Le test Ago2-miRNA-co-IP pour étudier le recrutement de miARN médié par TGF-β1 dans le RISC dans les cellules CFBE

Résumé

Ici, nous décrivons le test Ago2-miRNA-co-IP conçu pour quantifier un pool actif de miARN spécifiques induits par le TGF-β1 dans les cellules épithéliales bronchiques humaines CFBE41o-. Ce test fournit des informations fonctionnelles sur le recrutement des miARN dans le complexe de silençage induit par l’ARN, quantifiées par qRT-PCR à l’aide d’amorces de miARN spécifiques et de sondes d’hydrolyse TaqMan.

Résumé

Les micro(mi)ARN sont de courts ARN non codants qui médient l’interférence ARN (ARNi) par des mécanismes post-transcriptionnels. Des miARN spécifiques sont recrutés dans le complexe de silençage induit par l’ARN cytoplasmique (RISC). Argonaute2 (Ago2), un composant essentiel de RISC, facilite la liaison du miARN au site cible sur l’ARNm, suivie du clivage du duplex miARN-ARNm avec son activité endonucléase. L’ARNi est médié par un pool spécifique de miARN recrutés pour RISC, et est donc appelé le pool fonctionnel. Les niveaux cellulaires de nombreux miARN sont affectés par le facteur de croissance transformant les cytokines-β1 (TGF-β1). Cependant, on sait peu de choses sur la question de savoir si le TGF-β1 affecte les pools fonctionnels de ces miARN. Le test Ago2-miRNA-co-IP, dont il est question dans ce manuscrit, est conçu pour examiner les effets du TGF-β1 sur le recrutement des miARN dans RISC et aide à déterminer si les changements dans les niveaux cellulaires de miARN sont corrélés avec les changements dans les pools fonctionnels associés à RISC. Les principes généraux de l’essai sont les suivants. Les cellules cultivées traitées avec du TGF-β1 ou un contrôle de véhicule sont lysées et l’endogène Ago2 est immunoprécipité avec un anticorps anti-Ago2 immobilisé, et les miARN actifs complexés avec Ago2 sont isolés avec un kit de test d’immunoprécipitation RISC (RIP). Les miARN sont identifiés par réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcriptase inverse (qRT-PCR) à l’aide d’amorces en boucle spécifiques aux miARN pendant la transcription inverse, suivie d’une PCR à l’aide d’amorces directes et inverses spécifiques aux miARN et de sondes d’hydrolyse TaqMan.

Introduction

Le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1) est une cytokine multifonctionnelle qui peut modifier l’expression de nombreux micro(mi)ARN ^1,2,3. Le niveau cellulaire total d’un miARN particulier n’est pas corrélé avec son potentiel inhibiteur, car seule une fraction spécifique du miARN est incorporée dans le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC) pour effectuer une interférence ARN (ARNi)³. Seulement jusqu’à 10 % de chaque miARN est associé à RISC et participe à l’ARN ^4,5. Ensuite, le processus ARNi implique la liaison du miARN associé à RISC à la ou aux séquences de reconnaissance de l’ARNm ^cible6. L’association RISC est influencée par la disponibilité de l’ARNm cible et la complémentarité du miARN au site de liaison, généralement présente dans la région non traduite 3' (UTR) de l’ARNm⁴. Le test Ago2-miRNA-co-immunoprécipitation (Ago2-miRNA-co-IP), décrit dans ce manuscrit, est conçu pour examiner l’effet du TGF-β1 sur le recrutement de miARN spécifiques à RISC en détectant les différences dans les miARN associés à RISC après le traitement par TGF-β1, par rapport au témoin véhicule. L’examen du pool fonctionnel associé à RISC d’un miARN spécifique est beaucoup plus informatif sur les effets des miARN que l’examen du niveau cellulaire total du miARN. RISC se compose de protéines qui scannent le site de liaison sur l’ARNm cible et clivent le duplex miARN-ARNm. Argonaute2 (Ago2) est le composant principal de RISC. Sur les cinq isoformes d’Ago (Ago1-Ago5), Ago2 est la seule qui a une activité endonucléase et participe à l’ARNi dans les cellules humaines 7,8,9,10. Le complexe Ago2-miRNA-RISC est l’unité fonctionnelle de la répression post-transcriptionnelle de l’ARNm médiée par les miARN¹¹. Le miARN associé à Ago2 représente l’état natif du miARN en réponse à la signalisation intracellulaire ou extracellulaire. Ainsi, l’immunoprécipitation de l’endogène Ago2 offre une excellente opportunité de détecter la fraction active associée à RISC d’un miARN spécifique ainsi que l’évaluation fonctionnelle de ses cibles. Ce test est supérieur à l’extraction d’ARNm cibles endogènes avec des miARN biotinylés en raison de l’efficacité imprévisible de l’absorption cellulaire des molécules d’acide nucléique biotinylées et de leurs effets hors cible.

Le test Ago2-miRNA-co-IP, discuté dans ce manuscrit, a été optimisé pour déterminer les effets du TGF-β1 sur le recrutement RISC des miARN dans les cellules épithéliales bronchiques humaines CFBE41o-³. Des composants du kit de test RIP ont été utilisés pour effectuer le test Ago2-miRNA-co-IP avec des modifications dans le protocole fourni par le fabricant. Une méthode de séparation a été utilisée pour isoler les petits et les grands ARN, dans laquelle de petits ARN ont été utilisés pour quantifier les miARN à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcriptase inverse (qRT-PCR) à l’aide d’amorces à boucle de tige spécifiques aux miARN pendant la transcription inverse, suivie d’une PCR à l’aide d’amorces directes et inverses spécifiques aux miARN et de sondes d’hydrolyse TaqMan.

Protocole

1. Préparation avant l’expérience

1. Cellules d’ensemencement
   1. Préparez une solution de collagène I à 10 % dans un milieu essentiel minimal (MEM) et ajoutez 500 μL à chaque filtre de culture cellulaire de 24 mm dans une plaque à 6 puits. Répartissez pour couvrir toute la surface du filtre en tournant doucement à la main. Incuber les filtres sous la lumière UV dans la hotte à flux laminaire à température ambiante pendant 30 minutes (min), suivi d’une incubation dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 1 h.
   2. Préparez le milieu de culture cellulaire (MEM gazé avec du CO₂ pendant 20 min, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 50 U/mL de pénicilline, 50 U/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 0,5 μg/mL de puromycine).
   3. Sortez les filtres recouverts de collagène (étape 1.1.1) de l’incubateur et aspirez l’excès de collagène. Ajouter 1,5 mL du milieu de culture cellulaire (étape 1.1.2) sur le côté basolatéral et 0,5 mL sur le côté apical (sur le filtre) dans la plaque à 6 puits.
   4. Graine 1 x 10⁶ de cellules CFBE41o-¹² en suspension dans 500 μL du milieu de culture cellulaire. Faites pivoter doucement la plaque à la main pour répartir uniformément les cellules sur les filtres et incubez dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   5. Retirer le milieu du côté apical un jour après l’ensemencement des cellules et poursuivre la culture des cellules à l’interface air-liquide (pas de milieu du côté apical). Changez le milieu basolatéral tous les jours et effectuez l’expérience le 8^ème jour.
2. Traitement des cellules avec le TGF-β1 ou le contrôle du véhicule
   1. Préparez un milieu de culture cellulaire sans FBS (milieu sans FBS) : Gazez du MEM avec 5 % de CO₂ pendant 20 min, ajoutez 50 U/mL de pénicilline, 50 U/mL de streptomycine et 2 mM de L-glutamine et filtrez pour stériliser le milieu.
   2. Préparer la commande du véhicule : Ajouter 20 μL de 1 M de HCl et 5 mg de BSA à 5 mL d’eau doublement distillée (4 mM de HCl avec 1 mg/mL de BSA) pour obtenir une solution mère de 1 ng/μL. Filtrez et stérilisez le mélange avant utilisation.
   3. Préparer une solution de TGF-β1 : Reconstituer 1 μg de TGF-β1 lyophilisé dans 1 mL de véhicule stérile filtré (4 mM de HCl et 1 mg/mL de BSA) pour obtenir une solution mère de 1 ng/μL. Aliquote en petits volumes et conserver à -20 °C.
   4. Préparer la concentration de travail du TGF-β1 ou du témoin du véhicule à 15 ng/mL de milieu exempt de FBS (ajouter 15 μL de TGF-β1 ou de la solution mère de contrôle du véhicule par mL de milieu exempt de FBS). Aspirer le milieu de culture cellulaire du côté basolatéral et ajouter le TGF-β1 ou le témoin du véhicule contenant le milieu 24 h avant l’expérience.
3. Préparation de tampons pour la lyse cellulaire et l’immunoprécipitation
   1. Préparez le tampon mi-Lysis (+) pour la lyse cellulaire. Ajouter 1 comprimé d’inhibiteur de protéase mini et 15 μL de 1 M DTT par 10 mL de volume dans le tampon mi-Lysis fourni dans le kit de dosage RIP.
   2. Préparez le tampon mi-Wash (+) pour laver les billes d’agarose de protéine G. Ajouter 52,5 μL de 1 M DTT par 35 mL de volume dans le tampon mi-Wash fourni dans le kit de dosage RIP.
4. Conjugaison d’un anticorps anti-Ago2 avec des billes d’agarose protéine G
   1. Laver séparément deux aliquotes de 30 μL de boue de billes d’agarose de protéine G (50 %) en répétant trois fois la procédure suivante : ajouter 100 μL de PBS glacé, mélanger délicatement, centrifuger à 2 000 x g pendant 1 min et aspirer le surnageant avec une pipette de 200 μL.
   2. Lavez les billes une fois avec 100 μL de tampon mi-Wash (+) glacé, aspirez le surnageant avec une pipette de 200 μL et ajoutez 500 μL de mi-Wash Buffer (+) aux billes et mélangez délicatement. Gardez les tubes sur de la glace.
   3. Ajouter 7,5 μg d’anticorps monoclonaux (IgG2) anti-humains EIF2C2 (Ago2) de souris (voir le tableau des matières) ou d’IgG2 non spécifiques de souris (contrôle négatif) à la suspension de billes de protéine G dans le tampon mi-Wash (+).
   4. Incuber les tubes pendant la nuit, en tournant à 8 rotations par minute (tr/min) dans une chambre froide.

2. Immunoprécipitation d’Ago2

1. Lyse des cellules
   1. Sortez de l’incubateur la plaque contenant les cellules cultivées sur des filtres de 24 mm et transférez rapidement les filtres sur une plaque sur de la glace remplie de PBS glacé. Laissez le PBS déborder dans la face apicale des filtres pour couvrir les cellules.
   2. Un côté à la fois, aspirez le PBS et lavez deux fois le côté apical et basolatéral avec du PBS glacé.
   3. Aspirez tout PBS, ajoutez 300 μL de tampon mi-Lysis glacé (+) dans les cellules, raclez les cellules et transférez-les dans un tube de 1,5 mL marqué pour les conditions de traitement respectives (TGF-β1 ou contrôle du véhicule).
   4. Ajouter 200 μL de tampon mi-Lysis (+) dans chaque tube et agiter complètement.
   5. Incuber les tubes sur de la glace pendant 15 min.
   6. Centrifugez le tube à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C, collectez le surnageant sous forme de lysat cellulaire et conservez-le sur de la glace.
2. Pré-élimination du lysat cellulaire avec des billes d’agarose de protéine G non conjuguées
   1. Laver 30 μL de boue de billes d’agarose G (50 %) dans un tube de 1,5 mL 3 fois avec 100 μL de PBS (étape 1.4.1) et retirer l’excès de PBS.
   2. Une fois avec 500 μL de tampon mi-Wash (+) et une fois avec 500 μL de tampon mi-Lysis (+). Retirez l’excédent de tampon.
   3. Ajouter le lysat cellulaire de l’étape 2.1.6 dans les tubes contenant des billes de protéine G non conjuguées.
   4. Tourner (8 tr/min) les tubes pendant 1 h dans la chambre froide pour pré-éliminer les lysats cellulaires.
   5. Après le pré-nettoyage, centrifugez les tubes à 2 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Prélever le lysat pré-autorisé en tant que surnageant dans des tubes frais et le conserver sur de la glace.
   6. Préparer le lysat de cellules entières (WCL) de pré-immunoprécipitation pour la détection de la protéine Ago2 par western blot. Prenez 10 μL de lysats pré-clairsés et ajoutez 10 μL de tampon d’échantillon (avec 10 % de DTT), chauffez à 85 °C pendant 4 min, laissez refroidir sur la paillasse et conservez à -20 °C.
3. Immunoprécipitation de complexes Ago2 avec anticorps anti-Ago2 immobilisés sur des billes d’agarose de protéine G
   1. Centrifuger l’anticorps anti-Ago2 conjugué aux billes de protéine G préparées à l’étape 1.4.4 à 2 000 x g pendant 1 min à 4 °C, retirer le surnageant et le jeter. Lavez les billes une fois avec 500 μL de tampon mi-Lysis (+), centrifugez comme précédemment et jetez à nouveau le surnageant.
   2. Mélanger 500 μL des lysats cellulaires pré-nettoyés de l’étape 2.2.6 avec de l’anticorps anti-Ago2 conjugué à des billes de protéine G et incuber pendant 3 h en rotation (8 tr/min) dans la chambre froide.
   3. Amener les tubes de la chambre froide sur de la glace à la paillasse et centrifuger à 2 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Retirez et jetez ensuite le surnageant.
   4. Laver les billes d’agarose de protéine G avec des complexes d’anticorps anti-Ago2 immobilisés contenant les miARN co-immunoprécipités avec 1 mL de tampon mi-Wash (+), centrifuger à 2 000 x g pendant 1 min à 4 °C, et jeter le surnageant. Répétez ce processus deux fois.
   5. Remettre les billes en suspension avec 1 mL de tampon mi-Wash (+) et prélever 100 μL de la boue dans un nouveau tube pour les échantillons de protéines post-immunoprécipitation pour le western blot.
   6. Centrifuger les tubes à 2 000 x g pendant 1 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   7. Ajouter 20 μL de tampon d’échantillon (10 % DTT), chauffer pendant 5 min à 85 °C, mélanger et centrifuger à 2 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Conservez les échantillons à -20 °C.
   8. Centrifuger les tubes avec les 900 μL restants de complexes anticorps-anticorps Ago2 immobilisés à l’étape 2.3.5 à 2 000 x g pendant 1 min à 4 °C, aspirer et jeter le surnageant. Conservez les échantillons sur de la glace.

3. Isolement de l’ARN

1. Étiquetez deux tubes de 1,5 mL par échantillon pour isoler les petits ARN et les gros ARN aux étapes suivantes et ajoutez 2 μL de mi-solution IV dans chaque tube, à utiliser aux étapes 3.5 et 3.8.
2. Préparez la solution de mélange maître en ajoutant 10 μL de mi-solution I et 240 μL de mi-solution II de la trousse de test RIP, par échantillon, dans un tube de 1,5 mL et maintenez le tube à température ambiante.
3. Ajouter 250 μL du mélange maître dans chaque tube contenant des complexes anti-anticorps anti-Ago2 immobilisés et des complexes Ago2 (préparés à l’étape 2.3.8), vortex, et centrifuger à 2 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
4. Ajouter 150 μL de mi-solution III dans le même tube et bien mélanger. Puis centrifuger à 2 000 x g pendant 2 min à température ambiante. À cette étape, le surnageant contient de gros ARN en plus des petits ARN (c.-à-d. l’ARN total).
5. Transvaser avec précaution le surnageant dans le tube contenant 2 μL de mi-solution IV, préparé à l’étape 3.1. Évitez de contaminer le surnageant avec des billes qui interfèrent avec la qRT-PCR.
6. Ajouter 300 μL de 2-popanol glacé dans chaque tube contenant de l’ARN total, vortex, spin down et incuber à -20 °C pendant 2 h pour une précipitation optimale des gros ARN.
7. Après l’incubation à -20 °C, centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour séparer les petits et les gros ARN, contenus respectivement dans le surnageant et la cuillette. Gardez les granulés sur de la glace jusqu’à l’étape 3.11.
8. Transférez le surnageant avec de petits ARN dans le tube préparé à l’étape 3.1 (contenant 2 μL de mi-solution IV) et ajoutez 500 μL de 2-propanol glacé, vortex et spin down.
9. Incuber les surnageants pendant la nuit à -20 °C pour une précipitation optimale des petits ARN.
10. Le lendemain, sortez les tubes contenant de petits ARN du congélateur à -20 °C et centrifugez-les à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirez le surnageant, sans déranger la cuffe, et lavez la pastille contenant la majeure partie du petit ARN en suivant l’étape 3.11.
11. Rincez la pastille contenant du gros ARN (étape 3.7) et du petit ARN (étape 3.10) avec 500 μL d’éthanol glacé à 70 %, chacun. Mélangez lentement le granulé avec de l’éthanol glacé à 70 %, puis centrifugez-le à 12 000 x g pendant 3 min à 4 °C. Aspirez soigneusement le surnageant, sans déranger la pastille. Répétez le processus de lavage une fois de plus.
12. Aspirer le reste de l’éthanol à l’aide d’une pipette de plus petits volumes (10 μL ou 20 μL) et laisser sécher à l’air libre pendant 30 min à température ambiante dans un environnement exempt de RNase.
13. Reconstituez les petits et gros granulés d’ARN en ajoutant 50 μL d’eau libre de nucléases et en chauffant à 65 °C pendant 5 min. Stockez ensuite l’ARN à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure après avoir vérifié la qualité et la concentration de l’ARN par nanogoutte.

4. Quantification des miARN par réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcriptase inverse (qRT-PCR)

1. Préparation de l’ADNc par transcription inverse de miARN avec des amorces à boucle de tige spécifiques aux miARN
   REMARQUE : La détection de l’ARN par qRT-PCR standard nécessite une matrice d’au moins deux fois la longueur de l’amorce avant ou arrière, chacune d’environ 20 nucléotides de long. Ainsi, la longueur minimale est d’au moins 40 nucléotides, ce qui rend les petits ARN trop courts pour la détection. Le protocole décrit des amorces RT (Table of Materials) spécifiques aux miARN contenant une structure de boucle de tige très stable qui allonge l’ADNc cible. L’amorce PCR directe ajoute une longueur supplémentaire avec des nucléotides qui optimisent sa température de fusion et améliorent la spécificité du test. L’amorce inversée perturbe la boucle de tige¹³. Le protocole suivant décrit la RT de l’ARN à l’ADNc pour miR-145-5p, miR-143-5p et miR-154-5p à l’aide du kit de transcription inverse des miARN (table des matériaux).
   1. Préparez un mélange maître pour chaque miARN en ajoutant 100 mM de dNTP (0,3 μL), de transcriptase inverse (2 μL), 10 tampons RT (3 μL), d’inhibiteur de RNase (0,38 μL), d’amorce en boucle spécifique aux miARN (6 μL) et d’eau exempte de nucléases (8,32 μL). Le volume combiné du mélange maître est de 20 μL.
   2. Ajoutez 10 μL de petit ARN de l’étape 3.13 (50-100 ng) à trois tubes distincts de 200 μL pour chaque ADNc de miR-145-5p, miR-143-5p et miR-154-5p.
   3. Ajoutez le mélange principal à un petit ARN, mélangez doucement et tournez au fond des tubes. Gardez les tubes sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient chargés dans le thermocycleur.
   4. Réglez le programme dans le thermocycleur pour un cycle unique comme maintien à 16 °C pendant 30 min, maintien à 42 °C pendant 30 min, maintien à 85 °C pendant 5 min et maintien à 4 °C. Réglez le volume de réaction sur 30,0 μL. Voir l’étape 4.1.6.1.
   5. Chargez les tubes de réaction dans le thermocycleur. Démarrez l’exécution RT. Voir l’étape 4.1.6.2.
   6. Allumez le thermocycleur et placez les tubes dans le plateau. Il affichera que « Le système démarre, veuillez patienter ». Cliquez sur Parcourir/Nouvelles méthodes. Enregistrez la méthode et utilisez-la dans une autre expérience en parcourant le menu. Sélectionnez dans la liste des méthodes enregistrées auparavant et lancez l’exécution ou créez une « nouvelle » méthode. L’écran de la méthode « modifier l’exécution » ou de la « nouvelle » méthode apparaîtra.
      1. Modifiez la température et les cycles comme indiqué à l’étape 4.1.4. Ajoutez ou supprimez des étapes et des étapes en cliquant sur une étape ou une étape particulière, puis en cliquant sur le bouton Ajouter ou supprimer. Cliquez sur Enregistrer ou lancez directement le programme. Dans la méthode d’enregistrement, nommez la méthode « run », réglez le volume de réaction (30 μL), réglez la température du couvercle à 105 °C, enregistrez et quittez.
      2. Lorsque l’écran « Parcourir la méthode d’exécution » s’affiche, sélectionnez la méthode enregistrée dans la liste « Méthode d’exécution ». Cliquez sur Démarrer l’exécution et confirmez à nouveau le volume de réaction et la température de couverture. Cliquez sur Démarrer l’exécution maintenant. L’écran affichera la température de l’échantillon, la température du couvercle et le temps restant. Enregistrez l’heure de démarrage et d’arrêt une fois l’achèvement et retirez les tubes du thermocycleur.
         REMARQUE : Les tubes contenant de l’ADNc peuvent être stockés à -20 °C jusqu’à leur utilisation ultérieure pour la qPCR des miARN.
2. qPCR avec les amorces directes/inverses spécifiques aux miARN et les sondes d’hydrolyse
   REMARQUE : Le protocole suivant s’applique à la qPCR de miR-145-5p, miR-143-5p et miR-154-5p à l’aide d’ADNc spécifiques des miARN préparés à l’étape 4.1. Le test de miARN à tube unique (20x) contient des amorces directes/inverses spécifiques aux miARN et une sonde d’hydrolyse (Table des matériaux). L’amorce avant ajoute du nucléotide pour augmenter la longueur et optimiser la température de fusion, tandis que l’amorce inverse perturbe la boucle de tige de l’ADNc¹³. L’Universal PCR Master Mix (Table of Materials) fournit des composants supplémentaires nécessaires à la qPCR. La réaction (20 μL) se fait en trois exemplaires pour chaque miARN.
   1. Préparez un mélange maître séparé pour miR-145-5p, miR-143-5p et miR-154-5p en triplets à l’aide du test de miARN respectif (20x) (1 μL), du master mix PCR universel 2x (sans AmpErase UNG ; 10 μL) et de l’eau sans nucléases (7,5 μL). Le volume total d’une réaction est de 18,5 μL.
   2. Ajouter de l’ADNc spécifique du miARN (1,5 μL) préparé en 4.1 dans chaque puits de la plaque PCR en trois exemplaires.
   3. Ajouter le mélange maître spécifique des miARN (18,5 μL) préparé à l’étape 4.2.1 dans les puits de la plaque PCR contenant l’ADNc respectif (1,5 μL).
   4. Scellez la plaque avec une soudeuse appropriée et exécutez la qPCR pendant 45 cycles sur un thermocycleur qPCR (Table des matériaux). Réglez la température du cycle à 95 °C pendant 10 min, suivie de 45 répétitions de 95 °C pendant 15 secondes (s) et 60 °C pendant 60 s. Voir l’étape 4.2.6.
   5. Définissez manuellement les lignes de base de la courbe qPCR par plaque et des seuils standardisés pour tous les cycles de qPCR à un point où l’amplification devient logarithmique pour tous les échantillons.
   6. Allumez le thermocycleur et placez la plaque PCR dans le plateau. Le thermocycleur fonctionne avec le logiciel installé sur l’ordinateur qui l’accompagne. Cliquez sur l’icône du logiciel système.
      1. Cliquez sur Créer un nouveau document ou Ouvrir un document existant (s’il y a un document déjà enregistré). L’assistant de création de nouveaux documents apparaît. Le test sera une « courbe standard (quantification absolue) ». Cliquez sur Suivant.
      2. Ajoutez un nouveau détecteur. Nommez le détecteur miR-143, miR-145 et miR-154 un par un en cliquant sur Créer un autre. Sélectionnez le colorant du rapporteur comme « FAM » pour tous, puis cliquez sur OK. Recherchez ensuite les noms miR-143, miR-145 et miR-154 et ajoutez-les dans le document du détecteur en cliquant sur Ajouter. Cliquez ensuite sur Suivant.
      3. « Configurer la plaque d’échantillonnage » apparaîtra. Sélectionnez les puits pour un détecteur, puis cliquez sur Utiliser pour sélectionner le détecteur correspondant. Cliquez ensuite sur Terminer. L’initialisation du système apparaîtra.
      4. Allez sur l’instrument et réglez la platine, la température et le temps comme mentionné à l’étape 4.2.4. Réglez le volume de l’échantillon sur 20 μL. Démarrez ensuite l’exécution en cliquant sur Démarrer. Enregistrez ensuite la plaque avec un nom à l’endroit souhaité. Le temps estimé s’affichera à l’écran près du bouton de démarrage. Notez le temps.
      5. Une fois l’opération terminée, allez dans Fichier | Exporter | Résultats, et enregistrez les résultats sous forme de valeurs CT à l’emplacement souhaité. Les valeurs CT seront dans .csv fichiers. Ouvrez-le et copiez les valeurs dans un tableur.
   7. Soustraire la moyenne du cycle de seuil triplé (Ct) des échantillons traités par le témoin du véhicule de la Ct moyenne des échantillons traités au TGF-β1 pour calculer ΔCt. Enfin, calculez le changement de pli (FC) des niveaux de miARN à l’aide de la formule ^2-ΔCt. La transformation log2 de la valeur FC peut être utilisée pour la représentation graphique.

Résultats

Nous avons précédemment montré que le TGF-β1 augmentait les niveaux cellulaires totaux des miARN miR-145-5p, miR-143-5p et miR-154-5p dans les cellules CFBE41o-³. Ensuite, nous avons utilisé le test Ago2-miRNA-co-IP pour élucider les effets fonctionnels du TGF-β1 sur ces miARN. Le recrutement RISC de miR-145-5p, miR-143-5p et miR-154-5p a été étudié dans des cellules CFBE41o- exprimant de manière stable le régulateur de conductance transmembranaire de...

Discussion

Le test Ago2-miRNA-co-IP est conçu pour étudier le pool actif de miARN en réponse au traitement par TGF-β1. Les miARN actifs ou associés à RISC sont importants pour comprendre leur potentiel inhibiteur de l’ARNm cible⁴. Panshin et al. ont récemment montré que l’efficacité de l’immunoprécipitation d’Ago2 et des miARN peut dépendre du protocole¹⁶. Il existe plusieurs différences entre le protocole ici et les données publi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM dNTPs (with dTTPs)	Applied Biosystems	4366596
10x Reverse Transcription Buffer (RT Buffer)	Applied Biosystems	4366596
2-propanol	Fisher BioReagents	BP2618-1
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737
7300 Real Time PCR System	Applied Biosystems	4345240
Anti-Ago2 antibody (anti-EIF2C2), mouse monoclonal against human Ago2	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd	RN003M
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	Thermo Scientific	15260037
Collagen I (Purecol-Type I Bovie collagen solution)	Advanced Biometrix	50005-100mL
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	646563-.5ML
DTT	Sigma-Aldrich	646563
Ethanol	Deacon Laboratories	64175
Fetal Bovine Serum	ATLANTA Biologicals	S10350
Goat Anti-Mouse IgG	Bio-Rad	1706516
L-glutamine (200 mM Solution; 29.20 mg/mL)	Corning	25-005-Cl
Mini cell scrapers United Biosystems	Thermo Fisher	MCS-200
Minimal Essential Medium	Thermo Fisher Scientific	11095-080
miRNA specific stem looped RT primers	Applied Biosystems	4427975
Mouse IgG2 control	Dako, Glostrup, Denmark	A0424
MultiScribe Reverse Transcriptase, 50 U/µL	Applied Biosystems	4366596
Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer	NanoDrop Technologies, Inc.	E112352
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
Opti-MEM (1x) Reduced Serum Medium	Gibco by Life Technologies	11058-021
PBS	Gibco	14190250
Penicillin-streptomycin, Sterile	Sigma-Aldrich	P0781
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-Free	Thermo Scientific	A32955
Protein G agarose beads (Pierce Protein G Plus Agarose)	Thermo Scientific	22851
Puromycin	InvivoGen	ant-pr-1
RiboCluster Profiler RIP-Assay Kit for microRNA	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd	RN1005
RNase Inhibitor, 20 U/µL	Applied Biosystems	4366596
TaqMan 2x Universal PCR master mix without AmpErase UNG	Applied Biosystems	4427975
TaqMan miRNA single tube Assay (20x) containing miRNA specific forward/reverse primers and probe	Applied Biosystems	4427975 (assay ID #002278, #002146, and #000477)
TGF-beta1	Sigma	T1654
Transwell filters (24 mm)	Corning Life Sciences Plastic	3412
Veriti 96 Well Thermal Cycler (Model:9902)	Applied Biosystems	4375786