطانية المستمدة من المريض التي تحتوي على فرط تفعيل 12 و / أو الطفرات الجينية PIK3CA. Xenograft الآفات تُلخيّص عن كثب السمات الهدولوجية للأنسجة المريض VM.

Abstract

التشوه الوريدي (VM) هو شذوذ الأوعية الدموية التي تنشأ عن ضعف التنمية من الشبكة الوريدية مما أدى إلى الأوردة المتوسعة والمختلة وظيفيا في كثير من الأحيان. الغرض من هذه المقالة هو أن تصف بعناية إنشاء نموذج مورين xenograft الذي يحاكي VM الإنسان وقادرة على عكس عدم تجانس المريض. تم تحديد فرط تفعيل غير موروثة (الجسدية) TEK (TIE2) و PIK3CA الطفرات في الخلايا البطانية (EC) باعتبارها المحركات الرئيسية لتوسيع الأوعية المرضية في VM. يصف البروتوكول التالي عزل وتنقية وتوسع EC المستمدة من المريض التعبير عن متحولة TIE2 و / أو PIK3CA. يتم حقن هذه EC تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران الوثيميكية المناعية لتوليد قنوات الأوعية الدموية ectatic. الآفات المتولدة مع TIE2 أو PIK3CA-متحولة EC هي الأوعية الدموية بشكل واضح في غضون 7\u20129 أيام من الحقن وتكتل السمات الهدولوجية للأنسجة المريض VM. هذا النموذج Xenograft VM يوفر منصة موثوق بها للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تقود تشكيل الجهاز الظاهري والتوسع. وبالإضافة إلى ذلك، سيكون هذا النموذج مفيدة للدراسات الترجمية اختبار فعالية المرشحين المخدرات رواية في منع التوسع السفينة غير طبيعية ينظر في VM الإنسان.

Introduction

العيوب في تطور الأوعية الدموية هي السبب الكامن وراء العديد من الأمراض بما في ذلك التشوهات الوريدية (VM). VM هو مرض خلقي يتميز بتشكل غير طبيعي وتوسع الأوردة1. وقد حددت الدراسات الهامة على أنسجة الجهاز الظاهري والخلايا البطانية (EC) اكتساب من الطفرات وظيفة في اثنين من الجينات: TEK، الذي يشفّر مستقبلات كيناز التيروزين TIE2، وPIK3CA، الذي يشفّر p110α (الوحدة الفرعية الحفازة) isoform PI3 كيناز (PI3K)2،3،4،5. هذه الطفرات الجسدية تؤدي إلى تنشيط فرط مستقل لليغانند من مسارات إشارة أوعية / النمو الرئيسية ، بما في ذلك PI3K / AKT ، مما أدى إلى الأوردة المتوسعة3. وعلى الرغم من هذه الاكتشافات الجينية الهامة، فإن الآليات الخلوية والجزيئية اللاحقة التي تؤدي إلى تكوين الأوعية الدموية غير الطبيعية وتشكيل قنوات الأوعية الدموية الموسعة لا تزال غير مفهومة تماماً.

خلال تولد الأوعية الدموية الطبيعية والمرضية، تنبت أوعية جديدة من شبكة الأوعية الدموية الموجودة من قبل و EC تخضع سلسلة من العمليات الخلوية الهامة بما في ذلك الانتشار والهجرة وإعادة عرض المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتشكيل التجويف6. ثنائي وثلاثي الأبعاد (2D/3D) في الثقافات في المختبر EC هي أدوات هامة للتحقيق في كل من هذه الخصائص الخلوية بشكل فردي. ومع ذلك، هناك طلب واضح لنموذج الماوس الذي يلخص تضخم الأوعية المرضية داخل البيئة الصغيرة المضيفة مع توفير منصة فعالة للتقييم قبل السريري للأدوية المستهدفة للبحوث الانتقالية.

وحتى الآن، لم يتم الإبلاغ عن نموذج مورين معدل وراثياً لـ VM مرتبط بطفرات اكتساب الوظيفة من 11 إلى 100. تعتمد نماذج الماوس VM الحالية المعدلة على التعبير في كل مكان أو مقيد بالأنسجة من الطفرة النشطة PIK3CA p.H1047R3،5. هذه الحيوانات المعدلة وراثيا توفر رؤية كبيرة في الجسم كله أو الأنسجة آثار محددة من هذه النقطة الساخنة PIK3CA الطفرة. الحد من هذه النماذج هو تشكيل شبكة الأوعية الدموية المرضية للغاية مما أدى إلى الفتك المبكر. وبالتالي ، فإن هذه النماذج الماوس لا تعكس تماما حدوث متقطع من الأحداث الطفرة والطبيعة المترجمة من أمراض VM.

