O ensaio Ago2-miRNA-co-IP para estudar o recrutamento mediado por TGF-β1 de miRNA para o RISC em células CFBE

Resumo

Aqui, descrevemos o ensaio Ago2-miRNA-co-IP projetado para quantificar um pool ativo de miRNAs específicos induzidos por TGF-β1 em células CFBE41o- epiteliais brônquicas humanas. Este ensaio fornece informações funcionais sobre o recrutamento de miRNA para o complexo silenciador induzido por RNA, quantificado por qRT-PCR usando primers específicos de miRNA e sondas de hidrólise TaqMan.

Resumo

Micro(mi)RNAs são RNAs curtos e não codificantes que medeiam a interferência de RNA (RNAi) por mecanismos pós-transcricionais. MiRNAs específicos são recrutados para o complexo de silenciamento induzido por RNA citoplasmático (RISC). Argonauta2 (Ago2), um componente essencial do RISC, facilita a ligação do miRNA ao local-alvo no mRNA, seguido pela clivagem do duplex miRNA-mRNA com sua atividade de endonuclease. O RNAi é mediado por um pool específico de miRNAs recrutados para o RISC e, portanto, é chamado de pool funcional. Os níveis celulares de muitos miRNAs são afetados pela citocina Fator de Crescimento Transformador-β1 (TGF-β1). No entanto, pouco se sabe sobre se o TGF-β1 afeta os pools funcionais desses miRNAs. O ensaio Ago2-miRNA-co-IP, discutido neste manuscrito, foi projetado para examinar os efeitos do TGF-β1 no recrutamento de miRNAs para RISC e ajuda a determinar se as mudanças nos níveis de miRNAs celulares se correlacionam com as mudanças nos pools funcionais associados ao RISC. Os princípios gerais do ensaio são os seguintes. As células cultivadas tratadas com TGF-β1 ou controle veicular são lisadas e o Ago2 endógeno é imunoprecipitado com anticorpo anti-Ago2 imobilizado, e os miRNAs ativos complexados com Ago2 são isolados com um kit de ensaio de imunoprecipitação RISC (RIP). Os miRNAs são identificados com reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) usando primers de loop de haste específicos para miRNA durante a transcrição reversa, seguidos por PCR usando primers diretos e reversos específicos para miRNA e sondas de hidrólise TaqMan.

Introdução

O Fator de Crescimento Transformador-β1 (TGF-β1) é uma citocina multifuncional que pode alterar a expressão de muitos micro(mi)RNAs ^1,2,3. O nível celular total de um determinado miRNA não se correlaciona com seu potencial inibitório porque apenas uma fração específica do miRNA é incorporada ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) para realizar a interferência de RNA (RNAi)³. Apenas até 10% de cada miRNA está associado ao RISC e participa do RNAi ^4,5. Em seguida, o processo de RNAi envolve a ligação do miRNA associado ao RISC à(s) sequência(s) de reconhecimento de mRNA ^alvo6. A associação RISC é influenciada pela disponibilidade do mRNA alvo e pela complementaridade do miRNA com o sítio de ligação, geralmente presente na região 3' não traduzida (UTR) do mRNA⁴. O ensaio Argonaute2-miRNA-co-immunoprecipitation (Ago2-miRNA-co-IP), descrito neste manuscrito, foi projetado para examinar o efeito do TGF-β1 no recrutamento de miRNAs específicos para RISC, detectando diferenças nos miRNAs associados a RISC após o tratamento com TGF-β1, em comparação com o controle do veículo. Examinar o pool funcional associado ao RISC de um miRNA específico é muito mais informativo sobre os efeitos do miRNA do que examinar o nível celular total do miRNA. O RISC consiste em proteínas que varrem o local de ligação no mRNA alvo e clivam o duplex miRNA-mRNA. Argonaute2 (Ago2) é o principal componente do RISC. Das cinco isoformas de Ago (Ago1-Ago5), Ago2 é a única que possui atividade de endonuclease e participa do RNAi em células humanas 7,8,9,10. O complexo Ago2-miRNA-RISC é a unidade funcional para a repressão pós-transcricional de mRNA mediada por miRNA¹¹. O miRNA associado à Ago2 representa o estado nativo do miRNA em resposta à sinalização intracelular ou extracelular. Assim, a imunoprecipitação do Ago2 endógeno oferece uma excelente oportunidade para detectar a fração ativa associada a RISC de um miRNA específico, bem como a avaliação funcional de seus alvos. Este ensaio é superior ao pull-down de mRNA alvo endógeno com miRNAs biotinilados devido à eficiência imprevisível da captação celular de moléculas de ácidos nucleicos biotinilados e seus efeitos fora do alvo.

O ensaio Ago2-miRNA-co-IP, discutido neste manuscrito, foi otimizado para determinar os efeitos do TGF-β1 no recrutamento de miRNAs por RISC em células epiteliais brônquicas humanas imortalizadas CFBE41o-³. Componentes do kit de ensaio RIP foram utilizados para realizar o ensaio Ago2-miRNA-co-IP com modificações no protocolo fornecido pelo fabricante. Um método de separação foi usado para isolar RNA pequeno e grande, no qual RNA pequeno foi usado para quantificar miRNA com a ajuda da reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) usando primers de loop de haste específicos para miRNA durante a transcrição reversa, seguido por PCR usando primers diretos e reversos específicos para miRNA e sondas de hidrólise TaqMan.

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Protocolo

1. Preparação antes do experimento

1. Semeando células
   1. Prepare a solução de colágeno I a 10% em meio essencial mínimo (MEM) e adicione 500 μL a cada filtro de cultura de células de 24 mm em uma placa de 6 poços. Distribua para cobrir toda a superfície do filtro girando suavemente com a mão. Incubar filtros sob luz ultravioleta na capela de fluxo laminar à temperatura ambiente por 30 minutos (min), seguido de incubação em incubadora de cultura de células a 37 °C por 1 h.
   2. Prepare o meio de cultura de células (MEM gaseificado com CO₂ por 20 min, soro fetal bovino (FBS) a 10%, penicilina 50 U / mL, estreptomicina 50 U / mL, L-glutamina 2 mM, puromicina 0,5 μg / mL).
   3. Retire os filtros revestidos de colágeno (etapa 1.1.1) da incubadora e aspire o excesso de colágeno. Adicione 1,5 mL do meio de cultura de células (etapa 1.1.2) ao lado basolateral e 0,5 mL ao lado apical (no filtro) na placa de 6 poços.
   4. Semente 1 x 10⁶ de células CFBE41o-¹² suspensas em 500 μL do meio de cultura celular. Gire a placa suavemente com a mão para distribuir as células uniformemente nos filtros e incube na incubadora de cultura de células a 37 °C com 5% de CO₂.
   5. Remova o meio do lado apical um dia após a semeadura das células e continue cultivando as células na interface ar-líquido (sem meio no lado apical). Troque o meio basolateral diariamente e realize o experimento no^8º dia.
2. Tratamento de Células com TGF-β1 ou Controle Veicular
   1. Prepare o meio de cultura de células sem FBS (meio livre de FBS): Gaste MEM com 5% de CO₂ por 20 min, adicione 50 U / mL de penicilina, 50 U / mL de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina e esterilize o filtro do meio.
   2. Prepare o controle do veículo: Adicione 20 μL de HCl 1 M e 5 mg de BSA a 5 mL de água bidestilada (HCl 4 mM com 1 mg / mL BSA) para obter 1 ng / μL de solução estoque. Filtre e esterilize a mistura antes de usar.
   3. Prepare a solução de TGF-β1: Reconstitua 1 μg de TGF-β1 liofilizado em 1 mL de veículo filtrado estéril (4 mM de HCl e 1 mg / mL de BSA) para obter 1 ng / μL de solução estoque. Alíquota em pequenos volumes e armazenar a -20 °C.
   4. Prepare a concentração de trabalho de TGF-β1 ou controle do veículo a 15 ng / mL de meio livre de FBS (adicione 15 μL do TGF-β1 ou solução de estoque de controle do veículo por mL de meio livre de FBS). Sujar o meio de cultura de células do lado basolateral e adicionar o TGF-β1 ou o veículo de controlo contendo o meio 24 h antes da experiência.
3. Preparação de tampões para lise celular e imunoprecipitação
   1. Prepare o tampão de mi-lise (+) para lise celular. Adicione 1 comprimido de inibidor de protease mini e 15 μL de 1 M DTT por 10 mL de volume no tampão de mi-lise fornecido no kit de ensaio RIP.
   2. Prepare o tampão mi-Wash (+) para lavar as esferas de agarose G de proteína. Adicione 52,5 μL de 1 M DTT por 35 mL de volume no tampão mi-Wash fornecido no kit de ensaio RIP.
4. Conjugação do anticorpo Anti-Ago2 com grânulos de agarose da proteína G
   1. Lave separadamente duas alíquotas de 30 μL de pasta de grânulos de agarose de proteína G (50%) repetindo o seguinte procedimento três vezes: adicione 100 μL de PBS gelado, misture suavemente, centrifugue a 2.000 x g por 1 min e aspire o sobrenadante com pipeta de 200 μL.
   2. Lave os grânulos uma vez com 100 μL de mi-Wash Buffer (+), aspire o sobrenadante com uma pipeta de 200 μL e adicione 500 μL de mi-Wash Buffer (+) aos grânulos e misture suavemente. Mantenha os tubos no gelo.
   3. Adicione 7,5 μg de anticorpo monoclonal de camundongo (IgG2) anti-EIF2C2 humano (Ago2) (consulte a Tabela de Materiais) ou IgG2 de camundongo não específico (controle negativo) à pasta de grânulos de proteína G no tampão mi-Wash (+).
   4. Incube os tubos durante a noite, girando a 8 rotações por minuto (rpm) em uma câmara fria.

2. Imunoprecipitação de Ago2

1. Lise de células
   1. Traga a placa contendo células cultivadas em filtros de 24 mm da incubadora de cultura de células e transfira rapidamente os filtros para uma placa com gelo cheia de PBS gelado. Permita que o PBS transborde para o lado apical dos filtros para cobrir as células.
   2. Um lado de cada vez, aspire o PBS e lave o lado apical e basolateral com PBS gelado duas vezes.
   3. Sugue todo o PBS, adicione 300 μL de tampão mi-Lysis gelado (+) às células, raspe as células e transfira para um tubo de 1,5 mL marcado para a respectiva condição de tratamento (TGF-β1 ou controle do veículo).
   4. Adicione 200 μL de tampão mi-Lysis (+) a cada tubo e vórtice completamente.
   5. Incube os tubos no gelo por 15 min.
   6. Centrifugar o tubo a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C, recolher o sobrenadante como lisado celular e mantê-lo em gelo.
2. Pré-limpeza do lisado celular com grânulos de agarose de proteína G não conjugada
   1. Lave 30 μL de pasta de grânulos de agarose G de proteína G fresca (50%) em um tubo de 1,5 mL 3 vezes com 100 μL de PBS (etapa 1.4.1) e remova o excesso de PBS.
   2. Lave os grânulos com 500 μL de tampão mi-Wash (+) uma vez e uma vez com 500 μL de tampão mi-Lysis (+). Remova o excesso de buffer.
   3. Adicione lisado celular da etapa 2.1.6 aos tubos contendo grânulos de proteína G não conjugados.
   4. Gire (8 rpm) os tubos por 1 h na câmara fria para pré-limpar os lisados celulares.
   5. Após a pré-limpeza, centrifugue os tubos a 2.000 x g por 1 min a 4 °C. Recolher o lisado pré-limpo como sobrenadante em tubos novos e mantê-lo congelado.
   6. Preparar lisado de células inteiras (WCL) pré-imunoprecipitação para detecção da proteína Ago2 por western blotting. Pegue 10 μL de lisados pré-limpos e adicione 10 μL de tampão de amostra (com 10% de DTT), aqueça a 85 ° C por 4 min, resfrie na bancada e armazene a -20 ° C.
3. Imunoprecipitação de complexos Ago2 com anticorpo anti-Ago2 imobilizado em grânulos de agarose proteína G
   1. Centrifugar o anticorpo anti-Ago2 conjugado com esferas de proteína G preparadas no passo 1.4.4 a 2.000 x g durante 1 minuto a 4 °C, retirar o sobrenadante e eliminar. Lave os grânulos uma vez com 500 μL de tampão de mi-lise (+), centrifugue como antes e descarte o sobrenadante novamente.
   2. Misturar 500 μL dos lisados celulares pré-limpos da etapa 2.2.6 com anticorpo anti-Ago2 conjugado com esferas de proteína G e incubar por 3 h girando (8 rpm) na câmara fria.
   3. Traga os tubos da câmara fria com gelo para a bancada e centrifugue a 2.000 x g por 1 min a 4 °C. Em seguida, remova e descarte o sobrenadante.
   4. Lave as esferas de proteína G agarose com complexos anticorpo-Ago2 imobilizados contendo os miRNAs co-imunoprecipitados com 1 mL de tampão mi-Wash (+), centrifugue a 2.000 x g por 1 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante. Repita esse processo duas vezes.
   5. Ressuspenda os grânulos com 1 mL de mi-Wash Buffer (+) e leve 100 μL da pasta para um novo tubo para as amostras de proteína pós-imunoprecipitação para western blotting.
   6. Centrifugar os tubos a 2.000 x g durante 1 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
   7. Adicione 20 μL de tampão de amostra (10% DTT), aqueça por 5 min a 85 °C, misture e centrifugue a 2.000 x g por 1 min em temperatura ambiente. Armazene as amostras a -20 °C.
   8. Centrifugue os tubos com os 900 μL restantes de complexos anticorpo-Ago2 imobilizados da etapa 2.3.5 a 2.000 x g por 1 min a 4 ° C, aspire e descarte o sobrenadante. Mantenha as amostras no gelo.

3. Isolamento de RNA

1. Rotule dois tubos de 1,5 mL por amostra para isolamento de RNA pequeno e RNA grande nas próximas etapas e adicione 2 μL de solução mi-IV a cada tubo, para ser usado nas etapas 3.5 e 3.8.
2. Preparar a solução da mistura principal adicionando 10 μL de solução mi I e 240 μl de solução mi II do kit de ensaio RIP, por amostra, a um tubo de 1,5 ml e manter o tubo à temperatura ambiente.
3. Adicione 250 μL da mistura principal a cada tubo contendo complexos anticorpo-Ago2 imobilizados (preparados na etapa 2.3.8), vórtice e centrifugue a 2.000 x g por 1 min em temperatura ambiente.
4. Adicione 150 μL de mi-solução III no mesmo tubo e misture bem. Em seguida, centrifugue a 2.000 x g por 2 min em temperatura ambiente. O sobrenadante nesta etapa contém RNA grande, além de RNA pequeno (ou seja, RNA total).
5. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para o tubo contendo 2 μl de solução mi, preparada no passo 3.1. Evite contaminar o sobrenadante com grânulos para interferir na qRT-PCR.
6. Adicione 300 μL de 2-popanol gelado a cada tubo contendo RNA total, vórtice, spin down e incube a -20 ° C por 2 h para precipitação ideal de RNA grande.
7. Após a incubação a -20 °C, centrifugar as amostras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C para separar os RNAs pequenos e grandes, contidos no sobrenadante e no pellet, respetivamente. Mantenha os pellets no gelo até a etapa 3.11.
8. Transfira o sobrenadante com pequenos RNAs para o tubo preparado na etapa 3.1 (contendo 2 μL de solução mi-IV) e adicione 500 μL de 2-propanol gelado, vórtice e spin down.
9. Incube os sobrenadantes durante a noite a -20 °C para uma precipitação ideal de pequenos RNAs.
10. No dia seguinte, retire os tubos contendo pequenos RNAs do freezer a -20 ° C e centrifugue a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante, sem perturbar o sedimento, e lavar o sedimento que contém a maior parte do ARN pequeno, seguindo o passo 3.11.
11. Lave o pellet contendo RNA grande (etapa 3.7) e RNA pequeno (etapa 3.10) com 500 μL de etanol a 70% gelado, cada. Misture lentamente o pellet com etanol 70% gelado e centrifugue a 12.000 x g por 3 min a 4 °C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar o sedimento. Repita o processo de lavagem mais uma vez.
12. Aspirar o etanol restante com pipeta de volumes menores (10 μL ou 20 μL) e deixar secar ao ar por 30 min em temperatura ambiente em ambiente livre de RNase.
13. Reconstitua o RNA pequeno e os grânulos de RNA grandes adicionando 50 μL de água livre de nuclease e aquecendo a 65 °C por 5 min. Em seguida, armazene o RNA a -80 °C até uso posterior após verificar a qualidade e a concentração de RNA por nanodrop.

4. Quantificação de miRNA por reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR)

1. Preparação de cDNA através da transcrição reversa de miRNA com primers específicos de miRNA
   NOTA: A detecção de RNA por qRT-PCR padrão requer um modelo de pelo menos duas vezes o comprimento do primer direto ou reverso, cada um com aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento. Assim, o comprimento mínimo é de pelo menos 40 nucleotídeos, tornando os RNAs pequenos muito curtos para detecção. O protocolo descreve RT-primers específicos para miRNA (Tabela de Materiais) contendo estrutura de alça de haste altamente estável que alonga o cDNA alvo. O primer PCR direto adiciona comprimento adicional com nucleotídeos que otimizam sua temperatura de fusão e aumentam a especificidade do ensaio. O primer reverso interrompe a alça da haste¹³. O protocolo a seguir descreve RT de RNA para cDNA para miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p usando o kit de transcrição reversa de miRNA (Tabela de Materiais).
   1. Prepare uma mistura mestre para cada miRNA adicionando 100 mM dNTPs (0,3 μL), transcriptase reversa (2 μL), tampão 10x RT (3 μL), inibidor de RNase (0,38 μL), primer em loop específico para miRNA (6 μL) e água livre de nuclease (8,32 μL). O volume combinado da master mix é de 20 μL.
   2. Adicione 10 μL de RNA pequeno da etapa 3.13 (50-100 ng) a três tubos separados de 200 μL para cada cDNA de miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p.
   3. Adicione a mistura principal ao RNA pequeno, misture delicadamente e gire até o fundo dos tubos. Mantenha os tubos no gelo até serem carregados no termociclador.
   4. Defina o programa no termociclador para ciclo único como manter a 16 °C por 30 min, manter a 42 °C por 30 min, manter a 85 °C por 5 min e manter a 4 °C. Defina o volume de reação para 30,0 μL. Consulte a etapa 4.1.6.1.
   5. Carregue os tubos de reação no termociclador. Inicie a execução do RT. Consulte a etapa 4.1.6.2.
   6. Ligue o termociclador e coloque os tubos na bandeja. Ele mostrará que "O sistema está inicializando, aguarde". Clique em Procurar/Novos métodos. Salve o método e use-o em outro experimento navegando pelo menu. Selecione na lista de métodos salvos antes e inicie a execução ou crie um "novo" método. A tela do método "edit run" ou "new" method aparecerá.
      1. Edite a temperatura e os ciclos conforme indicado na etapa 4.1.4. Adicione ou remova estágios e etapas clicando em um estágio ou etapa específica e, em seguida, clicando no botão adicionar ou excluir. Clique em Salvar ou execute o programa diretamente. Em Save Run Method, nomeie o método "run", defina o volume de reação (30 μL), defina a temperatura de cobertura para 105 °C, salve e saia.
      2. Quando a tela "procurar método de execução" aparecer, selecione o método salvo na lista "método de execução". Clique em Iniciar execução e confirme novamente o volume de reação e a temperatura da cobertura. Clique em Iniciar Executar Agora. A tela mostrará a temperatura da amostra, a temperatura da cobertura e o tempo restante. Registre o tempo de início e parada após a conclusão e remova os tubos do termociclador.
         NOTA: Os tubos contendo cDNA podem ser armazenados a -20 °C até seu uso posterior para qPCR de miRNA.
2. qPCR com os primers diretos/reversos específicos para miRNA e sondas de hidrólise
   NOTA: O protocolo a seguir é para qPCR de miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p usando cDNAs específicos de miRNA preparados na etapa 4.1. O ensaio de miRNA de tubo único (20x) contém primers diretos/reversos específicos para miRNA e sonda de hidrólise (Tabela de Materiais). O primer direto adiciona nucleotídeo para aumentar o comprimento e otimizar a temperatura de fusão, enquanto o primer reverso interrompe o loop do caule do cDNA¹³. O Universal PCR Master Mix (Tabela de Materiais) fornece componentes adicionais necessários para qPCR. A reação (20 μL) é feita em triplicata para cada miRNA.
   1. Prepare master mix separado para miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p em triplicatas usando o respectivo ensaio de miRNA (20x) (1 μL), 2x Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG; 10 μL) e água livre de nuclease (7,5 μL). O volume total para uma reação é de 18,5 μL.
   2. Adicionar cDNA específico para miRNA (1,5 μL) preparado em 4.1 a cada poço da placa de PCR em triplicatas.
   3. Adicionar a mistura principal específica para miRNA (18,5 μL) preparada no passo 4.2.1 aos alvéolos da placa de PCR contendo o respectivo cDNA (1,5 μL).
   4. Sele a placa com o selante apropriado e execute a qPCR por 45 ciclos em um termociclador qPCR (Tabela de Materiais). Defina a temperatura do ciclo como 95 °C por 10 min, seguida por 45 repetições de 95 °C por 15 segundos (s) e 60 °C por 60 s. Consulte a etapa 4.2.6.
   5. Defina as linhas de base da curva de qPCR manualmente por placa e limites padronizados para todas as execuções de qPCR em um ponto em que a amplificação se torne logarítmica para todas as amostras.
   6. Ligue o termociclador e coloque a placa PCR na bandeja. A máquina termocicladora opera com o software instalado no computador que a acompanha. Clique no ícone do software do sistema.
      1. Clique em Criar Novo Documento ou Abrir Documento Existente (se houver um documento salvo anteriormente). O assistente de novo documento será exibido. O ensaio será "curva padrão (quantificação absoluta)". Clique em Avançar.
      2. Adicione um novo detector. Nomeie o detector como miR-143, miR-145 e miR-154, um por um, clicando em Criar outro. Selecione o corante do repórter como "FAM" para todos e clique em OK. Em seguida, encontre o nome como miR-143, miR-145 e miR-154 e adicione-os ao documento do detector clicando em Adicionar. Em seguida, clique em Avançar.
      3. "Configurar placa de amostra" aparecerá. Selecione os poços para um detector e clique em Usar para selecionar o detector correspondente. Em seguida, clique em Concluir. A inicialização do sistema aparecerá.
      4. Vá para o Instrumento e defina stage, temperatura e tempo conforme mencionado na etapa 4.2.4. Defina o volume da amostra para 20 μL. Em seguida, inicie a execução clicando em Iniciar. Em seguida, salve a placa com um nome no local desejado. O tempo estimado será exibido na tela perto do botão Iniciar. Anote o tempo.
      5. Após a conclusão, vá para Arquivo | Exportação | Resultados e salve os resultados como valores de CT no local desejado. Os valores de CT estarão em .csv arquivos. Abra-o e copie os valores em um arquivo de planilha.
   7. Subtraia a média do ciclo de limiar triplicado (Ct) das amostras tratadas com controle do veículo do Ct médio das amostras tratadas com TGF-β1 para calcular o ΔCt. Finalmente, calcule a mudança de dobra (FC) dos níveis de miRNA usando a fórmula ^2-ΔCt. A transformação log2 do valor FC pode ser usada para representação gráfica.

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Resultados

Mostramos anteriormente que o TGF-β1 aumentou os níveis celulares totais de miRNAs miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p em células CFBE41o-³. Em seguida, empregamos o ensaio Ago2-miRNA-co-IP para elucidar os efeitos funcionais do TGF-β1 nesses miRNAs. O recrutamento RISC de miR-145-5p, miR-143-5p e miR-154-5p foi estudado em células CFBE41o- expressando de forma estável o regulador de condutância transmembrana de fibrose cística do tipo selvagem (WT) (CFTR)...

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Discussão

O ensaio Ago2-miRNA-co-IP foi projetado para investigar o pool ativo de miRNAs em resposta ao tratamento com TGF-β1. Os miRNAs ativos ou associados ao RISC são importantes para entender seu potencial inibitório para o mRNA alvo⁴. Panshin et al. mostraram recentemente que a eficiência de imunoprecipitação de Ago2 e miRNAs pode depender do protocolo¹⁶. Existem várias diferenças entre o protocolo aqui e os dados publicados acima. O pro...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM dNTPs (with dTTPs)	Applied Biosystems	4366596
10x Reverse Transcription Buffer (RT Buffer)	Applied Biosystems	4366596
2-propanol	Fisher BioReagents	BP2618-1
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737
7300 Real Time PCR System	Applied Biosystems	4345240
Anti-Ago2 antibody (anti-EIF2C2), mouse monoclonal against human Ago2	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd	RN003M
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	Thermo Scientific	15260037
Collagen I (Purecol-Type I Bovie collagen solution)	Advanced Biometrix	50005-100mL
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	646563-.5ML
DTT	Sigma-Aldrich	646563
Ethanol	Deacon Laboratories	64175
Fetal Bovine Serum	ATLANTA Biologicals	S10350
Goat Anti-Mouse IgG	Bio-Rad	1706516
L-glutamine (200 mM Solution; 29.20 mg/mL)	Corning	25-005-Cl
Mini cell scrapers United Biosystems	Thermo Fisher	MCS-200
Minimal Essential Medium	Thermo Fisher Scientific	11095-080
miRNA specific stem looped RT primers	Applied Biosystems	4427975
Mouse IgG2 control	Dako, Glostrup, Denmark	A0424
MultiScribe Reverse Transcriptase, 50 U/µL	Applied Biosystems	4366596
Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer	NanoDrop Technologies, Inc.	E112352
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
Opti-MEM (1x) Reduced Serum Medium	Gibco by Life Technologies	11058-021
PBS	Gibco	14190250
Penicillin-streptomycin, Sterile	Sigma-Aldrich	P0781
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-Free	Thermo Scientific	A32955
Protein G agarose beads (Pierce Protein G Plus Agarose)	Thermo Scientific	22851
Puromycin	InvivoGen	ant-pr-1
RiboCluster Profiler RIP-Assay Kit for microRNA	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd	RN1005
RNase Inhibitor, 20 U/µL	Applied Biosystems	4366596
TaqMan 2x Universal PCR master mix without AmpErase UNG	Applied Biosystems	4427975
TaqMan miRNA single tube Assay (20x) containing miRNA specific forward/reverse primers and probe	Applied Biosystems	4427975 (assay ID #002278, #002146, and #000477)
TGF-beta1	Sigma	T1654
Transwell filters (24 mm)	Corning Life Sciences Plastic	3412
Veriti 96 Well Thermal Cycler (Model:9902)	Applied Biosystems	4375786