מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי

Summary

אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מודל קסנוגרפט murine של מום ורדי. מודל זה מבוסס על הזרקה תת עורית של תאים אנדותל נגזר המטופל המכיל HYPER-activating TIE2 ו / או מוטציות גן PIK3CA. נגעים Xenograft מקרוב לסיכום התכונות ההיסטופתולוגיות של רקמת חולה VM.

Abstract

מום ורידים (VM) היא אנומליה כלי דם הנובעת מהתפתחות לקויה של הרשת ורידים וכתוצאה מכך ורידים מורחבים ולעתים קרובות תפקודיים. מטרת מאמר זה היא לתאר בקפידה את הקמתו של מודל xenograft murine המחקה VM אנושי והוא מסוגל לשקף הטרוגניות המטופל. Hyper-activating לא בירושה (סומטי) TEK (TIE2) ומוטציות PIK3CA בתאי אנדותל (EC) זוהו כנהגים העיקריים של הגדלת כלי פתולוגיים ב VM. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד, הטיהור וההרחבה של EC הנגזר ממטופל המביעים מוטציה TIE2 ו/או PIK3CA. EC אלה מוזרקים תת עורית לתוך החלק האחורי של עכברים אתיים immunodeficient כדי ליצור ערוצים כלי דם אקטוטיים. נגעים שנוצרו עם TIE2 או PIK3CA-מוטציה EC הם כלי דם באופן ניכר בתוך 7\u20129 ימים של הזרקה ולתווך מחדש תכונות היסטופתולוגיות של רקמת חולה VM. מודל VM xenograft זה מספק פלטפורמה אמינה לחקור את המנגנונים הסלולריים והמולקולריים המניעים היווצרות VM והרחבה. בנוסף, מודל זה יהיה אינסטרומנטלי עבור מחקרי תרגום בדיקת היעילות של מועמדים לסמים רומן במניעת הגדלת כלי חריג לראות VM האנושי.

Introduction

פגמים בהתפתחות כלי הדם הם הגורם הבסיסי למחלות רבות, כולל מום ורדי (VM). VM היא מחלה מולדת המאופיינת מורפוגנזה חריגה והרחבה של ורידים¹. מחקרים חשובים על רקמת VM ותאי אנדותל (EC) זיהו מוטציות רווח-של-תפקוד בשני גנים: TEK, אשר מקודד את קולטן קינאז טירוסין TIE2, ו PIK3CA, אשר מקודד p110α (תת-יחידת קטליטית) איזופורם של PI3-kinase (PI3K)^2,,3,,4,,5. מוטציות סומטיות אלה לגרום היפר-הפעלה עצמאית ליגנד של מסלולי איתות אנגיוגני/צמיחה מפתח, כולל PI3K / AKT, וכתוצאה מכך ורידים אקתטיים^{מורחבים 3}. למרות תגליות גנטיות חשובות אלה, המנגנונים הסלולריים והמולקולריים הבאים המפעילים אנגיוגנזה חריגה והיווצרות של ערוצי כלי דם מוגדלים עדיין אינם מובנים במלואם.

במהלך אנגיוגנזה רגילה ופתולוגית, כלי חדשים צומחים מרשת כלי דם קיימת מראש ו-EC עוברים רצף של תהליכים תאיים חשובים כולל התפשטות, הגירה, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית (ECM) והווצרות לומן⁶. שניים ותלת מימדיים (2D/3D) בתרבויות המבחנה של EC הם כלים חשובים לחקור כל אחד ממאפייני הסלולר האלה בנפרד. אף על פי כן, יש דרישה ברורה עבור מודל העכבר recapitulating הרחבת כלי פתולוגי בתוך microenvironment המארח תוך מתן פלטפורמה יעילה להערכה פרה-קלינית של תרופות ממוקדות למחקר תרגום.

עד כה, מודל murine transgenic של VM המשויך TIE2 רווח של פונקציה מוטציות לא דווח. מודלים הנוכחיים עכבר VM transgenic להסתמך על הביטוי בכל מקום או רקמה מוגבלת של המוטציה הפעלת PIK3CA p.H1047R^3,5. בעלי חיים טרנסגנים אלה מספקים תובנה משמעותית על כל הגוף או רקמה ספציפית השפעות של מוטציה PIK3CA נקודה חמה זו. המגבלה של מודלים אלה היא היווצרות של רשת כלי דם פתולוגית מאוד וכתוצאה מכך קטלניות מוקדמת. לפיכך, מודלים אלה של העכבר אינם משקפים באופן מלא את המופע הספורדי של אירועי מוטציה ואופי מקומי של פתולוגיית VM.

להיפך, מודלים xenograft נגזר המטופל מבוססים על השתלה או הזרקה של רקמה פתולוגית או תאים נגזר מחולים לעכברים immunodeficient⁷. מודלים Xenograft הם כלי רב עוצמה כדי להרחיב את הידע על התפתחות מחלות וגילוי של סוכנים טיפוליים רומן⁸. בנוסף, שימוש בתאים הנגזרים ממטופל מאפשר למדענים להפיק מחדש הטרוגניות מוטציה כדי לחקור את הספקטרום של פנוטיפים המטופל.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שבו מטופל נגזר VM EC אשר מבטאים צורה מוטציה פעילה באופן זמני של TIE2 ו / או PIK3CA מוזרקים תת עורית בחלק האחורי של עכברים עירום אתימי. תאי כלי דם מוזרקים מושעים במסגרת ECM על מנת לקדם אנגיוגנזה כמתואר בדגמים xenograft כלי^{דם קודמים 9,10,11}. אלה VM EC לעבור מורפוגנזה משמעותית וליצור מוגדל, כלי פתולוגיים סוטה בהיעדר תאים תומכים. מודל xenograft המתואר של VM מספק פלטפורמה יעילה להערכה פרה-קולינית של תרופות ממוקדות על יכולתם לעכב התרחבות בלתי מבוקרת של לומן.

Protocol

דגימות רקמת החולה התקבלו מהמשתתפים לאחר הסכמה מדעת מאיסוף ומאגר של דגימות רקמה ונתונים מחולים עם גידולים וחריגות כלי דם תחת ועדת ביקורת מוסדית מאושרת (IRB) על פי מדיניות מוסדית במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי (CCHMC), סרטן ומחלות דם המכון ועם אישור הוועדה לחקירה קלינית. כל ההליכים של בעלי החיים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבעלי חיים של CCHMC.

1. הכנת חומרים ופתרונות מלאי

1. הכנת מדיום גדילה מלא של תאים אנדותל (EGM)
   1. תוספת אנדותל בזל בינוני (EBM) עם גורמי גדילה הבאים הנוכחיים ערכה (ראה טבלת חומרים):גורם גדילה פיברובלסט אנושי-בטא (hFGF-β), גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), ארוך Arg3 אינסולין דמוי גורם גדילה- I (R³-IGF-I), חומצה אסקורבית, גורם גדילה אפידרמיס (EGF), ג'נמיצין גופרתי ואמפוטריסין-B, ו הפרין. הוסף 1% פניצילין/ סטרפטומיצין / L-גלוטמין (PSG) פתרון ו 20% סרום חזיר עוברי (FBS).
      הערה: איננו ממליצים להוסיף הידרוקורטיזון.
   2. סטרילי לסנן את הפתרון תחת מכסה המנוע זרימה למינאר דרך מסנן בקבוק 0.2 μm העליון לתוך בקבוק זכוכית autoclaved ומדיה aliquot לתוך 50 mL צינורות חרס ולאחסן ב 4 ° C עד שבוע או ב -20 ° C עד שנה אחת.
2. הכנת פתרון מניות של קולגנאז
   1. הכן 50 מ"ג/מ"ל קולגנאז פתרון מניות ב-1x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS).
   2. סטרילי לסנן את הפתרון תחת מכסה המנוע זרימה למינאר עם 0.2 μm מסנן ומזרק, ולאחסן 100 μL aliquots ב -20 °C.
3. הכנת אוסף רקמות בינוני (מאגר A)
   1. הכן^{Ca 2+}/Mg^{2+ פתרון} מניות על ידי הוספת 0.927 גרם של סידן כלוריד דיהידרט (CaCl₂.2H₂O) ו 1 גרם של מגנזיום גופרתי heptahydrate (MgSO_4.7H2O) כדי 500 מ"ל של מים מזוקקים. סטרילי לסנן את הפתרון באמצעות מסנן בקבוק 0.2 μm העליון לתוך בקבוק זכוכית autoclaved ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
   2. תוספת של Dulbecco שונה נשר בינוני (DMEM) עם 10% Ca²⁺/ מ"ג^{2+ פתרון} ו 2% FBS.
   3. סטרילי לסנן את הפתרון תחת מכסה המנוע זרימה למינאר עם 0.2 μm מסנן מזרק ולאחסן aliquots של 5 מ"ל ב -20 °C.
4. ציפוי פיברונקטין של צלחות תרבות רקמות
   1. הכן את מאגר הציפוי (מאגר ב') על-ידי המסת 5.3 גרם נתרן קרבונט (Na₂CO₃; 0.1 M) ב-500 מ"ל של מים מנומנמים. כוונן את ה-pH של המאגר ל- 9.4 באמצעות חומצה הידרוכלורית של 1 M (HCl). לסנן מתחת למכסה המנוע לזרום למינאר דרך מסנן בקבוק 0.2 μm העליון לתוך בקבוק זכוכית autoclaved ולאחסן ב RT.
   2. לציפוי, פיפט 2 מ"ל/5 מ"ל/10 מ"ל של מאגר B לכל 60 מ"מ/100 מ"מ/145 מ"מ צלחת תרבות רקמות, בהתאמה. מוסיפים 1 μg/cm^{2 של} תמיסת חלבון מטוהרת פלזמה אנושית ולהפיץ בעדינות את הנוזל על הצלחת.
   3. דגירה ב 37 °C, 5% CO_{2 במשך} 20 דקות.
   4. שאפף את Buffer B ושטוף את הצלחת עם PBS לפני התאים הקולטים.

2. בידוד של תאי אנדותל מרקמות חולה VM

1. בידוד של EC מרקמות VM מוצקות
   הערה: רקמת VM נותתת על ידי ניתוח^{debulking 12,13} תחת פרוטוקול IRB מאושר.
   1. לשטוף רקמת VM (משקל מדגם רקמה בדרך כלל נע בין 0.5 g ו 1.5 גרם) ב 5% PSG ב PBS.
   2. מעבירים רקמה לצלחת של 100 מ"מ של תרבות תאים, מטחון דגימת רקמה לחתיכות קטנות באמצעות כלי ניתוח סטריליים, והעברתו לצינור 50 מ"ל.
   3. להוסיף 100 μL של קולגן פתרון מניות 5 מ"ל של מאגר A עבור ריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל, ואז להוסיף את זה לרקמה ולעכל את הרקמה טחון ב 37 ° C במשך 30 דקות תוך ניעור תוכן כל 5 דקות.
   4. טחון בזהירות את הרקמה המעכלת ב RT באמצעות מטחנת עלי 6 מ"מ, משטח חלק בתוך צינור חסוני 50 מ"ל.
   5. המשך לטחון בזהירות רקמה מעוכלת באמצעות עלי תוך הוספת 5 מ"ל של PBS קר בתוספת 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA) ו 2% PSG. חזור על שלב זה ארבע פעמים.
   6. לסנן את הפתרון דרך מסננת תא 100 μm לתוך צינור חסין 50 מ"ל כדי להסיר שברי רקמות.
   7. מתלה תא צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 400 x g ב- RT.
2. בידוד של VM EC מדם נגעי המתקבל מחולים
   1. להשיג דם נגע VM אנושי מsclerotherapy תחת פרוטוקול IRB אישר.
   2. לדלל את הדם נגע (נפח מדגם בדרך כלל נע בין 0.5 מ"ל ו 5 מ"ל) ב PBS לנפח סופי של 40 מ"ל.
   3. מתלה תא צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 x g ב- RT.
3. ציפוי תא ראשוני
   1. בטל את supernatant ופנס מחדש את הכדור של תא יחיד ב- 1 מ"ל של EGM.
   2. הוסף 9 מ"ל של EGM מלא על פיברונטין מצופה (1 μg / cm²) 100 מ"מ צלחות זרע 1 מ"ל של מתלה תא.
   3. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס בלח 5% CO_{2 אטמוספרה.}
   4. כל יומיים להסיר 2 מ"ל של מדיה ולהוסיף 2 מ"ל של FBS מסונן סטרילי.
   5. ברגע שתרביות תאים מגיעות לתרביות של 40\u201250% לשנות את המדיום כדי להשלים EGM. זה בדרך כלל לוקח בין 2\u20123 שבועות עבור התאים כדי להגיע confluency זה.
   6. שים לב מדי יום למראה מושבות EC. הם יכולים להיות מזוהים על ידי מורפולוגיה טיפוסית שלהם "כמו מרוצף"(איור 1A). בין 3\u20125 מושבות EC מופיעות בכל מדגם.
   7. לשנות את המדיום כל יומיים לעוד 5\u20127 ימים עד מושבות EC בודדים להתחיל לגעת אחד בשני.
4. בידוד ידני של מושבות EC בודדות
   1. כדי לקצור מושבות EC, לשטוף את הצלחת עם 5 מ"ל של PBS ושאף באופן ידני עם פיפטה סרולוגית.
   2. קח את הצלחת למיקרוסקופ והקיף את המיקומים של מושבות EC מרובות באמצעות עט סימון הן על המכסה והן על התחתון לפני החזרתו למכסה המנוע לזרום למינאר.
   3. נתק מושבות EC על ידי pipetting 50 μL של 0.05% פתרון טריפסין-EDTA על האזורים המסומנים.
   4. באמצעות מגרד תאים קטן או קצה פיפטה, בעדינות לגרד תאים מהצלחת.
   5. הטה את הלוח לקצה הקרוב ביותר, ושטוף עם 1 מ"ל EGM לכל אזור מסומן ולאסוף תאים.
   6. ספור את מספר התאים באמצעות מד-ממוציט או מונה תא אוטומטי.
   7. לוח מושבות EC שנאספו בצפיפות של 1 x 10^{4 תאים} / ס"מ² על פיברונטין מצופה (1 μg / cm²) מנות תרבות תא המכיל EGM טרי. למחרת, לשנות מדיום כדי להשלים EGM.
   8. שנה את המדיום כדי להשלים EGM כל יומיים במשך 2\u20123 שבועות עד תאים להגיע 80% confluency.
   9. Trypsinize EC עם 2 מ"ל של טרום חימום 0.05% טריפסין-EDTA לכל 100 מ"מ צלחת ב 37 ° C במשך 2 דקות ולנטרל טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של EGM.
   10. לאסוף את מתלה התא לתוך צינור אחד 15 מ"ל חסינה צנטריפוגה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות. לשאוף את תאי supernatant ולתו מחדש ב 2 מ"ל של EGM.
   11. ספור את מספר התאים באמצעות מד-ממוציט או מונה תא אוטומטי. מספרי תאים טיפוסיים שהתקבלו הם 1 x 10^{6 תאים} לכל לוח תרבות תא 60 מ"מ או 2 x 10^{6 תאים} לכל 100 מ"מ צלחת תרבות רקמות.
   12. גלול התאים על ידי צנטריפוגציה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות ולאסוף את supernatant. המשך לשלב 3.2.1.

3. בחירת תאים אנדותל והרחבה

1. הכנת חרוזים מגנטיים אנטי-CD31
   1. מערבולת הבקבוקון המכיל את החרוזים המגנטיים נגד CD31-התווסת עבור 30 s. מספר החרוזים הנדרשים הוא 8 x 10⁶ חרוזים/2 x 10⁶ תאים.
   2. לשטוף את הכמות הרצויה של חרוזים מגנטיים נגד CD31-conjugated עם 1 מ"ל של פתרון כביסה המכיל 0.1% BSA ב PBS בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
   3. מניחים את צינור המיקרוצנטריפוגה במגנט בידוד תאים למשך דקה אחת.
   4. שאף את הסופרנטנט וחזור על שלב הכביסה.
2. טיהור וציפוי של תאים אנדותל
   1. גלולת תא Resspend שהושגה ב 2.4.12 ב 500 μL של פתרון כביסה המכיל 0.1% BSA ב PBS.
   2. הוסף תמיסת תאים לצינור microcentrifuge המכיל חרוזים מגנטיים וssuspend ביסודיות.
   3. דגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C עם הטיה עדינה.
   4. להוסיף 500 μL של 0.1% BSA ב PBS ולערבב היטב.
   5. מניחים את הצינור על מגנט בידוד תא במשך 1 דקות.
   6. שאפף בעדינות את כל הנוזל, המכיל את השבר השלילי של תאים CD31 מבלי לגעת בחרוזים.
   7. יש לשטוף את גלולת החרוז המכילה את שבר התא ה-CD31 החיובי עם 1 מ"ל של 0.1% BSA ב-PBS וחזר על ההפרדה המגנטית.
   8. שלב כביסה והפרדה מגנטית חוזרים למשך 3 פעמים לפחות כדי לטהר שבר תא CD31 חיובי.
   9. תוסתה מחדש תאים אנדותל מטוהרים לתוך צינור חרוכי 15 מ"ל וספין למטה במשך 5 דקות ב 400 x g ב RT.
   10. הסר כדורי תא supernatant וssspend ב 1 מ"ל של EGM.
   11. הוסף 9 מ"ל של EGM מלא על פיברונטין מצופה (1 μg / cm²) 100 מ"מ צלחות זרע 1 מ"ל של מתלה תא. שים לב כי כמה חרוזים מגנטיים עדיין מחוברים לתאים בשלב זריעה ראשוני זה. רוב החרוזים לשטוף במהלך הרחבת התא, אבל מספר קטן של חרוזים עשויים להימשך במעברים מוקדמים.
   12. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס בלח 5% CO_{2 אטמוספרה.}
   13. לשנות את המדיום כל יומיים עד תאים להגיע 80% confluency(איור 1B).
3. הרחבת תאים אנדותל
   1. ברגע שהתאים מגיעים ל-80% confluency, נתקו עם 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לכל 100 מ"מ ב-37°C למשך 2 דקות.
   2. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של EGM ולאסוף תאים לתוך צינור חסין אחד 15 מ"ל.
   3. צנטריפוגה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות.
   4. לשאוף את supernatant, resuspend תאים ב 2 מ"ל של EGM, ולספור את מספר התאים עם hemocytometer או על ידי ספירת תאים אוטומטית.
   5. תאי זרע בצפיפות של 1 x 10⁴ תאים/cm² לתוך 145 מ"מ פיברונקטין מצופה (1 μg / cm²) צלחות תרבות רקמות.
   6. המשך למעבר לתאים עד למספר התא הרצוי. קח בחשבון כי לוח תרבות רקמות confluent 145 מ"מ מכיל כ 8\u20129 x^{10 6} תאים ומספר התאים הדרושים הוא 2.5 x 10 6 תאים לכל^הזרקה. רק תאים בין מעבר 3 ו-8 צריכים להיחשב לשנאת זרים.

4. פרוטוקול קסנוגרפט נגזר ממטופל VM

הערה: בפרוטוקול זה אנו משתמשים 5\u20126 בן שבוע, immunodeficient זכר, עכברים עירום אתימי Foxn1^nu.

כל ההליכים בבעלי חיים חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC).

1. הכנת חומרים ביום שלפני ההזרקה
   1. מזרקים לפני צינה, מחטים, וטיפים pipet ב -20 מעלות C מקפיא לילה.
   2. להפשיר לאט את קרום המרתף מטריצה חוץ תאית (BMEM) לילה על דלי קרח ממוקם ב 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע צמיגות מוגברת של הג'ל.
2. הכנת מתלה תא להזרקה
   1. טריפסיניז EC עם 5 מ"ל של טרום חימום 0.05% טריפסין-EDTA לכל 145 מ"מ צלחת ב 37 ° C במשך 2 דקות.
   2. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של EGM ולאסוף תאים לתוך צינור אחד 15 מ"ל חסין.
   3. צנטריפוגה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות.
   4. לשאוף את supernatant, להשתמש מחדש תאים ב 3 מ"ל של EGM, ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטי.
   5. קבע את המספר הכולל של תאים הדרושים עבור כל הזריקות המתוכננות.
      הערה: מספר התאים המומלץ הוא 2.5 x 10^{6 תאים} לכל הזרקה. סה"כ 2 זריקות מבוצעות בדרך כלל בכל עכבר עבור כפילויות טכניות. יש צורך לחשב עודף של 10% ממספר התא כדי לתת דין וחשבון על אובדן במהלך ההעברה למזרק.
   6. העבר את אמצעי האחסון המכיל את מספר התא המחושב לתוך צינור חסונים חדש 50 מ"ל ותאי גלולה על ידי צנטריפוגציה ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות.
   7. לשאוף את supernatant, עוזב נפח קטן (על 50\u201270 μL) כדי לשחרר את הכדור.
3. הכנת מזרק
   1. לחשב נפח עודף של 20 μL / הזרקה חשבון על אובדן במהלך ההעברה למזרק. תולה מחדש את כדור התא עם 220 μL של BMEM לכל הזרקה על קרח. הנפח המוזרק של מתלה התא יהיה 200 μL לכל נגע.
   2. מערבבים את מתלי התא ביסודיות על קרח כדי להשיג מתלה תאים הומוגני ולהימנע מיצירת בועות.
   3. באמצעות צינור 1 מ"ל ומזרק 1 מ"ל, בו זמנית pipet תערובת BMEM-תא לתוך פתיחת מזרק על ידי כוח יניקה תוך משיכת בוכנה של מזרק.
   4. Luer לנעול מחט סטרילית 26G x 5/8 אינץ' למזרק ולשמור מזרקים מוכנים שטוח על קרח לפני ההזרקה.
4. הזרקה תת עורית לתוך העכבר
   1. להדהים את העכברים עם 5% תערובת isoflurane / חמצן בקצב זרימה של 1 L/min באמצעות מאדה isoflurane. להבטיח הסתמה נכונה של בעלי חיים (למשל, חוסר מגיבה לצביטות בהונות). לשמור על הרדמה באמצעות ניהול רציף של 1.5% isoflurane / חמצן מועבר באמצעות קונוס האף.
   2. מניחים עכברים על הבטן שלהם, חושפים את האזור האחורי שבו תתרחש השתלה ולחטא את אזור ההזרקה עם 70% אתנול.
   3. מגלגלים בעדינות את המזרק המוכן כדי לתוסת מחדש את כל התאים המיושבים. בועות החלק אל קצה המחט של המזרק ולגרש נפח קטן של מתלה התא כדי להבטיח את הסרת כל הבועות.
      הערה: ניתן לבצע שתי זריקות עבור כל עכבר – בצד שמאל וימין של העכבר בחזרה.
   4. צבוט וליצור מבנה 'כמו אוהל' באמצעות האגודל והאצבע המורה ולהכניס את המחט תת עורית ממש מתחת לעור. ודא כי המחט היא רק עור עמוק על ידי שחרור עור צבוט כדי למנוע הזרקה לתוך רקמת שריר.
   5. החזקת מחט בזווית 45° בזהירות להזריק 200 μL של מתלה התא כדי ליצור מסה כדורית קטנה(איור 1C).
   6. להקליט משקל העכבר עם קנה מידה, לתייג את האוזן העכבר, ולחזור לכלוב.
   7. עקוב אחר עכברים בעקבות ההסתמה כדי להבטיח שהם יחזרו לפעילות רגילה.
5. ניטור צמיחת נגע
   1. באמצעות קליפר, למדוד את האורך והרוחב של כל תקע(איור 1D).
   2. מדידות מסמך כל יומיים עד לאיסוף הנגעים.

5. איסוף ועיבוד רקמות

1. המתת סד לעכברים 9 ימים לאחר ההשתלה בתא CO₂ ולבדוק סימנים חיוניים כדי לאשר את המוות. לבצע נקע צוואר הרחם על העכברים כשיטה משנית כדי להמתת סד העכבר.
2. לקצור את נגע xenograft / תקע מהאגף של העכבר על ידי ניתוח באמצעות מגרסות כירורגיות ומספריים.
   הערה: על מנת למנוע קרע של כלי הדם המלאים בדם בתוך התקע, חשוב להימנע מלגעת בתקע הנגע עם כלי קרע ולהשאיר רקמה מוגזמת סביב כגון העור המחובר לתקע.
3. לטבול את הנגע החתך בPBS לשטוף.
4. הגדר שלב מצלמה עם מצלמה. ישר תקעים ללוח חיתוך עם סרגל. לצלם תמונה של כל התקעים כדי להקליט כלי דם ברוטו של נגעים(איור 1E).
5. תקן תקעים על ידי שקוע ב 10% פורמלין לילה ב RT.
6. לשטוף את התקעים PBS למחרת ולהעביר אותם 70% אתנול.
7. תקעי נגע תהליך להטביעת פרפין (ליבת פתולוגיה).

6. קטע נגע

1. השתמש microtome כדי לחתוך 5 μm מקטעים מן נגעים murine שנאספו על שקופיות טעונות חיובית.
   הערה: לניתוח הבא, מקטעים במרכז התקע (כ 50\u201270 μm לתוך הרקמה) הם בעלי חשיבות.
2. ממיסים פרפין ב-60 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני הכתמים.
3. De-paraffinize ו מחדש הידרציה רקמות באופן רציף תחת מכסה המנוע זרימת אדים כימיים. לכן, דגירה להחליק xylene במשך 10 דקות, 100% אתנול (EtOH) עבור 5 דקות, 90% EtOH עבור 3 דקות, ו 80% EtOH עבור 3 דקות.
4. לשטוף את המגלשה במים deionized במשך 5 דקות.

7. המטוקסילין ואאוסין (H&E)

1. מדגם בהמטוקסילין למשך 2 דקות.
2. מניחים מגלשות בצנצנת מכתימים וצורפי בכיור על ידי זרם קבוע של מי ברז עד שהמים צלולים.
3. De-hydrate שקופיות על ידי דגירה רקמה רצפת ב 70% EtOH עבור 1 דקות, 80% EtOH עבור 1 דקות, 90% EtOH עבור 1 דקות, 100% EtOH עבור 1 דקות, ו טרי 100% EtOH עבור 1 דקות.
4. כתמים באוסין Y עבור 30 s.
5. יש לשטוף ב-100% ETOH טריים עד שהפתרון ברור.
6. דגירה שקופית קסילן במשך 2 דקות. תן לשקופיות להתייבש במשך 5\u201210 דקות מתחת למכסה המנוע של האדים.
7. לחלק טיפה של קבוע, לא מים הרכבה בינוני מעל מקטעים xenografts וכיסוי מקום על גבי.
8. אפשר לשקופיות להתייבש במהלך הלילה לפני ההדמיה.

8. אימונוהיסטוכימיה

1. הכן מאגר אחזור אנטיגן (Tris-EDTA) על-ידי שקילת 0.6 גר' של בסיס Tris ו-1 מ"ל של 0.5 M EDTA עד 500 מ"ל של מים מצועצים. כוונן את ה-pH ל- 9.0 באמצעות 1 M HCl. הוסף 250 μL של Tween-20.
2. דגירה de-paraffinized רקמה שקופיות (כפי שהושג בשלב 6.2\u20126.3) בבקת עם מאגר אחזור אנטיגן, ערבוב על בלוק חימום, במשך 20 דקות ב 95 °C.
3. הסר את החתמת מבלוק החימום, אפשר לפתרון להתקרר ל-35°C ולאחר מכן לשטוף ב-PBS למשך 3 דקות.
4. לחסום רקמות מקטעים ב 5% סרום סוס רגיל PBS במשך 30 דקות ב RT.
5. להכין פתרון עבודה Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) ביוטינלציה על ידי דילול 20 μg/mL של UEA-I ביוטינילציה בסרום סוסים רגיל 5% PBS.
6. Pipet 50\u2012100 μL של UEA-I עובד פתרון לכל סעיף דגירה במשך 1 שעה ב RT בתא לחות.
7. לשטוף שקופיות פעמיים ב PBS במשך 3 דקות.
8. מרווה מקטעים שקופיות ב 3% מי חמצן במשך 5 דקות ב RT.
9. לשטוף שקופיות פעמיים ב PBS במשך 3 דקות.
10. להכין 5 μg /mL של סטרפטאבידין חזרת peroxidase-conjugated ב 5% סרום סוס רגיל PBS.
11. Pipet 50\u2012100 μL על כל שקופית רקמה דגירה במשך 1 שעה ב RT בתא לחות.
12. לשטוף שקופיות פעמיים ב PBS במשך 3 דקות.
13. להכין 3,3'Diaminobenzidine (DAB) פתרון על פי הוראות היצרן ולהוסיף 50\u2012100 μL לכל סעיף.
14. מקטעים דגירה עבור 10\u201215 דקות, בדיקה וניטור לפיתוח של כתם כל 2\u20125 דקות.
15. לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 3 דקות.
16. מוסיפים טיפת המטוקסילין וגרה במשך 3 דקות.
17. מניחים מגלשות בצנצנת מכתימים וצורפי בכיור על ידי זרם קבוע של מי ברז עד שהמים צלולים.
18. שקופית דגירה רצף ב 80% EtOH עבור 1 דקות, 90% EtOH עבור 1 דקות, 100% EtOH עבור 1 דקות, ו xylene במשך 2 דקות.
19. תן לשקופיות להתייבש במשך 5\u201210 דקות מתחת למכסה המנוע של האדים.
20. לחלק טיפה של קבוע, לא מים הרכבה בינוני מעל מקטעים xenografts וכיסוי מקום על גבי.
21. אפשר לשקופיות להתייבש במהלך הלילה לפני ההדמיה.

9. ניתוח ערוצי כלי דם הנגזרים על ידי בני אדם

הערה: כלי דם של נגעים VM הוא מכמת על ידי מדידת אזור כלי הדם וצפיפות כלי דם. רק איחוד האירופי-I חיובי, ערוצים נגזרים על ידי בני אדם נשקלת לכמת.

1. לצלם ארבע עד חמש תמונות לכל קטע נגע עם מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של פי 20 (שדות הספק גבוה [HPF]). לצלם תמונות HPF בתבנית x-plane בתוך סעיף הנגע כדי למנוע חפיפה(איור 1F-H). כלול סרגל קנה מידה בתמונות שצולמו.
2. פתח את תמונות HPF בתמונה J (קובץ > פתח). כיול הפיקסלים של סרגל קנה המידה באופן הבא. השתמש בכלי קו ישר ולעבור על סרגל קנה המידה. כדי להמיר את הפיקסלים הנמדדים למ"מ לחץ על נתח > הגדר קנה מידה.
3. לחץ על נתח > הגדר מידות ובחר אזור והוסף לתיך-על.
4. מדוד את שטח השדה הכולל ב- HPF באמצעות ניתוח > מדידה. שמור מדידה זו לכמת בשלב 9.8.
5. באמצעות הכלי בחירות ביד חופשית, מתאר באופן ידני UEA-I⁺ ערוצי כלי דם.
   הערה: ערוץ כלי דם מוגדר כאזור המסומן ב- UEA-I^{+ -} EC שעשוי להכיל תאי דם.
6. לחץ על נתח > למדוד כדי לכמת את UEA-I⁺ אזור כלי דם (מ"מ²/HPF).
7. חזור על מדידה זו עבור כל חמשת HPF שצולמו בתקע אחד.
8. ממוצע שטח כלי הדם הכולל של כל חמשת HPF. אזור כלי הדם שהושג לכל HPF מחולק לאחר מכן על-ידי אזור השדה של HPF (במ"מ², שלב 9.5) ומתבטא באחוז (%).
9. לכמת את צפיפות כלי הדם, ספרו את מספר ערוצי UEA-I⁺ כלי דם של כל HPF שנלקחו. צפיפות כלי הדם היא המספר הממוצע של ערוצי UEA-I⁺ כלי דם נספרו לפי אזור HPF (כלי שיט/מ"מ^2).

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את התהליך של יצירת מודל xenograft murine של VM בהתבסס על הזרקה תת עורית של EC נגזר החולה לתוך הגב של עכברים עירומים immunodeficient. מושבות תא אנדותל ניתן לקצור בתוך 4 שבועות לאחר בידוד תאים ראשוניים רקמת VM או דם נגע(איור 1A, B). יום לאחר ההזרקה, תקע הנגע xenograft מכסה שטח פנים של כ 80\u2012100 מ"...

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל של VM. מודל murine זה מציג מערכת מצוינת המאפשרת לחוקרים להשיג הבנה עמוקה יותר של הגדלת לומן פתולוגית ויהיה אינסטרומנטלי בפיתוח טיפולים יעילים יותר ממוקדים לטיפול VM. זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לחקור סוגים אחרים של חריגות כלי דם כגון מום ו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males	Envigo	069(nu)/070(nu/+)	Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)	Vector Laboratories	B-1065	Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM)	Thermo Fisher	974106	Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA)	BSA	A7906-50MG	Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma	C7902-500G	Cell culture
Caliper	Electron Microscopy Sciences	50996491	Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)	Life Technologies	11155D	EC separation
Cell strainer (100 μM)	Greiner	542000	Cell culture
Collagenase A	Roche	10103578001	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL)	Greiner	07 000 241	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL)	Greiner	07 000 239	Cell culture
Coplin staining jar	Ted Pella	21029	Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm)	Fisher Scientific	12545E	Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)	Vector Laboratories	SK-4105	Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-027-CV	Cell culture
DynaMag-2	Life Technologies	12321D	EC separation
Ear punch	VWR	10806-286	Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0)	Life Technologies	15575-020	Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)	Lonza	CC-3162	Cell culture
Eosin Y (alcohol-based)	Thermo Scientific	71211	Histological anlaysis
Ethanol	Decon Labs	2716	Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone	GE Healthcare	SH30910.03	Cell culture
Filter tip 1,250 μL	MidSci	AV1250-H	Multiple steps
Filter tip 20 μL	VWR	10017-064	Multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	10017-068	Multiple steps
Formalin buffered solution (10%)	Sigma	F04586	Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable)	SKC FILMS	DHCN015	Cell culture
Hematoxylin	Vector Hematoxylin	H-3401	Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)	Sigma	FC010-10MG	Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)	Sigma	H1009	Histological anlaysis
ImageJ Software			Analysis
Isoflurane, USP	Akorn Animal Health	59399-106-01	Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma	M1880-500G	Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)	Corning	356237	Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	VWR	87003-294	EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)	Fisher Scientific	1255015-CS	Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles	Becton Dickinson (BD)	BD305115	Subcutaneous injection
Normal horse serum	Vector Laboratories	S-2000	Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)	Corning	30-009-CI	Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount)	Vector Laboratories	H-5000	Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain	Thomas Scientific	3431F55	EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994	Cell culture
Scale	VWR	65500-202	Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml)	VWR	89130-898	Cell culture
Serological pipettes (5ml)	VWR	89130-896	Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma	223530	Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC	Vector Laboratories	SA-5004	Cell culture
Syringe (60ml)	BD Biosciences	309653	Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM)	Corning	431219	Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock)	Becton Dickinson (BD)	BD-309628	Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)	Greiner	664160	Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm)	Greiner	639160	Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm	Eppendorf	30701119	Cell culture
Tris-base (Trizma base)	Sigma	T6066	Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %)	Life Technologies	15250061	Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)	Corning	25-052-Cl	Cell culture
Tween-20	Biorad	170-6531	Histological anlaysis
Wheaton bottle	VWR	16159-798	Cell culture
Xylenes	Fisher Scientific	X3P-1GAL	Histological anlaysis