على العكس من ذلك ، تعتمد نماذج xenograft المستمدة من المريض على زرع أو حقن الأنسجة المرضية أو الخلايا المشتقة من المرضى إلى الفئران المناعية7. نماذج Xenograft هي أداة قوية لتوسيع المعرفة حول تطور المرض واكتشاف وكلاء علاجية جديدة8. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الخلايا المشتقة من المريض يسمح للعلماء بتكبيل التغايرية الطفرة لدراسة طيف الأنماط الظاهرية للمريض.

هنا، ونحن وصف بروتوكول حيث يتم حقن المرضى المستمدة VM EC التي تعبر عن شكل متحولة نشطة من TIE2 و /أو PIK3CA تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران عارية athymic. يتم تعليق الخلايا الوعائية عن طريق الحقن في إطار ECM من أجل تعزيز تولد الأوعية الدموية كما هو موضح في النماذج السابقة xenograft الأوعية الدموية9,10,11. تخضع هذه VM EC لتحولات morphogenesi كبيرة وتولد أوعية مرضية موسعة ومُلّقة في غياب الخلايا الداعمة. يوفر نموذج xenograft الموصوف لـ VM منصة فعالة للتقييم قبل الكلينيكي للأدوية المستهدفة لقدرتها على منع التوسع غير المنضبط في تجويف التجويف.

Protocol

تم الحصول على عينات أنسجة المريض من المشاركين بعد موافقة مستنيرة من جمع ومستودع عينات الأنسجة والبيانات من المرضى الذين يعانون من الأورام والشذوذ الوعائي بموجب مجلس مراجعة مؤسسية معتمد (IRB) لكل سياسات مؤسسية في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال (CCHMC) ومعهد السرطان وأمراض الدم وبموافقة لجنة التحقيق السريري. وقد تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية المذكورة أدناه والموافقة عليها من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية CCHMC واستخدامها.

1- إعداد المواد وحلول المخزون

  1. إعداد كامل متوسط نمو الخلايا البطانية (EGM)
    1. ملحق endothelial المتوسطة القاعدية (EBM) مع عوامل النمو التالية الموجودة في مجموعة (انظر جدول المواد):الإنسان الليفي عامل النمو بيتا (hFGF-β)، عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF)، طويلة Arg3 الأنسولين مثل عامل النمو- I (R 3-IGF-I)، حمض الأسكوربيك، عامل نمو البشرة (EGF) ، كبريتات ال gentamycin amphotericin-B ، والهبارين.3 أضف محلول 1٪ من البنسلين/ستريبتومايسين/إل-جلوتامين (PSG) ومصل الأبقار الجنيني بنسبة 20٪ (FBS).
      ملاحظة: لا نوصي بإضافة الهيدروكورتيزون.
    2. العقيمة تصفية الحل تحت غطاء تدفق لارينار من خلال 0.2 μm زجاجة أعلى مرشح في زجاجة autoclaved وسائل الإعلام aliquot في 50 مل أنابيب المخروطية وتخزينها في 4 درجة مئوية تصل إلى أسبوع أو -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  2. إعداد الكولاجين A حل الأسهم
    1. إعداد 50 ملغ/ مل collagenase محلول الأسهم في 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS).
    2. العقيمة تصفية الحل تحت غطاء تدفق لارينار مع 0.2 ميكرومتر مرشح وحقنة، وتخزين 100 ميكروغرام في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد وسط جمع الأنسجة (المخزن المؤقت A)
    1. إعداد Ca2+/ Mg2 + محلول الأسهم عن طريق إضافة 0.927 غرام من ثنائي هيدرويت كلوريد الكالسيوم (CaCl2.2H2O) و 1 غرام من كبريتات المغنيسيوم هيبتهيدرات (MgSO4.7H2O) إلى 500 مل من الماء المقطر. قم بتصفية محلول معقم من خلال مرشح علوي قنينة 0.2 ميكرومتر في زجاجة زجاجية مُقلمة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. ملحق Dulbecco معدلة النسر المتوسط (DMEM) مع 10٪ كاليفورنيا2 +/ ملغ2 + حل و 2٪ FBS.
    3. معقم تصفية الحل تحت غطاء تدفق لارينار مع 0.2 ميكرومتر مرشح وحقنة وتخزين aliquots من 5 مل في -20 درجة مئوية.
  4. طلاء فيبينيكتين من لوحات ثقافة الأنسجة
    1. إعداد العازلة طلاء (العازلة ب) عن طريق حل 5.3 غرام من كربونات الصوديوم(2 2CO3؛ 0.1 م) في 500 مل من المياه deionized. ضبط درجة الحموضة في المخزن المؤقت إلى 9.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك 1 M (HCl). تصفية تحت غطاء تدفق لارينار من خلال مرشح أعلى زجاجة 0.2 μm في زجاجة زجاجة autoclaved وتخزينها في RT.
    2. للطلاء، ماصة 2 مل/5 مل/10 مل من B العازلة لكل 60 ملم/100 ملم/145 ملم لوحة الأنسجة، على التوالي. إضافة 1 ميكروغرام/ سم2 من البلازما البشرية فيبرومينكين محلول البروتين النقي وتوزيع بلطف السائل على لوحة.
    3. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 20 دقيقة.
    4. التعرق العازلة B وغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني قبل زراعة الخلايا.

2. عزل الخلايا البطانية من أنسجة المريض VM

  1. عزل الجماعة الأوروبية من أنسجة VM الصلبة
    ملاحظة: يتم إعادة استئصال أنسجة الجهاز الظاهري عن طريق إزالة الbulking جراحة12,13 بموجب بروتوكول IRB المعتمدة.
    1. غسل أنسجة VM (وزن عينة الأنسجة يتراوح عادة بين 0.5 غرام و 1.5 غرام) في 5٪ PSG في برنامج تلفزيوني.
    2. نقل الأنسجة إلى طبق ثقافة الخلية 100 ملم، عينة الأنسجة المفروم إلى قطع صغيرة باستخدام أدوات تشريح الجراحية العقيمة، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من الكولاجينا حل الأسهم إلى 5 مل من العازلة A لتركيز النهائي من 1 ملغ / مل، ثم إضافة هذا إلى الأنسجة وهضم الأنسجة المفروم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حين تهز محتويات كل 5 دقائق.
    4. طحن بعناية الأنسجة المهضومة في RT باستخدام مطحنة 6 مم، على نحو سلس السطح في أنبوب مخروطي 50 مل.
    5. الاستمرار في طحن بعناية الأنسجة المهضمة باستخدام الحشرات في حين إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة تكملها 0.5٪ البوم مصل البقر (BSA) و 2٪ باريس سان جيرمان. كرر هذه الخطوة أربع مرات.
    6. تصفية الحل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مل لإزالة شظايا الأنسجة.
    7. نظام تعليق خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 400 x ز في RT. تابعوا الخطوة 2.3.
  2. عزل VM EC من الدم الآفة التي تم الحصول عليها من العلاج ب تصلب المريض
    1. الحصول على الدم الآفة VM الإنسان من تصلب تحت بروتوكول IRB وافق.
    2. تخفيف الدم الآفة (حجم العينة يتراوح عادة بين 0.5 مل و 5 مل) في برنامج تلفزيوني إلى حجم النهائي من 40 مل.
    3. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز في RT.
  3. طلاء الخلية الأولي
    1. تجاهل supernatant و resuspend بيليه خلية واحدة في 1 مل من EGM.
    2. إضافة 9 مل من EGM كاملة على ليفينيكتين المغلفة (1 ميكروغرام / سم2) 100 ملم لوحات والبذور 1 مل من تعليق الخلية.
    3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو مرطب CO2 5٪ .
    4. كل يوم إزالة 2 مل من وسائل الإعلام وإضافة 2 مل من FBS مصفاة العقيمة.
    5. بمجرد أن تصل الثقافات الخلية إلى التقاء 40\u201250% تغيير الوسط لإكمال EGM. وعادة ما يستغرق ما بين 2\u20123 أسابيع للخلايا للوصول إلى هذا الالتقاء.
    6. مراقبة يوميا لظهور مستعمرات الجماعة الأوروبية. ويمكن التعرف عليها من قبل نموذجي "الحصى مثل" مورفولوجيا(الشكل 1A). بين 3\u20125 تظهر مستعمرات EC في كل عينة.
    7. تغيير المتوسط كل يومين لمدة 5\u20127 أيام أخرى حتى تبدأ مستعمرات المفوضية الأوروبية الفردية في لمس بعضها البعض.
  4. العزل اليدوي لمستعمرات المفوضية الأوروبية الفردية
    1. لحصاد مستعمرات EC، اغسل الطبق بـ 5 مل من PBS وينبت يدويًا مع ماصة مصلية.
    2. خذ اللوحة إلى المجهر ودائرة مواقع مستعمرات المفوضية الأوروبية المتعددة باستخدام قلم العلامات على كل من الغطاء والسفلي قبل إعادته إلى غطاء تدفق الغطاء.
    3. فصل مستعمرات EC عن طريق الأنابيب 50 ميكرولتر من 0.05٪ محلول التربسين-EDTA على المناطق اِلّمَ.
    4. باستخدام مكشطة صغيرة أو طرف ماصة، كشط الخلايا بلطف من لوحة.
    5. إمالة لوحة إلى أقرب حافة، وشطف مع 1 مل من EGM في منطقة ملحوظ وجمع الخلايا.
    6. عد عدد الخلايا التي تستخدم مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي.
    7. لوحة المستعمرات EC التي تم جمعها بكثافة 1 × 104 الخلايا / سم2 على الألياف المغلفة (1 ميكروغرام / سم ²) أطباق ثقافة الخلية التي تحتوي على EGM الطازجة. في اليوم التالي، قم بتغيير متوسط لإكمال EGM.
    8. تغيير متوسطة لإكمال EGM كل يومين لمدة 2\u20123 أسابيع حتى الخلايا تصل إلى 80٪ التقاء.
    9. Trypsinize EC مع 2 مل من قبل warmed 0.05٪ التربسين-EDTA لكل طبق 100 مم في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وتحييد التربسين بإضافة 4 مل من EGM.
    10. جمع تعليق الخلية في واحد أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 400 × ز في RT لمدة 5 دقائق. استلهم الخلايا الفائقة و الـ resuspend في 2 مل من EGM.
    11. عد عدد الخلايا التي تستخدم مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي. أرقام الخلايا النموذجية التي تم الحصول عليها هي 1 × 106 خلايا لكل لوحة استزراع خلايا 60 مم أو 2 × 106 خلايا لكل لوحة استزراع أنسجة 100 مم.
    12. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز في RT لمدة 5 دقائق وpiratesant. تابع إلى الخطوة 3.2.1.

3- اختيار الخلايا العضوية وتوسيعها

  1. إعداد الخرز المغناطيسي المضاد لـ CD31
    1. دوامة القارورة التي تحتوي على الخرز المغناطيسي المضادة CD31-مترافق لمدة 30 s. عدد الخرز المطلوب هو 8 × 106 حبات / 2 × 106 الخلايا.
    2. غسل المبلغ المطلوب من الخرز المغناطيسي المضادة لـ CD31-المقترنة مع 1 مل من محلول الغسيل التي تحتوي على 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    3. ضع أنبوب microcentrifuge في مغناطيس عزل الخلية لمدة 1 دقيقة.
    4. استلهم البيرونت وكرر خطوة الغسيل.
  2. تنقية الخلايا الـ Endothelial والطلاء
    1. Resuspend خلية بيليه التي حصلت في 2.4.12 في 500 ميكرولتر من محلول الغسيل التي تحتوي على 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة حل الخلية إلى أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على الخرز المغناطيسي و resuspend تماما.
    3. احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية مع إمالة لطيف.
    4. إضافة 500 μL من 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني ومزيج جيد.
    5. ضع الأنبوب على مغناطيس عزل الخلايا لمدة دقيقة.
    6. التعرق بلطف كل من السائل، الذي يحتوي على جزء CD31 السلبية من الخلايا دون لمس الخرز.
    7. غسل بيليه حبة تحتوي على كسر الخلية CD31 إيجابية مع 1 مل من 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني وتكرار فصل المغناطيسي.
    8. كرر الغسيل وخطوة الفصل المغناطيسي لمدة لا تقل عن 3 مرات لتنقية كسر الخلية إيجابية CD31.
    9. إعادة تعليق الخلايا البطانية النقية في أنبوب مخروطي 15 مل وتدور أسفل لمدة 5 دقائق في 400 × ز في RT.
    10. إزالة السوبر و resuspend بيليه الخلية في 1 مل من EGM.
    11. إضافة 9 مل من EGM كاملة على ليفينيكتين المغلفة (1 ميكروغرام / سم2) 100 ملم لوحات والبذور 1 مل من تعليق الخلية. لاحظ أن بعض الخرز المغناطيسي لا تزال تعلق على الخلايا في هذه الخطوة البذر الأولية. معظم الخرز يغسل بعيدا أثناء توسيع الخلية، ولكن قد يستمر عدد قليل من الخرز في الممرات المبكرة.
    12. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في جو مرطب CO2 5٪ .
    13. تغيير الوسط كل يوم حتى تصل الخلايا 80 ٪ التقاء(الشكل 1B).
  3. توسيع الخلايا البطانية
    1. مرة واحدة الخلايا تصل إلى 80 ٪ التقاء، فصل مع 2 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA لكل طبق 100 مم في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    2. تحييد التربسين بإضافة 4 مل من EGM وجمع الخلايا في أنبوب واحد مخروطي 15 مل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 400 x ز في RT لمدة 5 دقائق.
    4. التعرق، الخلايا االسبوسنيد في 2 مل من EGM، وعد عدد الخلايا مع قياس الهيموسيت أو عن طريق عد الخلايا الآلي.
    5. خلايا البذور بكثافة 1 × 104 خلايا / سم² في 145 ملم ليفية مغلفة (1 ميكروغرام/ سم ²) لوحات زراعة الأنسجة.
    6. استمر في خلايا المرور حتى يتم تحقيق رقم الخلية المطلوب. النظر في أن التقاء 145 ملم لوحة الأنسجة ثقافة يحتوي على حوالي 8\u20129 × 106 الخلايا وعدد الخلايا اللازمة هو 2.5 × 106 الخلايا لكل حقن. الخلايا فقط بين مرور 3 و 8 ينبغي أن ينظر لxenograft.

4. VM المريض المشتقة بروتوكول xenograft

ملاحظة: في هذا البروتوكول نستخدم 5\u20126 الأسبوع من العمر، مناعي من الذكور، athymic عارية Foxn1nu الفئران.

يجب أن تتم الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة الرعاية والاستخدام الحيوانية المؤسسية (IACUC).

  1. إعداد المواد في اليوم السابق للحقن
    1. قبل البرد المحاقن والإبر ، ونصائح pipet في -20 درجة مئوية الفريزر بين عشية وضحاها.
    2. ذوبان ببطء غشاء الطابق السفلي مصفوفة خارج الخلية (BMEM) بين عشية وضحاها على دلو الجليد وضعت في 4 درجة مئوية لتجنب زيادة لزوجة الجل.
  2. إعداد تعليق الخلية للحقن
    1. Trypsinize EC مع 5 مل من قبل warmed 0.05٪ التربسين-EDTA لكل 145 مم طبق في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    2. تحييد التربسين بإضافة 5 مل من EGM وجمع الخلايا في أنبوب واحد مخروطي 15 مل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 400 x ز في RT لمدة 5 دقائق.
    4. التعرق، الخلايا االسبوسنيد في 3 مل من EGM، وعد عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي.
    5. تحديد العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة لجميع الحقن المخطط لها.
      ملاحظة: العدد الموصى به من الخلايا هو 2.5 × 106 خلايا لكل حقن. يتم تنفيذ ما مجموعه 2 حقن عادة في كل ماوس لتكرارة التقنية. فمن الضروري لحساب 10٪ الزائدة من عدد الخلية لحساب الخسارة أثناء نقل إلى الحقنة.
    6. نقل وحدة التخزين التي تحتوي على عدد الخلايا المحسوبة في أنبوب مخروطي جديد 50 مل وخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي عند 400 × ز في RT لمدة 5 دقائق.
    7. التعرق، وترك حجم صغير (حوالي 50\u201270 ميكرولتر) لتخفيف بيليه.
  3. إعداد المحاقن
    1. حساب حجم زائد من 20 ميكرولتر / حقن لحساب الخسارة أثناء نقل إلى الحقنة. Resuspend بيليه الخلية مع 220 ميكرولتر من BMEM لكل حقنة على الجليد. حجم حقن تعليق الخلية سيكون 200 ميكرولتر لكل آفة.
    2. اخلطي تعليق الخلية جيداً على الجليد للحصول على تعليق الخلية المتجانسة وتجنبي خلق فقاعات.
    3. باستخدام الأنابيب 1 مل وحقنة 1 مل، في وقت واحد الأنابيب BMEM الخلية الخليط في فتح حقنة من قبل قوة الشفط في حين سحب المكبس من حقنة.
    4. Luer قفل 26G × 5/8 إبرة بوصة معقمة إلى الحقنة والحفاظ على المحاقن المعدة شقة على الجليد قبل الحقن.
  4. حقن تحت الجلد في الماوس
    1. تخدير الفئران مع 5٪ خليط ايزوفلوران / الأكسجين بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة باستخدام مرذاذ ايزوفلوران. ضمان التخصير السليم للحيوانات (على سبيل المثال، عدم الاستجابة لقرصات أصابع الـ( إصبعي الـ(2). الحفاظ على التخدير عن طريق الإدارة المستمرة من 1.5٪ isoflurane / الأكسجين تسليمها عن طريق مخروط الأنف.
    2. ضع الفئران على معدتها ، مما يعرض المنطقة الخلفية التي سيحدث فيها التطعيم وتطهير منطقة الحقن بالإيثانول بنسبة 70٪.
    3. لفة بلطف حقنة أعدت لإعادة تعليق أي خلايا استقر. نفض الغبار فقاعات إلى نهاية إبرة من الحقنة وطرد حجم صغير من تعليق الخلية لضمان إزالة جميع الفقاعات.
      ملاحظة: يمكن إجراء حقنتين لكل فأرة – على الجانب الأيسر والأيّن من الفأرة.
    4. قرصة وخلق هيكل "خيمة مثل" باستخدام الإبهام وإصبع السبابة وإدراج الإبرة تحت الجلد الحق تحت الجلد. تأكد من أن الإبرة هي فقط الجلد العميق عن طريق الإفراج عن الجلد مقروص لمنع الحقن في الأنسجة العضلية.
    5. عقد إبرة في زاوية 45 درجة بعناية حقن 200 ميكرولتر من تعليق الخلية لخلق كتلة كروية صغيرة(الشكل 1C).
    6. سجل وزن الماوس مع مقياس، وعلامة الأذن الماوس، والعودة إلى قفص.
    7. مراقبة الفئران بعد التدهن للتأكد من عودتهم إلى النشاط الطبيعي.
  5. رصد نمو الآفة
    1. باستخدام الفرجر، قياس طول وعرض كل المكونات(الشكل 1D).
    2. قياسات الوثائق كل يومين حتى جمع الآفة.

5. جمع الأنسجة ومعالجتها

  1. القتل الرحيم الفئران 9 أيام بعد زرع في غرفة CO2 والتحقق من العلامات الحيوية لتأكيد الموت. إجراء خلع عنق الرحم على الفئران كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم الماوس.
  2. حصاد آفة xenograft / المكونات من جانب الماوس عن طريق تشريح باستخدام ملقط الجراحية والمقص.
    ملاحظة: من أجل منع تمزق الأوعية المليئة بالدم داخل المكونات ، من المهم تجنب لمس المكونات الآفة بأدوات التشريح وترك الأنسجة المحيطة المفرطة مثل الجلد المرفق بالمكونات.
  3. غمر الآفة التي تم استئصالها في PBS للاغتسال.
  4. إعداد مرحلة الكاميرا باستخدام كاميرا. محاذاة المقابس على لوحة القطع مع مسطرة. التقاط صورة لجميع المقابس لتسجيل الأوعية الدموية الإجمالية للآفات (الشكل 1E).
  5. إصلاح المقابس عن طريق الغمر في 10٪ formalin بين عشية وضحاها في RT.
  6. غسل المقابس في برنامج تلفزيوني في اليوم التالي ونقلها إلى 70٪ الإيثانول.
  7. معالجة آفات المقابس لالبارافين تضمين (علم الأمراض الأساسية).

6. الافتاء

  1. استخدام microtome لقطع 5 ميكرومتر أقسام من الآفات murine التي تم جمعها على الشرائح مشحونة بشكل إيجابي.
    ملاحظة: بالنسبة للتحليل اللاحق، تكون الأقسام في وسط المكونات (حوالي 50\u201270 ميكرومتر في الأنسجة) ذات أهمية.
  2. تذوب البارافين في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل تلطيخ.
  3. إزالة البخاريز وإعادة هيدرات الأنسجة بشكل متتابع تحت غطاء تدفق الدخان الكيميائي. لذلك، شريحة احتضان في إكسيلين لمدة 10 دقيقة، 100٪ الإيثانول (EtOH) لمدة 5 دقائق، ETOH 90٪ لمدة 3 دقائق، و 80٪ EtOH لمدة 3 دقائق.
  4. شطف الشريحة في الماء الأيون لمدة 5 دقائق.

7. هيماتيوكسيلين وايوسين (H & E)

  1. مقاطع احتضان في هيماوكسيلين لمدة 2 دقيقة.
  2. وضع الشرائح في جرة تلطيخ وشطف في بالوعة من قبل تيار مستمر من مياه الصنبور حتى يصبح الماء واضحا.
  3. دي هيدرات الشرائح عن طريق احتضان الأنسجة بالتسلسل في EtOH 70٪ لمدة 1 دقيقة، 80٪ EtOH لمدة 1 دقيقة، 90٪ EtOH لمدة 1 دقيقة، 100٪ EtOH لمدة 1 دقيقة، و 100٪ EtOH الطازجة لمدة 1 دقيقة.
  4. أقسام وصمة عار في إيوسين Y لمدة 30 s.
  5. شطف في 100٪ EtOH الطازجة حتى حل واضح.
  6. احتضان الشريحة في إكسيلين لمدة 2 دقيقة. اسمحوا الشرائح الجافة لمدة 5\u201210 دقيقة تحت غطاء محرك الدخان.
  7. الاستغناء عن قطرة دائمة، غير مائي تصاعد المتوسطة على أقسام xenografts ومكان coverslip على القمة.
  8. اسمح للشرائح بالجفاف طوال الليل قبل التصوير.

8. الكيمياء المناعية

  1. إعداد العازلة استرجاع المستضد (تريس-EDTA) عن طريق وزنها 0.6 غرام من تريس قاعدة و 1 مل من 0.5 M EDTA إلى 500 مل من المياه deionized. ضبط درجة ح H إلى 9.0 باستخدام 1 م HCl. إضافة 250 μL من توين-20.
  2. inubate دي paraffinized النسيج الشرائح (كما حصل في الخطوة 6.2\u20126.3) في منقار مع العازلة استرجاع المستضد, اثارة على كتلة التدفئة, لمدة 20 دقيقة في 95 درجة مئوية.
  3. إزالة من كتلة كتلة التدفئة، والسماح للمحلول لتبرد إلى 35 درجة مئوية ثم يغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق.
  4. أقسام كتلة الأنسجة في مصل الخيل العادي 5٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT.
  5. إعداد biotinylated Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) حل العمل عن طريق تخفيف 20 ميكروغرام / مل من biotinylated UEA-I في مصل الحصان العادي 5٪ في برنامج تلفزيوني.
  6. Pipet 50\u2012100 ميكرولتر من UEA-I حل العمل في القسم الواحد واحتضان لمدة 1 ساعة في RT في غرفة ترطيب.
  7. غسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق.
  8. اكويش شرائح المقاطع في بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 5 دقائق في RT.
  9. غسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق.
  10. إعداد 5 ميكروغرام / مل من Streptavidin الفجل peroxidase- مترافق في مصل الحصان العادي 5٪ في برنامج تلفزيوني.
  11. Pipet 50\u2012100 ميكرولتر على كل شريحة من الأنسجة واحتضان لمدة 1 ساعة في RT في غرفة ترطيب.
  12. غسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق.
  13. إعداد 3،3'Diaminobenzidine (DAB) حل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وإضافة 50\u2012100 ميكرولتر لكل قسم.
  14. احتضان المقاطع لمدة 10\u201215 دقيقة، والتحقق والرصد لتطوير وصمة عار كل 2\u20125 دقيقة.
  15. غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق.
  16. إضافة قطرة من الهماتيوكسيلين واحتضان لمدة 3 دقائق.
  17. وضع الشرائح في جرة تلطيخ وشطف في بالوعة من قبل تيار مستمر من مياه الصنبور حتى يصبح الماء واضحا.
  18. متتابعة احتضان الشريحة في 80٪ EtOH لمدة 1 دقيقة، 90٪ EtOH لمدة 1 دقيقة، EtOH 100٪ لمدة 1 دقيقة، والزيلين لمدة 2 دقيقة.
  19. اسمحوا الشرائح الجافة لمدة 5\u201210 دقيقة تحت غطاء محرك الدخان.
  20. الاستغناء عن قطرة دائمة، غير مائي تصاعد المتوسطة على أقسام xenografts ومكان coverslip على القمة.
  21. اسمح للشرائح بالجفاف طوال الليل قبل التصوير.

9. تحليل القنوات الوعائية المشتقة من الإنسان

ملاحظة: يتم قياس الأوعية الدموية للآفات VM عن طريق قياس منطقة الأوعية الدموية وكثافة الأوعية الدموية. فقط UEA-I الإيجابية, يتم النظر في القنوات الوعائية المستمدة من الإنسان من أجل القياس الكمي.

  1. اتخاذ أربع إلى خمس صور لكل قسم الآفة مع المجهر الميداني مشرق في التكبير 20x (حقول الطاقة العالية [HPF]). التقاط الصور HPF في نمط طائرة x داخل قسم الآفة لتجنب التداخل (الشكل 1F-H). قم بتضمين شريط مقياس على الصور المُتَخَذة.
  2. فتح الصور HPF في صورة J(ملف > فتح). معايرة بكسل شريط المقياس كما يلي. استخدام أداة خط مستقيم وتذهب على شريط مقياس. لتحويل بكسل قياس إلى مم انقر على تحليل > تعيين مقياس.
  3. انقر على تحليل > تعيين القياسات وحدد المنطقة وإضافة إلى تراكب.
  4. قياس مساحة الحقل الإجمالية في HPF باستخدام التحليل > قياس. حفظ هذا القياس من أجل القياس الكمي في الخطوة 9.8.
  5. باستخدام أداة التحديدات اليدوي ، مخطط يدويًا UEA-I+ قنوات الأوعية الدموية.
    ملاحظة: يتم تعريف قناة الأوعية الدموية على أنها أي منطقة تصطف مع UEA-I+ - EC التي قد تحتوي على خلايا الدم.
  6. انقر على تحليل > قياس لتحديد مخطط UEA-I+ منطقة الأوعية الدموية (مم2/ HPF).
  7. كرر هذا القياس لجميع HPF الخمسة التي اتخذت داخل قابس واحد.
  8. متوسط إجمالي المساحة الوعائية في كل خمسة قوة قوة تشغيل عالية. يتم تقسيم منطقة الأوعية الدموية التي تم الحصول عليها لكل HPF لاحقًا حسب منطقة حقل HPF (في مم2، الخطوة 9.5) ويتم التعبير عنها كنسبة مئوية (٪).
  9. بالنسبة إلى القياس الكمي لكثافة الأوعية الدموية، عد عدد القنوات UEA-I+ الأوعية الدموية لكل قوة HP التي يتم التقاطها. كثافة الأوعية الدموية هو متوسط عدد UEA-I+ قنوات الأوعية الدموية التي يتم حسابها في منطقة HPF (السفن / مم2).

النتائج

يصف هذا البروتوكول عملية توليد نموذج مورين xenograft من VM على أساس الحقن تحت الجلد من EC المستمدة من المريض في الجزء الخلفي من الفئران العارية المناعية. يمكن حصادها مستعمرة الخلايا البطانية في غضون 4 أسابيع بعد عزل الخلايا الأولية من أنسجة الجهاز الظاهري أو الدم الآفة(الشكل 1A، B). في الي...

Discussion

هنا، نحن وصف طريقة لتوليد نموذج xenograft المستمدة من المريض من VM. يقدم هذا النموذج مورين نظام ممتاز يسمح للباحثين بالحصول على فهم أعمق لتوسيع التجويف المرضي وسيكون له دور فعال في تطوير علاجات أكثر فعالية واستهدافًا لعلاج VM. هذا يمكن تكييفها بسهولة للتحقيق في أنواع أخرى من الشذوذ الوعائي مثل ا...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

ويود المؤلفون أن يشكروا بحيرات نورا على التدقيق اللغوي. وقد تم دعم البحوث التي تم الإبلاغ عنها في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم، تحت رقم الجائزة R01 HL117952 (E.B.)، وهي جزء من المعاهد الوطنية للصحة. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, malesEnvigo069(nu)/070(nu/+)Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)Vector LaboratoriesB-1065Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM)Thermo Fisher974106Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA)BSAA7906-50MGCell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)SigmaC7902-500GCell culture
CaliperElectron Microscopy Sciences50996491Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)Life Technologies11155DEC separation
Cell strainer (100 μM)Greiner542000Cell culture
Collagenase ARoche10103578001Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL)Greiner07 000 241Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL)Greiner07 000 239Cell culture
Coplin staining jarTed Pella21029Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm)Fisher Scientific12545EHistological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)Vector LaboratoriesSK-4105Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)Corning10-027-CVCell culture
DynaMag-2Life Technologies12321DEC separation
Ear punchVWR10806-286Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0)Life Technologies15575-020Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)LonzaCC-3162Cell culture
Eosin Y (alcohol-based)Thermo Scientific71211Histological anlaysis
EthanolDecon Labs2716Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyCloneGE HealthcareSH30910.03Cell culture
Filter tip 1,250 μLMidSciAV1250-HMultiple steps
Filter tip 20 μLVWR10017-064Multiple steps
Filter tip 200 μLVWR10017-068Multiple steps
Formalin buffered solution (10%)SigmaF04586Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable)SKC FILMSDHCN015Cell culture
HematoxylinVector HematoxylinH-3401Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)SigmaFC010-10MGCell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)SigmaH1009Histological anlaysis
ImageJ SoftwareAnalysis
Isoflurane, USPAkorn Animal Health59399-106-01Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)SigmaM1880-500GCell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)Corning356237Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL)VWR87003-294EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)Fisher Scientific1255015-CSHistological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needlesBecton Dickinson (BD)BD305115Subcutaneous injection
Normal horse serumVector LaboratoriesS-2000Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)Corning30-009-CICell culture
Permanent mounting medium (VectaMount)Vector LaboratoriesH-5000Histological anlaysis
Pestle Size C, PlainThomas Scientific3431F55EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificBP3994Cell culture
ScaleVWR65500-202Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml)VWR89130-898Cell culture
Serological pipettes (5ml)VWR89130-896Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3)Sigma223530Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHCVector LaboratoriesSA-5004Cell culture
Syringe (60ml)BD Biosciences309653Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM)Corning431219Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock)Becton Dickinson (BD)BD-309628Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)Greiner664160Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm)Greiner639160Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mmEppendorf30701119Cell culture
Tris-base (Trizma base)SigmaT6066Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %)Life Technologies15250061Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)Corning25-052-ClCell culture
Tween-20Biorad170-6531Histological anlaysis
Wheaton bottleVWR16159-798Cell culture
XylenesFisher ScientificX3P-1GALHistological anlaysis

References

  1. Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
  2. Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
  3. Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
  4. Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
  5. Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
  6. Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
  7. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
  8. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  9. Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
  10. Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
  12. Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
  13. Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
  14. Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
  15. Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
  16. Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
  17. Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160 xenograft TIE2 PIK3CA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved