정맥 기형에 대한 환자 유래 제노이식 모델

요약

우리는 정맥 기형의 뮤린 xenograft 모형을 생성하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 본 모델은 하이퍼 활성화 TIE2 및/또는 PIK3CA 유전자 돌연변이를 포함하는 환자 유래 내피 세포의 피하 주입을 기반으로 한다. Xenograft 병변은 VM 환자 조직의 조직 병리학적 특징을 밀접하게 재구성합니다.

초록

정맥 기형 (VM)은 혈관 이상으로 정맥 네트워크의 손상된 발달로 인해 팽창되고 종종 기능 장애 정맥이 발생합니다. 이 문서의 목적은 인간 VM을 모방하고 환자 이질성을 반영할 수 있는 뮤린 이노이식 모델의 확립을 신중하게 설명하는 것입니다. 내피 세포(EC)에서 의학적 유전(체혈) TEK(TIE2) 및 PIK3CA 돌연변이를 하이퍼 활성화시키는 것은 VM에서 병리학적 혈관 확대의 주요 동인으로 확인되었다. TEK 다음 프로토콜은 돌연변이 TIE2 및/또는 PIK3CA를 발현하는 환자 유래 EC의 격리, 정제 및 확장을 설명합니다. 이 EC는 면역 절제성 자티믹 마우스의 뒤쪽으로 피하주사되어 유방 혈관 채널을 생성합니다. TIE2 또는 PIK3CA 돌연변이 EC로 생성된 병변은 VM 환자 조직의 주입 및 조직 병리학적 특징을 재구성한 7\u20129 일 이내에 눈에 띄게 혈관화된다. 이 VM 제노이식 모델은 VM 형성 및 확장을 주도하는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 또한, 본 모델은 인간 VM에서 볼 수 있는 비정상적인 혈관 확대를 방지하는 새로운 약물 후보의 효능을 시험하는 번역 연구에 도움이 될 것이다.

서문

혈관의 발달에 있는 결점은 정맥 기형 (VM)를 포함하여 많은 질병의 근본 원인입니다. VM은 비정상적인 형태 발생 및 정맥^1의확장을 특징으로 하는 선천성 질환이다. VM 조직 및 내피 세포 (EC)에 대한 중요한 연구는 두 가지 유전자에서 게인 돌연변이를 확인했습니다 : 티로신 키나아제 수용체 TIE2를 인코딩하는 TEK과 PIK3CA는PI3-kinase (PI3K)^,2,3,,4,^5의p110α (촉매 하위 단위)를 인코딩합니다. 이러한 체세포 돌연변이는 PI3K/AKT를 포함한 주요 혈관신생/성장 신호 경로의 리간드 독립적인 하이퍼 활성화를 초래하여 3개의 압자정맥을³팽창시키는 결과를 낳는다. 이러한 중요한 유전 적 발견에도 불구하고 비정상적인 혈관 신생 및 확대 된 혈관 채널의 형성을 유발하는 후속 세포 및 분자 메커니즘은 여전히 완전히 이해되지 않습니다.

정상 및 병리학 적 혈관 신생 동안, 기존의 혈관 네트워크 및 EC에서 새로운 혈관싹증증증, 마이그레이션, 세포 외 매트릭스 (ECM) 리모델링 및 루멘 형성^6을포함하는 중요한 세포 과정의 순서를 겪는다. EC의 체외 배양에서 2차원 및 3차원(2D/3D)은 이러한 각 셀룰러 특성을 개별적으로 조사하는 중요한 도구입니다. 그럼에도 불구하고, 마우스 모델에 대한 명확한 요구가 호스트 미세 환경 내에서 병리학 적 혈관 확대를 회수하면서 번역 연구를위한 표적 약물의 전임상 평가를위한 효율적인 플랫폼을 제공.

현재까지 TIE2 게인-기능 돌연변이와 관련된 VM의 형질전환 모린 모델은 보고되지 않았다. 현재 형질전환 VM 마우스 모델은 활성화 돌연변이 PIK3CA p.H1047R^3,,5의유비쿼터스 또는 조직 제한 발현에 의존한다. 이 형질 전환 동물은 이 핫스팟 PIK3CA 돌연변이의 전신 또는 조직 특정 효력에 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 모형의 한계는 초기 치사성의 결과로 높게 병리학적인 혈관 네트워크의 형성입니다. 따라서, 이러한 마우스 모델은 VM 병리학의 돌연변이 이벤트 및 국소화된 성질의 산발적 발생을 완전히 반영하지 않는다.

반대로, 환자 유래 이종이이식 모델은 환자로부터 유래한 병리학적 조직 또는 세포의 이식 또는 주입에 기초하여 면역결핍 마우스^7을포함한다. 제노이식 모델은 새로운 치료제^8의질병 발달 및 발견에 대한 지식을 넓히는 강력한 도구이다. 또한, 환자 유래 세포를 사용하면 과학자들이 돌연변이 이질성을 재구성하여 환자 표현형의 스펙트럼을 연구할 수 있습니다.

여기서는, 우리는 자티믹 누드 마우스의 뒷면에 피하로 주입되는 TIE2 및/또는 PIK3CA의 돌연변이 성분 활성 형태를 표현하는 환자 유래 VM EC가 피하되는 프로토콜을 기술합니다. 주입된 혈관 세포는 이전 혈관 이종이이식 모델^9,,10,,11에기술된 바와 같이 혈관 신생을 촉진하기 위해 ECM 프레임워크에서 중단된다. 이러한 VM EC는 중요한 형태 발생을 겪고 지원 세포의 부재에 확대, perfused 병리학 혈관을 생성합니다. VM의 설명된 xenograft 모델은 통제되지 않은 루멘 확장을 억제하는 능력에 대한 표적 약물의 전임상 평가를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

환자 조직 샘플은 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC), 암 및 혈액 질환 연구소및 임상 조사위원회의 승인을 받은 기관 정책에 따라 승인 된 기관 검토 위원회 (IRB)에 따라 종양 및 혈관 이상을 가진 환자로부터 조직 샘플 및 데이터의 수집 및 저장소에서 통보 된 동의 후 참가자로부터 얻어졌습니다. 아래에 설명된 모든 동물 절차는 CCHMC 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 재료 및 재고 솔루션 준비

1. 완전한 내피 세포 성장 배지의 준비 (EGM)
   1. 키트에 존재하는 다음과 같은 성장 인자를 가진 보충 내피 기저배지(EBM) 키트에 존재하는 다음과 같은 성장 인자(재료표참조): 인간 섬유아세포 성장 인자-베타(hFGF-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 롱 아르그3 인슐린 유사 성장 인자-I(R 3-IGF-I), 아스코르산, 표피 성장 인자 (EGF), 젠타마이신 황산염 및 암포테리신-B, 그리고 헤파린.³ 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민(PSG) 용액과 20% 태아소 혈청(FBS)을 추가합니다.
      참고: 하이드로코르티손은 추가하지 않는 것이 좋습니다.
   2. 멸균 필터는 0.2 μm 병 상단 필터를 통해 50mL 원뿔 튜브로 용액을 필터링하고 최대 1 년 동안 4 °C 또는 -20 °C에 저장합니다.
2. 콜라게나아제 주식 솔루션 준비
   1. 1x 인산염 완충식염(PBS)으로 50 mg/mL 콜라게나아제 주식 용액을 준비합니다.
   2. 멸균 필터는 0.2 μm 필터 및 주사기를 가진 라미나르 유동 후드 하에서 용액을 필터링하고 -20 °C에 100 μL 알리쿼트를 저장합니다.
3. 조직 수집 배지 준비(버퍼 A)
   1. 카²⁺/Mg²⁺ 스톡 용액은 0.927 g의 염화 칼슘 이수제(CaCl_2.2H2O)와 황산 염 1 g(MgSO_4.7H2O)에서 증류수 500mL를 추가하여 준비합니다. 멸균 필터는 0.2 μm 병 상단 필터를 통해 용액을 오토클레이브 유리 병에 넣고 실온(RT)에 보관합니다.
   2. 10% Ca²⁺/Mg²⁺ 솔루션 및 2% FBS를 갖춘 DMEM(DMEM)을 보완합니다.
   3. 멸균 필터는 0.2 μm 필터와 주사기와 라미나르 흐름 후드 아래용액을 필터링하고 -20 °C에서 5mL의 알리쿼트를 저장합니다.
4. 조직 배양 판의 섬유네틴 코팅
   1. 500mL의 탈화수에서 탄산나트륨 5.3g(Na2₂CO_3;0.1M)을 용해시켜 코팅 버퍼(Buffer B)를 준비한다. 완충제의 pH를 1M 염산산(HCl)을 사용하여 9.4로 조정한다. 0.2 μm 병 상단 필터를 통해 라미나르 흐름 후드 아래를 오토클레이브 유리 병에 넣고 RT에 보관합니다.
   2. 코팅의 경우, 파이펫 2 mL/5 mL/10 mL 의 버퍼 B는 각각 60mm/100mm/145mm 조직 배양 플레이트당. 인간 플라즈마 섬유네틴 정제 단백질 용액의 1 μg/cm^2를 추가하고 부드럽게 접시에 액체를 분배합니다.
   3. 37 °C에서 배양 플레이트, 20 분 동안 5 % CO_2.
   4. 버퍼 B를 흡인하고 세포를 배양하기 전에 PBS로 플레이트를 세척합니다.

2. VM 환자 조직에서 내피 세포의 격리

1. 고체 VM 조직에서 EC의 격리
   참고: VM 조직은 IRB 승인 프로토콜에 따라 수술^12,,13을 탈벌하여 절제됩니다.
   1. 세척 VM 조직 (조직 샘플 무게는 일반적으로 PBS에서 5 % PSG에서 0.5 g와 1.5 g 사이의 범위).
   2. 조직을 100mm 세포 배양 접시로 옮기고, 멸균 수술 용 해부 도구를 사용하여 작은 조각으로 조직 샘플을 다진 다음 50mL 원뿔 관으로 옮김합니다.
   3. 콜라게나아제 A 스톡 용액 100μL을 버퍼 A 5mL에 첨가하여 최종 농도1 mg/mL을 한 다음, 이를 조직에 추가하고 다진 조직을 37°C에서 30분 동안 소화하면서 5분마다 내용물을 흔들어 보겠습니다.
   4. 50mL 원피스 튜브 내의 6mm, 매끄러운 표면 유봉 분쇄기를 사용하여 RT에서 소화된 조직을 조심스럽게 갈아줍니다.
   5. 0.5% 소 세럼 알부민(BSA)과 2%의 PSG로 보충된 차가운 PBS 5mL을 추가하면서 유봉을 사용하여 소화 조직을 신중하게 연마합니다. 이 단계를 네 번 반복합니다.
   6. 100 μm 세포 여과기를 50mL 원문 튜브로 필터링하여 조직 단편을 제거합니다.
   7. RT에서 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 셀 서스펜션은 2.3 단계로 진행됩니다.
2. 환자 경화요법에서 얻은 레시오날 혈액으로부터 VM EC의 격리
   1. IRB 승인 프로토콜에 따라 경화요법에서 인간 VM 레시오날 혈액을 얻습니다.
   2. PBS에서 유신 혈액(샘플 부피는 전형적으로 0.5mL와 5mL 사이)를 최종 부피40mL로 희석시합니다.
   3. RT에서 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 세포 현탁액.
3. 초기 셀 도금
   1. 상체를 버리고 EGM의 1 mL에서 단일 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
   2. 전체 EGM 9mL을 섬유네틴 코팅(1 μg/cm²) 100mm 플레이트에 넣고 셀 서스펜션 1mL을 시드로 넣습니다.
   3. 가습 5%_CO2 대기에서 37°C에서 세포를 배양한다.
   4. 격일 2mL의 미디어를 제거하고 멸균 필터링 된 FBS 2 mL을 추가합니다.
   5. 세포 배양이 40\u201250%의 합류에 도달하면 EGM을 완료하기 위해 매체를 변경합니다. 그것은 일반적으로 세포가 이 합류에 도달하기 위하여 2\u20123 주 사이에서 걸립니다.
   6. EC 식민지의 출현을 매일 관찰하십시오. 그들은 그들의 전형적인 "조약돌 같은"형태에 의해 인식 될 수있다(도 1A). 3\u20125 EC-콜로니 사이 각 샘플에 나타납니다.
   7. 개별 EC 식민지가 서로 접촉하기 시작할 때까지 다른 5\u20127 일 동안 매체를 변경합니다.
4. 개별 EC 콜로니의 수동 격리
   1. EC 콜로니를 수확하려면 5mL의 PBS로 접시를 씻고 서학적 파이펫으로 수동으로 흡인하십시오.
   2. 접시를 현미경으로 가져 가서 뚜껑과 하단에 마킹 펜을 사용하여 여러 EC 콜로니의 위치를 동그라미나 플로우 후드로 되돌리십시오.
   3. 표시된 영역에 0.05 % 트립신-EDTA 용액의 50 μL을 파이프팅하여 EC 콜로니를 분리합니다.
   4. 작은 셀 스크레이퍼 또는 파이펫 팁을 사용하여 플레이트에서 셀을 부드럽게 긁어냅니다.
   5. 플레이트를 가장 가까운 가장자리로 기울이고 표시된 영역당 1mL의 EGM으로 헹구고 세포를 수집합니다.
   6. 혈전계 또는 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다.
   7. 수집된 EC 콜로니를 1 x 10⁴ 세포/cm^2의 밀도로 섬유네틴 코팅(1 μg/cm²) 세포 배양 접시에 신선한 EGM을 함유한다. 다음 날, EGM을 완료하기 위해 매체를 변경합니다.
   8. 세포가 80%의 합류에 도달할 때까지 매일 EGM을 완료하도록 배지를 변경합니다.
   9. 37°C에서 100mm 접시당 2mL의 사전 따뜻하게 0.05% 트립신-EDTA를 2분 동안 2mL로 트립시니징하고 EGM 4mL을 추가하여 트립신을 중화시한다.
   10. 15mL 원뿔관과 원심분리기를 400 x g에서 5분 동안 RT로 수집합니다. EGM의 2mL에서 슈퍼나탈트 및 재분리 셀을 흡인한다.
   11. 혈전계 또는 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다. 수득된 일반적인 세포 수는 60mm 세포 배양 판 당 1 x 10⁶ 세포 또는 100mm 조직 배양 판 당 2 x 10⁶ 세포입니다.
   12. RT에서 400 x g에서 원심분리로 세포를 5분 동안 펠릿하고 수퍼나탄을 흡인시합니다. 3.2.1 단계로 진행합니다.

3. 내피 세포 선택 및 확장

1. 안티 CD31-공주 마그네틱 구슬의 준비
   1. 30s용 안티 CD31-공주 마그네틱 구슬을 함유한 바이알을 소용돌이시다. 필요한 구슬의 수는 8 x 10⁶ 구슬 / 2 x 10⁶ 셀입니다.
   2. 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에서 PBS에서 0.1% BSA를 함유한 1mL의 세척 용액으로 원하는 양의 안티 CD31-공주 마그네틱 구슬을 세척한다.
   3. 마이크로센티페리지 튜브를 세포 격리 자석에 1분 간 놓습니다.
   4. 슈퍼 네티퍼를 흡인하고 세척 단계를 반복합니다.
2. 내피 세포 정화 및 도금
   1. PBS에서 0.1% BSA를 함유한 세척 용액의 500 μL에서 2.4.12에서 얻은 세포 펠릿을 재중단한다.
   2. 마그네틱 구슬이 들어 있는 마이크로센심분리기 튜브에 세포 용액을 추가하고 철저히 재연합니다.
   3. 부드러운 기울기와 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
   4. PBS에 0.1% BSA의 500 μL을 추가하고 잘 섞습니다.
   5. 튜브를 세포 격리 자석에 1분 간 놓습니다.
   6. 구슬을 건드리지 않고 CD31 음극분비를 포함하는 모든 액체를 부드럽게 흡입합니다.
   7. PBS에서 0.1% BSA의 1mL로 CD31 양성 셀 분획을 함유한 비드 펠릿을 세척하고 자기 분리를 반복한다.
   8. CD31 양성 세포 분획을 정화하기 위해 최소 3회 동안 세척 및 자기 분리 단계를 반복합니다.
   9. 정제된 내피 세포를 15mL 원문 튜브로 재차 중단하고 RT에서 400 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
   10. EGM의 1 mL에서 상체를 제거하고 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
   11. 전체 EGM 9mL을 섬유네틴 코팅(1 μg/cm²) 100mm 플레이트에 넣고 셀 서스펜션 1mL을 시드로 넣습니다. 일부 마그네틱 구슬은 이 초기 시드 단계의 셀에 여전히 부착되어 있습니다. 대부분의 구슬은 세포 확장 도중 씻어 내지만, 구슬의 작은 수는 초기 통로에서 지속될 수 있습니다.
   12. 가습 5%_CO2 대기에서 37°C에서 세포를 배양한다.
   13. 세포가 80%의 수렴성(도1B)에도달할 때까지 격일로 배지를 변경합니다.
3. 내피 세포 확장
   1. 일단 세포가 80%의 합류에 도달하면, 2분 동안 37°C에서 100mm 접시당 0.05%의 트립신-EDTA2mL로 분리합니다.
   2. EGM의 4mL를 추가하여 트립신을 중화시키고 세포를 15mL 원추형 튜브로 수집합니다.
   3. RT에서 400 x g의 원심 분리기는 5 분 동안.
   4. 슈퍼나티를 흡습하고, EGM의 2mL에서 세포를 재보습하고, 혈전계 또는 자동 세포 계수를 사용하여 세포의 수를 계산한다.
   5. 1x 10⁴ 세포/cm²의 밀도에서 종자 세포는 145mm 섬유네틴 코팅(1 μg/cm²) 조직 배양 판으로 한다.
   6. 원하는 세포 수가 충족될 때까지 세포를 계속 통과합니다. 145mm 조직 배양판은 약 8\u20129 x 10⁶ 세포를 포함하고 필요한 세포의 수는 주사당 2.5 x 10⁶ 세포입니다. 3번과 8번 통로 사이의 세포만 이노이식에 대해 고려해야 한다.

4. VM 환자 유래 제노이식 프로토콜

참고 :이 프로토콜에서 우리는 5\u20126 주 된 남성 면역 결핍, 자티믹 누드 Foxn1^nu 마우스를 사용합니다.

모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받아야합니다.

1. 주사 전날의 재료 준비
   1. -20°C 냉동고에서 미리 오한 주사기, 바늘 및 파이펫 팁 -20°C 냉동고.
   2. 젤의 점도 증가를 피하기 위해 4 °C에 배치 된 얼음 양동이에 지하실 막 세포 외 매트릭스 (BMEM)를 밤새 천천히 해동하십시오.
2. 주사제 세포 현탁액 준비
   1. 37°C에서 145mm 접시당 5mL의 사전 따뜻하게 0.05% 트립신-EDTA를 2분 동안 트립시니즈.
   2. EGM의 5mL를 추가하여 트립신을 중화시키고 세포를 15mL 원추형 튜브로 수집합니다.
   3. RT에서 400 x g의 원심 분리기는 5 분 동안.
   4. 슈퍼나탈을 흡습하고, EGM의 3mL에서 세포를 재보습하고, 혈전계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포의 수를 계산한다.
   5. 계획된 모든 주사에 필요한 총 세포 수를 결정합니다.
      참고: 권장되는 셀 수는 주사당 2.5 x 10⁶ 세포입니다. 총 2 개의 주사는 일반적으로 기술 복제에 대 한 각 마우스에서 수행. 주사기로 이송하는 동안 손실을 고려하여 셀 번호의 10% 초과를 계산할 필요가 있습니다.
   6. 계산된 세포 수를 포함하는 부피를 새로운 50mL 원판 튜브 및 펠릿 세포로 5분 동안 RT에서 400 x g에서 원심분리하여 전달한다.
   7. 수퍼네티드를 흡인하여 작은 부피(약 50\u201270 μL)를 남기고 펠릿을 풀어 놓습니다.
3. 주사기 준비
   1. 주사기로 이송하는 동안 손실을 고려하여 20 μL/주입의 초과 부피를 계산합니다. 얼음에 주입 당 BMEM의 220 μL로 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 현탁액의 주입된 부피는 병변 당 200 μL이 될 것입니다.
   2. 동질세포 현탁액을 얻고 거품을 일으키지 않도록 얼음에 셀 서스펜션을 철저히 섞는다.
   3. 1mL 파이펫과 1mL 주사기를 사용하여, 동시에 주사기의 플런저를 당기면서 흡입력에 의한 주사기 개구부로 BMEM-셀 혼합물을 피펫한다.
   4. Luer는 26G x 5/8 인치 멸균 바늘을 주사기에 잠그고 주입 하기 전에 얼음에 평평하게 준비 된 주사기를 유지합니다.
4. 마우스에 피하 주입
   1. 이소플루란 기화기를 사용하여 1 L/min의 유속도로 5% 이소플루란/산소 혼합물로 마우스를 마취한다. 동물의 적절한 식착을 보장합니다 (예 : 발가락 핀치에 대한 반응성). 코 콘을 통해 전달 된 1.5 %의 이소플루란 / 산소의 지속적인 투여를 통해 마취를 유지합니다.
   2. 마우스를 위장에 놓고 이식이 발생하는 후 부위를 노출하고 70%의 에탄올로 주사 부위를 소독합니다.
   3. 준비된 주사기를 부드럽게 굴려 정착된 세포를 다시 보냅니다. 주사기의 바늘 끝으로 거품을 플릭하고 모든 거품의 제거를 보장하기 위해 셀 현탁액의 소량을 추방한다.
      참고: 마우스 뒷면의 왼쪽과 오른쪽에 있는 각 마우스에 대해 두 개의 주사를 수행할 수 있습니다.
   4. 엄지와 검지 손가락을 사용하여 '텐트와 같은' 구조를 꼬집고 만들고 피부 바로 아래에 바늘을 피하로 삽입하십시오. 바늘이 근육 조직에 주입을 방지하기 위해 꼬집은 피부를 방출하여 피부 깊숙이 있는지 확인하십시오.
   5. 45° 각도에서 바늘을 잡고 조심스럽게 작은 구형 질량(도 1C)을생성하기 위해 세포 현탁액의 200 μL을 주입한다.
   6. 마우스 무게를 축척으로 기록하고, 마우스를 태그하고, 케이지로 돌아갑니다.
   7. 식착 후 마우스를 모니터링하여 정상적인 활동으로 돌아갈 수 있도록 합니다.
5. 병변 성장 모니터링
   1. 캘리퍼를 사용하여 각 플러그의 길이와너비(그림 1D)를측정합니다.
   2. 병변 수집까지 매일 측정을 문서화합니다.

5. 조직 수집 및 처리

1. CO₂ 챔버에서 9 일 동안 마우스를 안락사시키고 사망을 확인하기 위해 활력 징후를 확인하십시오. 마우스를 안락사시키는 보조 방법으로 마우스에 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
2. 외과 용 집게와 가위를 사용하여 해부에 의해 마우스의 측면에서 xenograft 병변 / 플러그를 수확하십시오.
   참고: 플러그 내의 혈액 이가득 혈관을 파열하는 것을 방지하기 위해서는 해부 도구로 병변 플러그를 만지지 말고 플러그에 부착된 피부와 같은 과도한 주변 조직을 두는 것이 중요합니다.
3. 세척 PBS에 제분 병변을 담급.
4. 카메라로 카메라 스테이지를 설정합니다. 도마에 플러그를 세팅합니다. 병변의 총 혈관을 기록하기 위해 모든 플러그의 이미지를 가져 가라(도 1E).
5. RT에서 하룻밤 사이에 10% 포르말린에 잠아 플러그를 수정합니다.
6. 다음 날 PBS에 플러그를 세척하고 70 % 에탄올로 이동합니다.
7. 파라핀 포함(병리학 코어)을 위한 병변 플러그를 처리합니다.

6. 병변 단면

1. 마이크로톤을 사용하여 수집된 뮤린 병변에서 5μm 부분을 양전하 슬라이드로 잘라냅니다.
   참고: 후속 분석의 경우 플러그 중앙의 단면(조직 내 약 50\u201270 μm)이 중요합니다.
2. 염색하기 전에 파라핀을 60°C에서 1시간 동안 녹입니다.
3. 화학 연기 흐름 후드 하에서 조직을 순차적으로 분리하고 재수화합니다. 따라서 자일렌에서 10분, 100% 에탄올(EtOH)에서 5분, 3분 동안 90% EtOH, 80% EtOH를 3분 동안 배양한다.
4. 5 분 동안 탈온 된 물에 헹구십시오.

7. 헤마톡슬린과 에오신 (H&E)

1. 헤마톡슬린의 구역을 2분 동안 배양합니다.
2. 스테인링 항아리에 슬라이드를 놓고 물이 맑을 때까지 꾸준한 수돗물로 싱크대에 헹구십시오.
3. 디하이드레이트 슬라이드는 조직을 70% EtOH로 순차적으로 배양하여 1분 동안, 80% EtOH는 1분, 1분 동안 90% EtOH, 1분 동안 100% EtOH, 1분 동안 100% EtOH, 1분 동안 100% EtOH를 순량하게 배양하여 1분 동안 EtOH를 순량하게 합니다.
4. 에오신 Y의 스테인 섹션30 s.
5. 해결책이 명확해질 때까지 신선한 100% EtOH로 헹구습니다.
6. 2 분 동안 xylenes에서 인큐베이션 슬라이드. 연기 후드 아래 5\u201210 분 동안 슬라이드를 건조시키십시오.
7. xenografts 섹션 위에 영구적이고 수성이 아닌 장착 매체를 한 방울 떨어뜨리고 커버슬립을 위에 놓습니다.
8. 이미징 전에 밤새 슬라이드가 건조되도록 합니다.

8. 면역 작용화학

1. 트리스베이스 0.6g, 0.5M EDTA ~ 500mL의 1mL의 탈화수를 계량하여 항원 회수 버퍼(Tris-EDTA)를 준비한다. 1M HCl을 사용하여 pH를 9.0으로 조정합니다.
2. 항원 회수 완충제를 가진 비커에서 파라핀화 조직 슬라이드(6.2\u20126.3 단계에서 얻은 바와 같이)를 95°C에서 20분 동안 가열 블록에 교반한다.
3. 가열 블록에서 비커를 제거하고 용액이 35 °C로 식힌 다음 PBS에서 3 분 동안 세척 할 수 있습니다.
4. RT에서 30 분 동안 PBS에서 5 % 정상 말 혈청에서 조직 섹션을 차단합니다.
5. PBS의 5% 일반 말 혈청에 바이오티니화 UEA-I의 20 μg/mL을 희석하여 바이오티니징 울렉스 유로파유스 agglutin-I(UEA-I) 작업 솔루션을 준비합니다.
6. 파이프 50\u2012100 μL 의 UEA-I 작업 솔루션 섹션당 작업 및 가습 챔버에서 RT에서 1 h에 대한 인큐베이션.
7. PBS에서 슬라이드를 2회 3분 간 세척합니다.
8. RT에서 5 분 동안 과산화수소 3 %의 캔치 슬라이드 섹션을 담금질합니다.
9. PBS에서 슬라이드를 2회 3분 간 세척합니다.
10. PBS에서 5% 일반 말 세럼에 수직인 고추냉이 과산화구리수-컨쥬게이트의 5 μg/mL을 준비합니다.
11. 파이프 50\u2012100 각 조직 슬라이드에 μL및 가습 챔버에서 RT에서 1 시간 동안 인큐베이트.
12. PBS에서 슬라이드를 2회 3분 간 세척합니다.
13. 제조업체의 지침에 따라 3,3'Diaminobenzidine (DAB) 솔루션을 준비하고 섹션당 50\u2012100 μL을 추가하십시오.
14. 10\u201215 분 동안 섹션을 인큐베이션하여 2 \u20125 분마다 얼룩 의 개발을 확인하고 모니터링합니다.
15. PBS에서 3분 동안 세 번 슬라이드를 세척합니다.
16. 헤마톡슬린 한 방울을 넣고 3분 동안 배양합니다.
17. 스테인링 항아리에 슬라이드를 놓고 물이 맑을 때까지 꾸준한 수돗물로 싱크대에 헹구십시오.
18. 순차적으로 슬라이드를 80% EtOH에서 1분 동안, 90% EtOH1분, 1분 동안 100% EtOH, 2분 동안 자일렌을 순차적으로 배양합니다.
19. 연기 후드 아래 5\u201210 분 동안 슬라이드를 건조시키십시오.
20. xenografts 섹션 위에 영구적이고 수성이 아닌 장착 매체를 한 방울 떨어뜨리고 커버슬립을 위에 놓습니다.
21. 이미징 전에 밤새 슬라이드가 건조되도록 합니다.

9. 인간이 파생한 혈관 채널 분석

참고: VM 병변의 혈관은 혈관 면적 과 혈관 밀도를 측정하여 정량화됩니다. 오직 UEA-I 양성, 인간 유래 혈관 채널만이 정량화에 고려된다.

1. 20배율(고전력장[HPF])에서 밝은 필드 현미경으로 병변 섹션당 4~5개의 이미지를 가져가라. 겹치지 않도록 병변 섹션 내의 X-평면 패턴으로 HPF 이미지를 가져가라(그림 1F-H). 촬영한 이미지에 배율 막대를 포함합니다.
2. 이미지J(파일 및 열기)에서 HPF 이미지를 엽니다. 배율 막대의 픽셀을 다음과 같이 보정합니다. 직선 도구를 사용하여 스케일 막대를 통과합니다. 측정된 픽셀을 mm로 변환하려면 분석 및 설정 축척을 클릭합니다.
3. 분석 및 gt를 클릭하고 측정을 설정하고 영역을 선택하고 오버레이에 추가합니다.
4. 분석 및 측정을 사용하여 HPF의 총 필드 영역을 측정합니다. 9.8 단계에서 정량화를 위해 이 측정값을 저장합니다.
5. 프리핸드 선택 도구를 사용하여 UEA-I⁺ 혈관 채널을 수동으로 간략하게 설명합니다.
   참고: 혈관 채널은 혈액 세포를 포함할 수 있는 Ec - UEA-I⁺ 로 줄 지어있는 모든 영역으로 정의됩니다.
6. 분석 > 측정을 클릭하여 설명된 UEA-I⁺ 혈관 영역(mm 2/HPF)을 정량화합니다.²
7. 하나의 플러그 내에서 가져온 5개의 HPF 모두에 대해 이 측정을 반복합니다.
8. 5개의 HPF의 총 혈관 영역을 평균화합니다. HPF당 얻어진 혈관 면적은 HPF 필드 영역(mm^2,step 9.5)으로 나뉘며 백분율(%)으로 표현된다.
9. 혈관 밀도의 정량화를 위해 각 HPF의 UEA-I⁺ 혈관 채널수를 계산합니다. 혈관 밀도는 HPF 영역(혈관/mm^2)에따라 계산되는 UEA-I⁺ 혈관 채널의 평균 수입니다.

결과

이 프로토콜은 면역 형결성 누드 마우스의 뒤쪽으로 환자 유래 EC의 피하 주입을 기반으로 VM의 뮤린 제노이식 모델을 생성하는 과정을 설명합니다. 내피 세포 식민지는 VM 조직 또는 레시오날 혈액으로부터 초기 세포 격리 후 4 주 이내에 수확 될 수있다(도 1A, B). 주입 다음날, xenograft 병변 플러그는 약 80\u2012100 mm^2의표면적을 커버한다. 우리의 손에, TIE2 / PIK3CA 돌연변이 EC와 병?...

토론

여기서는 VM의 환자 유래 이노이식 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 뮤린 모델은 연구원이 병리학적인 루멘 확대에 대한 깊은 이해를 얻을 수 있게 해주는 우수한 시스템을 제시하며 VM 치료를 위한 보다 효과적이고 표적화된 치료법을 개발하는 데 중요한 역할을 할 것입니다. 이것은 모세관 림프 정맥 기형^(16)과같은 혈관 이상의 그밖 모형을 조사하기 위하여 쉽게 적응될...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males	Envigo	069(nu)/070(nu/+)	Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)	Vector Laboratories	B-1065	Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM)	Thermo Fisher	974106	Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA)	BSA	A7906-50MG	Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma	C7902-500G	Cell culture
Caliper	Electron Microscopy Sciences	50996491	Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)	Life Technologies	11155D	EC separation
Cell strainer (100 μM)	Greiner	542000	Cell culture
Collagenase A	Roche	10103578001	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL)	Greiner	07 000 241	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL)	Greiner	07 000 239	Cell culture
Coplin staining jar	Ted Pella	21029	Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm)	Fisher Scientific	12545E	Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)	Vector Laboratories	SK-4105	Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-027-CV	Cell culture
DynaMag-2	Life Technologies	12321D	EC separation
Ear punch	VWR	10806-286	Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0)	Life Technologies	15575-020	Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)	Lonza	CC-3162	Cell culture
Eosin Y (alcohol-based)	Thermo Scientific	71211	Histological anlaysis
Ethanol	Decon Labs	2716	Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone	GE Healthcare	SH30910.03	Cell culture
Filter tip 1,250 μL	MidSci	AV1250-H	Multiple steps
Filter tip 20 μL	VWR	10017-064	Multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	10017-068	Multiple steps
Formalin buffered solution (10%)	Sigma	F04586	Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable)	SKC FILMS	DHCN015	Cell culture
Hematoxylin	Vector Hematoxylin	H-3401	Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)	Sigma	FC010-10MG	Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)	Sigma	H1009	Histological anlaysis
ImageJ Software			Analysis
Isoflurane, USP	Akorn Animal Health	59399-106-01	Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma	M1880-500G	Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)	Corning	356237	Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	VWR	87003-294	EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)	Fisher Scientific	1255015-CS	Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles	Becton Dickinson (BD)	BD305115	Subcutaneous injection
Normal horse serum	Vector Laboratories	S-2000	Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)	Corning	30-009-CI	Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount)	Vector Laboratories	H-5000	Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain	Thomas Scientific	3431F55	EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994	Cell culture
Scale	VWR	65500-202	Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml)	VWR	89130-898	Cell culture
Serological pipettes (5ml)	VWR	89130-896	Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma	223530	Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC	Vector Laboratories	SA-5004	Cell culture
Syringe (60ml)	BD Biosciences	309653	Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM)	Corning	431219	Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock)	Becton Dickinson (BD)	BD-309628	Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)	Greiner	664160	Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm)	Greiner	639160	Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm	Eppendorf	30701119	Cell culture
Tris-base (Trizma base)	Sigma	T6066	Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %)	Life Technologies	15250061	Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)	Corning	25-052-Cl	Cell culture
Tween-20	Biorad	170-6531	Histological anlaysis
Wheaton bottle	VWR	16159-798	Cell culture
Xylenes	Fisher Scientific	X3P-1GAL	Histological anlaysis