JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف مقايسة Ago2-miRNA-co-IP المصممة لتحديد مجموعة نشطة من miRNAs المحددة التي يسببها TGF-β1 في خلايا CFBE41o- الظهارية للقصبات الهوائية البشرية. يوفر هذا الاختبار معلومات وظيفية حول تجنيد miRNA في مجمع الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي ، والذي تم تحديده كميا بواسطة qRT-PCR باستخدام بادئات miRNA محددة ومجسات التحلل المائي TaqMan.

Abstract

الحمض النووي الريبي الصغير (mi) عبارة عن RNAs قصيرة غير مشفرة تتوسط تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) بواسطة آليات ما بعد النسخ. يتم تجنيد miRNAs محددة في مركب الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي (RISC). Argonaute2 (Ago2) ، وهو مكون أساسي في RISC ، يسهل ارتباط miRNA بالموقع المستهدف على mRNA ، متبوعا بشق miRNA-mRNA المزدوج مع نشاط نوكلياز داخلي. يتم التوسط في RNAi بواسطة مجموعة محددة من miRNAs التي تم تجنيدها في RISC ، وبالتالي يشار إليها باسم التجمع الوظيفي. تتأثر المستويات الخلوية للعديد من miRNAs بعامل النمو المحول للسيتوكين -β1 (TGF-β1). ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عما إذا كان TGF-β1 يؤثر على التجمعات الوظيفية لهذه miRNAs. تم تصميم مقايسة Ago2-miRNA-co-IP ، التي تمت مناقشتها في هذه المخطوطة ، لفحص تأثيرات TGF-β1 على تجنيد miRNAs في RISC ويساعد على تحديد ما إذا كانت التغييرات في مستويات miRNA الخلوية ترتبط بالتغيرات في التجمعات الوظيفية المرتبطة ب RISC. المبادئ العامة للفحص هي كما يلي. يتم تحلل الخلايا المستنبتة المعالجة ب TGF-β1 أو التحكم في السيارة ويتم ترسيب Ago2 الذاتي بجسم مضاد مضاد ل Ago2 ، ويتم عزل miRNAs النشطة المعقدة ب Ago2 باستخدام مجموعة فحص الترسيب المناعي RISC (RIP). يتم تحديد miRNAs من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) باستخدام بادئات حلقية جذعية خاصة ب miRNA أثناء النسخ العكسي ، متبوعة ب PCR باستخدام بادئات أمامية وعكسية خاصة ب miRNA ، ومجسات التحلل المائي TaqMan.

Introduction

تحويل عامل النمو β1 (TGF-β1) هو سيتوكين متعدد الوظائف يمكنه تغيير التعبير عن العديد من الحمض النووي الريبي الصغير (mi)1،2،3. لا يرتبط المستوى الخلوي الكلي ل miRNA معين بإمكاناته المثبطة لأنه يتم دمج جزء معين فقط من miRNA في مركب الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) لأداء تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) 3. ما يصل إلى 10٪ فقط من كل miRNA مرتبط ب RISC ويشارك في RNAi4،5. بعد ذلك ، تتضمن عملية RNAi ربط miRNA المرتبط ب RISC بتسلسل (تسلسلات) التعرف على mRNA المستهدف 6. يتأثر ارتباط RISC بتوافر mRNA المستهدف وتكامل miRNA لموقع الارتباط ، وعادة ما يكون موجودا في منطقة 3 'غير مترجمة (UTR) من mRNA4. تم تصميم مقايسة Argonaute2-miRNA-co-immunoprecipitation (Ago2-miRNA-co-IP) ، الموصوفة في هذه المخطوطة ، لفحص تأثير TGF-β1 على تجنيد miRNAs محددة إلى RISC من خلال اكتشاف الاختلافات في miRNAs المرتبطة ب RISC بعد علاج TGF-β1 ، مقارنة بالتحكم في المركبة. يعد فحص المجموعة الوظيفية المرتبطة ب RISC لميرنا مرنا معينا أكثر إفادة حول تأثيرات miRNA من فحص المستوى الخلوي الكلي ل miRNA. يتكون RISC من بروتينات تقوم بمسح موقع الارتباط على mRNA المستهدف وتشق الإرسال المزدوج miRNA-mRNA. Argonaute2 (Ago2) هو المكون الرئيسي ل RISC. من بين الأشكال الإسوية الخمسة Ago (Ago1-Ago5) ، Ago2 هو الوحيد الذي لديه نشاط نوكلياز داخلي ويشارك في RNAi في الخلايا البشرية7،8،9،10. مركب Ago2-miRNA-RISC هو الوحدة الوظيفية لقمع mRNA بعد النسخ بوساطة miRNA11. يمثل miRNA المرتبط ب Ago2 الحالة الأصلية ل miRNA استجابة للإشارات داخل الخلايا أو خارج الخلية. وبالتالي ، فإن الترسيب المناعي ل Ago2 الداخلي يوفر فرصة ممتازة للكشف عن الجزء النشط المرتبط ب RISC لميرنا معين بالإضافة إلى التقييم الوظيفي لأهدافه. يتفوق هذا الاختبار على سحب الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف الداخلي مع محاكاة miRNA البيوتينيل بسبب الكفاءة غير المتوقعة للامتصاص الخلوي لجزيئات الحمض النووي البيوتينيل وتأثيراتها خارج الهدف.

تم تحسين مقايسة Ago2-miRNA-co-IP ، التي تمت مناقشتها في هذه المخطوطة ، لتحديد تأثيرات TGF-β1 على تجنيد RISC ل miRNAs في الخلايا الظهارية CFBE41o- الظهارية للقصبات الهوائية البشريةالخالدة 3. تم استخدام مكونات مجموعة اختبار RIP لإجراء اختبار Ago2-miRNA-co-IP مع تعديلات في البروتوكول المقدم من الشركة المصنعة. تم استخدام طريقة فصل لعزل الحمض النووي الريبي الصغير والكبير ، حيث تم استخدام الحمض النووي الريبي الصغير لتحديد كمية miRNA بمساعدة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) باستخدام بادئات حلقية جذعية خاصة ب miRNA أثناء النسخ العكسي ، متبوعة ب PCR باستخدام بادئات أمامية وعكسية خاصة ب miRNA ، ومجسات التحلل المائي TaqMan.

Protocol

1. التحضير قبل التجربة

  1. خلايا البذر
    1. قم بإعداد محلول الكولاجين الأول بنسبة 10٪ في الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) وأضف 500 ميكرولتر إلى كل مرشح مزرعة خلية مقاس 24 مم في طبق مكون من 6 آبار. وزعيها لتغطية سطح الفلتر بالكامل عن طريق الدوران برفق باليد. احتضان المرشحات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء التدفق الصفحي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (دقيقة) ، متبوعا بالحضانة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. تحضير وسط زراعة الخلايا (MEM غاز بثاني أكسيد الكربون2 لمدة 20 دقيقة ، 10٪ مصل بقري جنين (FBS) ، 50 وحدة / مل بنسلين ، 50 وحدة / مل ستربتومايسين ، 2 ملي لجلوتامين ، 0.5 ميكروغرام / مل بورومايسين).
    3. أحضر المرشحات المطلية بالكولاجين (الخطوة 1.1.1) من الحاضنة وشفط الكولاجين الزائد. أضف 1.5 مل من وسط زراعة الخلايا (الخطوة 1.1.2) إلى الجانب القاعدي الوحشي و 0.5 مل إلى الجانب القمي (إلى المرشح) في اللوحة المكونة من 6 آبار.
    4. بذرة 1 × 106 من خلايا CFBE41o-12 معلقة في 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلية. قم بتدوير اللوحة برفق يدويا لتوزيع الخلايا بالتساوي على المرشحات واحتضانها في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    5. قم بإزالة الوسط من الجانب القمي بعد يوم واحد من بذر الخلايا واستمر في زراعة الخلايا في واجهة الهواء والسائل (لا يوجد وسيط على الجانب القمي). قم بتغيير الوسط القاعدي الجانبي يوميا وقم بإجراء التجربةفي اليوم الثامن.
  2. علاج الخلايا باستخدام TGF-β1 أو التحكم في السيارة
    1. تحضير وسط زراعة الخلايا الخالي من FBS (وسط خال من FBS): غاز MEM مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 20 دقيقة ، أضف 50 وحدة / مل من البنسلين ، و 50 وحدة / مل من الستربتومايسين ، و 2 ملي مولار L-glutamine وقم بتعقيم الوسط.
    2. تحضير التحكم في السيارة: أضف 20 ميكرولتر من 1 م حمض الهيدروكلوريك و 5 مجم من BSA إلى 5 مل من الماء المقطر المزدوج (4 ملي مولار حمض الهيدروكلوريك مع 1 مجم / مل BSA) للحصول على محلول مخزون 1 نانوغرام / ميكرولتر. قم بتعقيم الخليط قبل الاستخدام.
    3. تحضير محلول TGF-β1: أعد تكوين 1 ميكروغرام من TGF-β1 المجفف بالتجميد في 1 مل من المركبات المفلترة المعقمة (4 ملي مولار حمض الهيدروكلوريك و 1 مجم / مل BSA) للحصول على محلول مخزون 1 نانوغرام / ميكرولتر. Aliquot بكميات صغيرة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    4. قم بإعداد تركيز العمل ل TGF-β1 أو التحكم في السيارة عند 15 نانوغرام/مل من الوسط الخالي من FBS (أضف 15 ميكرولتر من TGF-β1 أو محلول مخزون التحكم في السيارة لكل مل من الوسط الخالي من FBS). قم بشفط وسط زراعة الخلية من الجانب القاعدي الجانبي وأضف TGF-β1 أو التحكم في السيارة الذي يحتوي على وسط قبل 24 ساعة من التجربة.
  3. تحضير المخازن المؤقتة لتحلل الخلايا والترسيب المناعي
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت mi-Lysis (+) لتحلل الخلايا. أضف 1 قرص من مثبطات الإنزيم البروتيني الصغير و 15 ميكرولتر من 1 M DTT لكل 10 مل من الحجم إلى المخزن المؤقت mi-Lysis المتوفرة في مجموعة RIP-Assay.
    2. تحضير المخزن المؤقت mi-Wash (+) لغسل حبات البروتين G agarose. أضف 52.5 ميكرولتر من 1 M DTT لكل 35 مل من الحجم إلى المخزن المؤقت mi-Wash المتوفر في مجموعة RIP-Assay.
  4. اقتران الجسم المضاد ل Ago2 مع حبات البروتين G agarose
    1. اغسل بشكل منفصل 30 ميكرولتر من ملاط حبة البروتين G agarose (50٪) عن طريق تكرار الإجراء التالي ثلاث مرات: أضف 100 ميكرولتر من PBS المثلج ، واخلطه برفق ، وجهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وشفط المادة الطافية بماصة 200 ميكرولتر.
    2. اغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام 100 ميكرولتر من mi-Wash Buffer المثلج (+) ، وشفط المادة الطافية بماصة 200 ميكرولتر وأضف 500 ميكرولتر من mi-Wash Buffer (+) إلى الخرزات واخلطها برفق. احتفظ بالأنابيب على الجليد.
    3. أضف 7.5 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر (IgG2) المضاد للإنسان EIF2C2 (Ago2) (انظر جدول المواد) أو الفأر غير المحدد IgG2 (التحكم السلبي) إلى ملاط حبات البروتين G في mi-Wash Buffer (+).
    4. احتضان الأنابيب طوال الليل ، مع الدوران بمعدل 8 دورات في الدقيقة (دورة في الدقيقة) في غرفة باردة.

2. الترسيب المناعي ل Ago2

  1. تحلل الخلايا
    1. أحضر اللوحة التي تحتوي على خلايا مستزرعة على مرشحات مقاس 24 مم من حاضنة زراعة الخلايا وانقل المرشحات بسرعة إلى طبق على الجليد مملوء ب PBS المثلج. اسمح ل PBS بالتدفق إلى الجانب القمي من المرشحات لتغطية الخلايا.
    2. جانبا تلو الآخر ، قم بشفط PBS وغسل الجانب القمي والقاعدي باستخدام PBS المثلج مرتين.
    3. قم بشفط جميع PBS ، وأضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت mi-Lysis المثلج البارد (+) إلى الخلايا ، وكشط الخلايا ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل محدد لحالة العلاج المعنية (TGF-β1 أو التحكم في السيارة).
    4. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت mi-Lysis (+) إلى كل أنبوب ودوامة جيدا.
    5. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    6. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واجمع المادة الطافية كمحللة الخلية ، واستمر في وضع الجليد.
  2. التنظيف المسبق لمحللة الخلية مع حبات الاغاروز البروتين غير المترافق G
    1. اغسل 30 ميكرولتر من ملاط حبة البروتين الطازج G agarose (50٪) في أنبوب سعة 1.5 مل 3 مرات مع 100 ميكرولتر من PBS (الخطوة 1.4.1) وقم بإزالة PBS الزائد.
    2. اغسل الخرزات ب 500 ميكرولتر من mi-Wash Buffer (+) مرة واحدة ، ومرة واحدة ب 500 ميكرولتر من mi-Lysis Buffer (+). قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد.
    3. أضف محللة الخلية من الخطوة 2.1.6 إلى الأنابيب التي تحتوي على حبات البروتين G غير المترافقة.
    4. قم بتدوير الأنابيب (8 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة واحدة في الغرفة الباردة لتنظيف محللات الخلية.
    5. بعد التنظيف المسبق ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 2,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. اجمع المحللة التي تم تطهيرها مسبقا كمادة طافية في أنابيب جديدة واحتفظ بها على الجليد.
    6. تحضير محللة الخلية الكاملة قبل الترسيب المناعي (WCL) للكشف عن بروتين Ago2 عن طريق النشاف الغربي. خذ 10 ميكرولتر من المحللات التي تم تنظيفها مسبقا وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة (مع 10٪ DTT) ، وقم بتسخينه عند 85 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، ثم يبرد على المقعد ، ويخزن في -20 درجة مئوية.
  3. الترسيب المناعي لمجمعات Ago2 مع الأجسام المضادة المضادة ل Ago2 المثبتة على حبيبات بروتين G agarose
    1. جهاز الطرد المركزي الجسم المضاد المضاد ل Ago2 المترافق مع حبات البروتين G المحضرة في الخطوة 1.4.4 عند 2,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. اغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من mi-Lysis Buffer (+) ، وجهاز الطرد المركزي كما كان من قبل ، وتخلص من المادة الطافية مرة أخرى.
    2. امزج 500 ميكرولتر من محللات الخلية التي تم تطهيرها مسبقا من الخطوة 2.2.6 مع الجسم المضاد المضاد ل Ago2 المقترن بحبات البروتين G واحتضنه لمدة 3 ساعات بالتناوب (8 دورة في الدقيقة) في الغرفة الباردة.
    3. أحضر الأنابيب من الغرفة الباردة على الجليد إلى أعلى المقعد وجهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها.
    4. اغسل حبات بروتين G agarose بمجمعات الأجسام المضادة المضادة ل Ago2 التي تحتوي على miRNAs المترسبة المناعية المشتركة مع 1 مل من المخزن المؤقت mi-Wash (+) ، وجهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه العملية مرتين.
    5. أعد تعليق الخرزات ب 1 مل من mi-Wash Buffer (+) وخذ 100 ميكرولتر من الملاط إلى أنبوب جديد لعينات بروتين ما بعد الترسيب المناعي للنشاف الغربي.
    6. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 2,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    7. أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة (10٪ DTT) ، وقم بتسخينه لمدة 5 دقائق عند 85 درجة مئوية ، واخلطه ، وجهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
    8. قم بالطرد المركزي للأنابيب مع 900 ميكرولتر المتبقية من مجمعات الأجسام المضادة المضادة ل Ago2 المثبتة من الخطوة 2.3.5 عند 2,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية ، وشفط المادة الطافية وتخلص منها. احتفظ بالعينات على الجليد.

3. عزل الحمض النووي الريبي

  1. قم بتسمية أنبوبين سعة 1.5 مل لكل عينة لعزل الحمض النووي الريبي الصغير والحمض النووي الريبي الكبير في الخطوات القادمة وأضف 2 ميكرولتر من mi-solution IV إلى كل أنبوب ، لاستخدامه في الخطوتين 3.5 و 3.8.
  2. قم بإعداد محلول الخلط الرئيسي عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من mi-solution I و 240 ميكرولتر من mi-solution II من مجموعة اختبار RIP ، لكل عينة ، إلى أنبوب 1.5 مل والحفاظ على الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف 250 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب يحتوي على مجمعات الأجسام المضادة المضادة ل Ago2 المجمدة (المحضرة في الخطوة 2.3.8) ، والدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف 150 ميكرولتر من mi-solution III في نفس الأنبوب واخلطه جيدا. ثم جهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. يحتوي المادة الطافية في هذه الخطوة على الحمض النووي الريبي الكبير بالإضافة إلى الحمض النووي الريبي الصغير (أي الحمض النووي الريبي الكلي).
  5. انقل المادة الطافية بعناية إلى الأنبوب الذي يحتوي على 2 ميكرولتر من mi-solution IV ، المحضر في الخطوة 3.1. تجنب تلويث المادة الطافية بالخرز للتداخل مع qRT-PCR.
  6. أضف 300 ميكرولتر من 2-بوبانول المثلج إلى كل أنبوب يحتوي على إجمالي الحمض النووي الريبي ، والدوامة ، والدوران ، والحضانة عند -20 درجة مئوية لمدة ساعتين للحصول على الترسيب الأمثل للحمض النووي الريبي الكبير.
  7. بعد الحضانة عند -20 درجة مئوية ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل الحمض النووي الريبي الصغير والكبير ، الموجود في المادة الطافية والحبيبات ، على التوالي. احتفظ بالكريات على الجليد حتى الخطوة 3.11.
  8. انقل المادة الطافية ذات الحمض النووي الريبي الصغير إلى الأنبوب المحضر في الخطوة 3.1 (يحتوي على 2 ميكرولتر من mi-solution IV) وأضف 500 ميكرولتر من 2-بروبانول مثلج ، دوامة ، وتدور لأسفل.
  9. احتضان المواد الطافية طوال الليل عند -20 درجة مئوية للحصول على الترسيب الأمثل للحمض النووي الريبي الصغير.
  10. في اليوم التالي ، أخرج الأنابيب التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الصغير من الفريزر -20 درجة مئوية وأجهزة الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق المادة الطافية ، دون إزعاج الحبيبات ، واغسل الحبيبات التي تحتوي على معظم الحمض النووي الريبي الصغير باتباع الخطوة 3.11.
  11. اشطف الحبيبات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الكبير (الخطوة 3.7) والحمض النووي الريبي الصغير (الخطوة 3.10) ب 500 ميكرولتر من الإيثانول المثلج 70٪ ، لكل منهما. امزج الحبيبات ببطء مع 70٪ إيثانول مثلج ثم جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق المادة الطافية بعناية ، دون إزعاج الحبيبات. كرر عملية الغسيل مرة أخرى.
  12. قم بشفط الإيثانول المتبقي بماصة ذات أحجام أصغر (10 ميكرولتر أو 20 ميكرولتر) واتركه يجف في الهواء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في بيئة خالية من RNase.
  13. أعد تكوين الحمض النووي الريبي الصغير وحبيبات الحمض النووي الريبي الكبيرة عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز والتسخين عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم قم بتخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي بعد التحقق من جودة وتركيز الحمض النووي الريبي بواسطة قطرة نانوية.

4. القياس الكمي ل miRNA عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR)

  1. تحضير (كدنا) من خلال النسخ العكسي ل miRNA باستخدام بادئات حلقية جذعية خاصة ب miRNA
    ملاحظة: يتطلب اكتشاف الحمض النووي الريبي بواسطة qRT-PCR القياسي نموذجا لا يقل عن ضعف طول التمهيدي الأمامي أو الخلفي ، كل منها يبلغ طوله حوالي 20 نيوكليوتيد. وبالتالي ، فإن الحد الأدنى للطول هو 40 نيوكليوتيد على الأقل ، مما يجعل الحمض النووي الريبي الصغير أقصر جدا بحيث لا يمكن اكتشافه. يصف البروتوكول بادئات RT الخاصة ب miRNA (جدول المواد) التي تحتوي على بنية حلقة جذعية عالية الثبات تطيل الحمض النووي (cDNA) المستهدف. يضيف برايمر PCR الأمامي طولا إضافيا مع النيوكليوتيدات التي تعمل على تحسين درجة حرارة الانصهار وتحسين خصوصية الفحص. التمهيدي العكسي يعطل حلقة الجذع13. يصف البروتوكول التالي RT من الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) ل miR-145-5p و miR-143-5p و miR-154-5p باستخدام مجموعة النسخ العكسي miRNA (جدول المواد).
    1. قم بإعداد مزيج رئيسي لكل miRNA عن طريق إضافة 100 ملي مولار dNTPs (0.3 ميكرولتر) ، والنسخ العكسي (2 ميكرولتر) ، والمخزن المؤقت 10x RT (3 ميكرولتر) ، ومثبط RNase (0.38 ميكرولتر) ، والتمهيدي الحلقي الخاص ب miRNA (6 ميكرولتر) ، والماء الخالي من النوكلياز (8.32 ميكرولتر). الحجم المجمع للمزيج الرئيسي هو 20 ميكرولتر.
    2. أضف 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الصغير من الخطوة 3.13 (50-100 نانوغرام) إلى ثلاثة أنابيب منفصلة سعة 200 ميكرولتر لكل (كدنا) من miR-145-5p و miR-143-5p و miR-154-5p.
    3. أضف المزيج الرئيسي إلى الحمض النووي الريبي الصغير ، واخلطه برفق ، ثم قم بتدويره إلى قاع الأنابيب. احتفظ بالأنابيب على الجليد حتى يتم تحميلها في الدراجة الحرارية.
    4. اضبط البرنامج في جهاز التدوير الحراري لدورة واحدة كتعليق عند 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، واضغط على 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، واضغط على 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، واستمر عند 4 درجات مئوية. اضبط حجم التفاعل على 30.0 ميكرولتر. انظر الخطوة 4.1.6.1.
    5. قم بتحميل أنابيب التفاعل في التدوير الحراري. ابدأ تشغيل RT. انظر الخطوة 4.1.6.2.
    6. قم بتشغيل جهاز التدوير الحراري وضع الأنابيب في الدرج. سيظهر أن "النظام يتم التمهيد ، يرجى الانتظار". انقر فوق تصفح / طرق جديدة. احفظ الطريقة واستخدمها في تجربة أخرى من خلال تصفح القائمة. إما أن تختار من قائمة الطرق المحفوظة من قبل وابدأ التشغيل أو أنشئ طريقة "جديدة". ستظهر شاشة طريقة "تحرير التشغيل" أو طريقة "جديدة".
      1. قم بتحرير درجة الحرارة والدورات كما هو مذكور في الخطوة 4.1.4. قم بإضافة أو إزالة المراحل والخطوات بالنقر فوق مرحلة أو خطوة معينة ثم النقر فوق زر الإضافة أو الحذف. انقر فوق حفظ أو قم بتشغيل البرنامج مباشرة. في طريقة حفظ التشغيل ، قم بتسمية طريقة "التشغيل" ، واضبط حجم التفاعل (30 ميكرولتر) ، واضبط درجة حرارة الغطاء على 105 درجة مئوية ، وحفظ ، وخروج.
      2. عند ظهور شاشة "استعراض طريقة التشغيل" ، حدد الطريقة المحفوظة من قائمة "طريقة التشغيل". انقر فوق بدء التشغيل وقم بتأكيد حجم التفاعل ودرجة حرارة الغطاء مرة أخرى. انقر فوق ابدأ التشغيل الآن. ستعرض الشاشة درجة حرارة العينة ودرجة حرارة الغطاء والوقت المتبقي. سجل وقت البدء والإيقاف بعد الانتهاء وقم بإزالة الأنابيب من الدراجة الحرارية.
        ملاحظة: يمكن تخزين الأنابيب التي تحتوي على (كدنا) في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى ل qPCR من miRNA.
  2. qPCR مع البادئات الأمامية / الخلفية الخاصة ب miRNA ومجسات التحلل المائي
    ملاحظة: البروتوكول التالي مخصص ل qPCR من miR-145-5p و miR-143-5p و miR-154-5p باستخدام cDNAs الخاصة ب miRNA المعدة في الخطوة 4.1. يحتوي مقايسة miRNA أحادية الأنبوب (20x) على بادئات أمامية / خلفية خاصة ب miRNA ومسبار التحلل المائي (جدول المواد). يضيف التمهيدي الأمامي النيوكليوتيدات لزيادة الطول وتحسين درجة حرارة الانصهار ، بينما يعطل التمهيدي العكسي الحلقة الجذعية ل cDNA13. يوفر Universal PCR Master Mix (جدول المواد) مكونات إضافية مطلوبة ل qPCR. يتم التفاعل (20 ميكرولتر) في ثلاث نسخ لكل ميرنا.
    1. قم بإعداد مزيج رئيسي منفصل ل miR-145-5p و miR-143-5p و miR-154-5p في ثلاث نسخ باستخدام مقايسة miRNA المعنية (20x) (1 μL) ، و 2x Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG ؛ 10 μL) ، والماء الخالي من النوكلياز (7.5 ميكرولتر). الحجم الكلي لتفاعل واحد هو 18.5 ميكرولتر.
    2. أضف (كدنا) الخاص بالحمض النووي الريبي المرسال (1.5 ميكرولتر) المحضر في 4.1 إلى كل بئر من لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل في ثلاث نسخ.
    3. أضف المزيج الرئيسي الخاص بالحمض النووي الريبي المرسال (18.5 ميكرولتر) المحضر في الخطوة 4.2.1 إلى آبار لوحة PCR التي تحتوي على (1.5 ميكرولتر) (cDNA) المعنية.
    4. قم بختم اللوحة مع مانع التسرب المناسب وقم بتشغيل qPCR لمدة 45 دورة على cycler الحراري qPCR (جدول المواد). اضبط درجة حرارة الدورة على أنها ثابتة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، متبوعة ب 45 تكرارا بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية (ثانية) و60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. انظر الخطوة 4.2.6.
    5. قم بتعيين خطوط أساس منحنى qPCR يدويا لكل لوحة والعتبات الموحدة لجميع عمليات تشغيل qPCR عند نقطة يصبح عندها التضخيم لوغاريتميا لجميع العينات.
    6. قم بتشغيل جهاز التدوير الحراري وضع لوحة PCR في الدرج. تعمل آلة التدوير الحراري مع البرنامج المثبت على الكمبيوتر المصاحب. انقر فوق أيقونة برنامج النظام.
      1. انقر فوق إنشاء مستند جديد أو فتح مستند موجود (إذا كان هناك مستند محفوظ مسبقا). سيظهر معالج مستندات جديدة. سيكون الاختبار "المنحنى القياسي (القياس الكمي المطلق)". انقر فوق التالي.
      2. أضف كاشفا جديدا. قم بتسمية الكاشف باسم miR-143 و miR-145 و miR-154 واحدا تلو الآخر بالنقر فوق إنشاء آخر. حدد صبغة المراسل ك "FAM" للجميع ، وانقر فوق موافق. ثم ابحث عن الاسم ك miR-143 و miR-145 و miR-154 وأضفها إلى مستند الكاشف بالنقر فوق إضافة. ثم انقر فوق التالي.
      3. سيظهر "إعداد لوحة عينة". حدد الآبار للكاشف ثم انقر فوق استخدام لتحديد الكاشف المقابل. ثم انقر فوق إنهاء. سيظهر تهيئة النظام.
      4. انتقل إلى الأداة واضبط المرحلة ودرجة الحرارة والوقت كما هو مذكور في الخطوة 4.2.4. اضبط حجم العينة على 20 ميكرولتر. ثم ابدأ التشغيل بالنقر فوق ابدأ. ثم احفظ اللوحة باسم في المكان المطلوب. سيظهر الوقت المقدر على الشاشة بالقرب من زر البدء. لاحظ الوقت.
      5. بعد الانتهاء ، انتقل إلى ملف | التصدير | النتائج ، وحفظ النتائج كقيم CT في الموقع المطلوب. ستكون قيم CT في ملفات .csv. افتحه وانسخ القيم إلى ملف جدول بيانات.
    7. اطرح متوسط دورة العتبة الثلاثية (Ct) للعينات المعالجة بالتحكم في السيارة من متوسط Ct للعينات المعالجة ب TGF-β1 لحساب ΔCt. أخيرا ، احسب تغيير الطية (FC) لمستويات miRNA باستخدام الصيغة 2-ΔCt. يمكن استخدام تحويل log2 لقيمة FC للتمثيل الرسومي.

النتائج

لقد أظهرنا سابقا أن TGF-β1 زاد من إجمالي المستويات الخلوية ل miR-145-5p و miR-143-5p و miR-154-5p miRNAs في خلايا CFBE41o-3. بعد ذلك ، استخدمنا مقايسة Ago2-miRNA-co-IP لتوضيح التأثيرات الوظيفية ل TGF-β1 على هذه miRNAs. تمت دراسة تجنيد RISC ل miR-145-5p و miR-143-5p و miR-154-5p في خلايا CFBE41o التي تعبر بثبات عن منظم ...

Discussion

تم تصميم مقايسة Ago2-miRNA-co-IP للتحقيق في المجموعة النشطة من miRNAs استجابة لمعالجة TGF-β1. تعتبر miRNAs النشطة أو المرتبطة ب RISC مهمة لفهم إمكاناتها المثبطة ل mRNAالمستهدف 4. أظهر Panshin et al. مؤخرا أن كفاءة الترسيب المناعي ل Ago2 و miRNAs قد تعتمد على البروتوكول16. هناك ا...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصلحة مالية متنافسة ، وليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر جون ويكفيلد من شركة Tranzyme، Inc. (برمنغهام ، أل) الذي أنشأ خلايا CFBE41o ، وجي بي كلانسي من CFFT الذي قدم الخلايا. تم تمويل هذا البحث من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة R01HL144539 و R56HL127202 (إلى AS-U.) ، ومنحة مؤسسة التليف الكيسي SWIATE18G0.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mM dNTPs (with dTTPs)Applied Biosystems4366596
10x Reverse Transcription Buffer (RT Buffer)Applied Biosystems4366596
2-propanolFisher BioReagentsBP2618-1
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737
7300 Real Time PCR SystemApplied Biosystems4345240
Anti-Ago2 antibody (anti-EIF2C2), mouse monoclonal against human Ago2Medical & Biological Laboratories Co. LtdRN003M
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)Thermo Scientific15260037
Collagen I (Purecol-Type I Bovie collagen solution)Advanced Biometrix50005-100mL
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma646563-.5ML
DTTSigma-Aldrich646563
EthanolDeacon Laboratories64175
Fetal Bovine SerumATLANTA BiologicalsS10350
Goat Anti-Mouse IgGBio-Rad1706516
L-glutamine (200 mM Solution; 29.20 mg/mL)Corning25-005-Cl
Mini cell scrapers United BiosystemsThermo FisherMCS-200
Minimal Essential MediumThermo Fisher Scientific11095-080
miRNA specific stem looped RT primersApplied Biosystems4427975
Mouse IgG2 controlDako, Glostrup, DenmarkA0424
MultiScribe Reverse Transcriptase, 50 U/µLApplied Biosystems4366596
Nano Drop ND-1000 SpectrophotometerNanoDrop Technologies, Inc.E112352
Nuclease-free waterAmbionAM9937
Opti-MEM (1x) Reduced Serum MediumGibco by Life Technologies11058-021
PBSGibco14190250
Penicillin-streptomycin, SterileSigma-AldrichP0781
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein G agarose beads (Pierce Protein G Plus Agarose)Thermo Scientific22851
PuromycinInvivoGenant-pr-1
RiboCluster Profiler RIP-Assay Kit for microRNAMedical & Biological Laboratories Co. LtdRN1005
RNase Inhibitor, 20 U/µLApplied Biosystems4366596
TaqMan 2x Universal PCR master mix without AmpErase UNGApplied Biosystems4427975
TaqMan miRNA single tube Assay (20x) containing miRNA specific forward/reverse primers and probeApplied Biosystems4427975 (assay ID #002278, #002146, and #000477)
TGF-beta1SigmaT1654
Transwell filters (24 mm)Corning Life Sciences Plastic3412
Veriti 96 Well Thermal Cycler (Model:9902)Applied Biosystems4375786

References

  1. Boguslawska, J., Kryst, P., Poletajew, S., Piekielko-Witkowska, A. TGF-beta and microRNA Interplay in Genitourinary Cancers. Cells. 8 (12), (2019).
  2. Oglesby, I. K., Chotirmall, S. H., McElvaney, N. G., Greene, C. M. Regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by microRNA-145, -223, and -494 is altered in DeltaF508 cystic fibrosis airway epithelium. Journal of Immunology. 190 (7), 3354-3362 (2013).
  3. Mitash, N., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Selectively Recruits microRNAs to the RNA-Induced Silencing Complex and Degrades CFTR mRNA under Permissive Conditions in Human Bronchial Epithelial Cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), (2019).
  4. Flores, O., Kennedy, E. M., Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Differential RISC association of endogenous human microRNAs predicts their inhibitory potential. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4629-4639 (2014).
  5. Janas, M. M., et al. Alternative RISC assembly: binding and repression of microRNA-mRNA duplexes by human Ago proteins. RNA. 18 (11), 2041-2055 (2012).
  6. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell Death & Differentiation. 22 (1), 22-33 (2015).
  7. Peters, L., Meister, G. Argonaute proteins: mediators of RNA silencing. Molecular Cell. 26 (5), 611-623 (2007).
  8. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Slicer and the argonautes. Nature Chemical Biology. 3 (1), 36-43 (2007).
  9. Liu, J., et al. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science. 305 (5689), 1437-1441 (2004).
  10. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 15 (2), 185-197 (2004).
  11. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. Journal of Physiology. 569, 601-615 (2005).
  13. Kramer, M. F. Stem-loop RT-qPCR for miRNAs. Current Protocols in Molecular Biology. , (2011).
  14. Swiatecka-Urban, A., et al. The short apical membrane half-life of rescued {Delta}F508-cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) results from accelerated endocytosis of {Delta}F508-CFTR in polarized human airway epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (44), 36762-36772 (2005).
  15. Hentchel-Franks, K., et al. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (2), 140-146 (2004).
  16. Panshin, D. D., Kondratov, K. A. The Efficiency of Immunoprecipitation of microRNA/Ago2 Complexes from Human Blood Plasma Is Protocol Dependent. Molekuliarnaia Biologiia. 54 (2), 244-251 (2020).
  17. Akerström, B., Brodin, T., Reis, K., Björck, L. Protein G: a powerful tool for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies. Journal of Immunology. 135 (4), 2589-2592 (1985).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ago2 miRNA co IP TGF 1 RISC MiRNA Argonaute2 MiRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved