Ago2-miRNA-co-IP 检测研究 TGF-β1 介导的 miRNA 募集到 CFBE 细胞中的 RISC

摘要

在这里，我们描述了 Ago2-miRNA-co-IP 测定，旨在量化人支气管上皮 CFBE41o-细胞中 TGF-β1 诱导的特异性 miRNA 的活性库。该测定提供了 miRNA 募集到 RNA 诱导沉默复合物的功能信息，使用特异性 miRNA 引物和 TaqMan 水解探针通过 qRT-PCR 进行定量。

摘要

Micro（mi）RNA 是短的非编码 RNA，通过转录后机制介导 RNA 干扰 （RNAi）。特异性 miRNA 被募集到细胞质 RNA 诱导的沉默复合物 （RISC） 中。Argonaute2 （Ago2） 是 RISC 的重要组成部分，可促进 miRNA 与 mRNA 上的靶位点结合，然后利用其核酸内切酶活性切割 miRNA-mRNA 双链体。RNAi 由募集到 RISC 的 miRNA 的特定库介导，因此被称为功能库。许多 miRNA 的细胞水平受细胞因子转化生长因子-β 1 （TGF-β1） 的影响。然而，关于 TGF-β1 是否影响这些 miRNA 的功能库知之甚少。本手稿中讨论的 Ago2-miRNA-co-IP 测定旨在检查 TGF-β1 对 miRNA 募集到 RISC 的影响，它有助于确定细胞 miRNA 水平的变化是否与 RISC 相关功能库的变化相关。该测定的一般原则如下。裂解用TGF-β1或载体对照处理的培养细胞，用固定化的抗Ago2抗体免疫沉淀内源性Ago2，用RISC免疫沉淀（RIP）测定试剂盒分离与Ago2复合的活性miRNA。在逆转录过程中，使用 miRNA 特异性茎环引物通过定量逆转录酶聚合酶链反应 （qRT-PCR） 鉴定 miRNA，然后使用 miRNA 特异性正向和反向引物以及 TaqMan 水解探针进行 PCR。

引言

转化生长因子-β1 （TGF-β1） 是一种多功能细胞因子，可以改变许多 micro （mi） RNA 的表达 ^1,2,3。特定 miRNA 的总细胞水平与其抑制潜力无关，因为只有特定部分的 miRNA 被掺入 RNA 诱导沉默复合物 （RISC） 中以执行 RNA 干扰 （RNAi）³。每个 miRNA 中只有高达 10% 与 RISC 相关并参与 RNAi ^4,5。接下来，RNAi 过程涉及 RISC 相关 miRNA 与靶标 mRNA 识别序列的结合⁶。RISC 关联受靶 mRNA 的可用性和 miRNA 与结合位点互补性的影响，通常存在于 mRNA⁴ 的 3' 非翻译区 （UTR）。本手稿中描述的 Argonaute2-miRNA-免疫共沉淀 （Ago2-miRNA-co-IP） 测定旨在通过检测 TGF-β1 处理后 RISC 相关 miRNA 的差异来检查 TGF-β1 对特异性 miRNA 募集到 RISC 的影响，与载体对照相比。检查特定 miRNA 的 RISC 相关功能库比检查 miRNA 的总细胞水平更能提供关于 miRNA 效应的信息。RISC 由扫描靶 mRNA 上的结合位点并切割 miRNA-mRNA 双链体的蛋白质组成。Argonaute2 （Ago2） 是 RISC 的主要成分。在五种 Ago 亚型 （Ago1-Ago5） 中，Ago2 是唯一一种具有核酸内切酶活性并参与人细胞 RNAi 的亚型 7,8,9,10。Ago2-miRNA-RISC 复合体是 miRNA 介导的转录后 mRNA 抑制的功能单位¹¹。Ago2 相关 miRNA 代表 miRNA 响应细胞内或细胞外信号传导的天然状态。因此，内源性 Ago2 的免疫沉淀为检测特定 miRNA 的活性 RISC 相关组分以及其靶标的功能评估提供了极好的机会。该测定优于使用生物素化 miRNA 模拟物下拉内源性靶标 mRNA，因为生物素化核酸分子的细胞摄取效率不可预测及其脱靶效应。

本手稿中讨论的 Ago2-miRNA-co-IP 测定经过优化，以确定 TGF-β1 对永生化人支气管上皮 CFBE41o- 细胞中 miRNA 的 RISC 募集的影响³。RIP 检测试剂盒的组分用于进行 Ago2-miRNA-co-IP 检测，并对制造商提供的方案进行修改。分离方法用于分离小 RNA 和大 RNA，其中小 RNA 在逆转录过程中使用 miRNA 特异性茎环引物进行定量逆转录酶聚合酶链反应 （qRT-PCR） 定量 miRNA，然后使用 miRNA 特异性正向和反向引物以及 TaqMan 水解探针进行 PCR。

研究方案

1. 实验前的准备

1. 接种细胞
   1. 在最低必需培养基 （MEM） 中制备 10% 胶原蛋白 I 溶液，并在 6 孔板中的每个 24 mm 细胞培养过滤器中加入 500 μL。用手轻轻旋转以覆盖过滤器的整个表面。在室温下，在紫外光下，在层流罩中孵育过滤器 30 分钟 （min），然后在 37 °C 的细胞培养箱中孵育 1 小时。
   2. 准备细胞培养基（用 CO₂ 充气 20 分钟、10% 胎牛血清 （FBS）、50 U/mL 青霉素、50 U/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、0.5 μg/mL 嘌呤霉素的 MEM）。
   3. 从培养箱中取出胶原包被的过滤器（步骤 1.1.1）并吸走多余的胶原。在 6 孔板中，将 1.5 mL 细胞培养基（步骤 1.1.2）添加到基底外侧，将 0.5 mL 添加到顶端侧（在过滤器上）。
   4. 接种 1 x 10⁶ 个 CFBE41o- 细胞¹² ，悬浮在 500 μL 细胞培养基中。用手轻轻旋转板，使细胞均匀分布在过滤器上，并在 37 °C 和 5% CO₂ 的细胞培养箱中孵育。
   5. 接种细胞后一天从顶端侧去除培养基，并继续在气液界面中培养细胞（顶端侧无培养基）。每天更换基底外侧培养基，并在^第 8 天进行实验。
2. 用 TGF-β 1 或载体对照处理细胞
   1. 制备不含 FBS 的细胞培养基（不含 FBS 的培养基）：用 5% CO₂ 将 MEM 充气 20 分钟，加入 50 U/mL 青霉素、50 U/mL 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺，并过滤灭菌培养基。
   2. 制备载体对照：将 20 μL 1 M HCl 和 5 mg BSA 添加到 5 mL 双蒸水（4 mM HCl 和 1 mg/mL BSA）中，以获得 1 ng/μL 储备液。过滤器 使用前对混合物进行消毒。
   3. 制备 TGF-β1 溶液：在 1 mL 无菌过滤载体（4 mM HCl 和 1 mg/mL BSA）中重新配制 1 μg 冻干 TGF-β1，以获得 1 ng/μL 储备液。小体积分装并储存在 -20 °C。
   4. 在 15 ng/mL 的无 FBS 培养基中制备工作浓度的 TGF-β1 或载体对照（每 mL 无 FBS 培养基添加 15 μL TGF-β1 或载体对照储备溶液）。从基底外侧吸出细胞培养基，并在实验前 24 小时加入 TGF-β1 或含有培养基的载体对照。
3. 制备用于细胞裂解和免疫沉淀的缓冲液
   1. 准备用于细胞裂解的 mi-Lysis 缓冲液 （+）。将 1 片蛋白酶抑制剂迷你片和每 10 mL 体积的 15 μL 1 M DTT 加入 RIP 检测试剂盒中提供的 mi-Lysis 缓冲液中。
   2. 制备 mi-Wash 缓冲液 （+），用于洗涤蛋白 G 琼脂糖珠。将每 35 mL 体积的 52.5 μL 1 M DTT 添加到 RIP 检测试剂盒中提供的 mi-Wash 缓冲液中。
4. 抗 Ago2 抗体与蛋白 G 琼脂糖珠的偶联
   1. 重复以下程序 3 次，分别洗涤两个 30 μL 等分试样的蛋白 G 琼脂糖珠浆 （50%）：加入 100 μL 冰冷的 PBS，轻轻混合，以 2,000 x g 离心 1 分钟，然后用 200 μL 移液器吸出上清液。
   2. 用 100 μL 冰冷的 mi-Wash 缓冲液 （+） 洗涤磁珠一次，用 200 μL 移液管吸出上清液，向磁珠中加入 500 μL mi-Wash Buffer （+） 并轻轻混匀。将试管放在冰上。
   3. 将 7.5 μg 小鼠单克隆 （IgG2） 抗人 EIF2C2 （Ago2） 抗体（参见 材料表）或非特异性小鼠 IgG2（阴性对照）添加到 mi-Wash 缓冲液 （+） 中的蛋白 G 珠浆液中。
   4. 将试管孵育过夜，在冷藏室中以每分钟 8 转 （rpm） 的速度旋转。

2. Ago2 的免疫沉淀

1. 细胞裂解
   1. 从细胞培养箱中取出含有在 24 mm 过滤器上培养的细胞的板，并将过滤器快速转移到装满冰冷 PBS 的冰板上。让 PBS 溢出到过滤器的顶端侧以覆盖细胞。
   2. 一次一侧，吸出 PBS，然后用冰冷的 PBS 清洗顶端和基底外侧两次。
   3. 吸走所有 PBS，向细胞中加入 300 μL 冰冷的 mi-Lysis 缓冲液 （+），刮擦细胞并转移到标记相应处理条件（TGF-β1 或载体对照）的 1.5 mL 试管中。
   4. 向每个试管中加入 200 μL mi-Lysis 缓冲液 （+） 并彻底涡旋。
   5. 将试管在冰上孵育 15 分钟。
   6. 将试管在 4 °C 下以 14,000 x g 离心 10 分钟，收集上清液作为细胞裂解物，并保持在冰上。
2. 用未偶联的蛋白 G 琼脂糖珠预清除细胞裂解物
   1. 在 1.5 mL 试管中用 100 μL PBS（步骤 1.4.1）洗涤 30 μL 新鲜蛋白 G 琼脂糖珠浆 （50%） 3 次，并去除多余的 PBS。
   2. 用 500 μL mi-Wash Buffer （+） 洗涤磁珠一次，然后用 500 μL mi-Lysis Buffer （+） 洗涤一次。去除多余的缓冲液。
   3. 将步骤 2.1.6 中的细胞裂解物添加到含有未偶联蛋白 G 珠的试管中。
   4. 在冷藏室中旋转 （8 rpm） 试管 1 小时以预清除细胞裂解物。
   5. 预清后，将试管在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 1 分钟。 将预先清除的裂解物作为上清液收集在新鲜试管中并保持在冰上。
   6. 制备免疫沉淀前全细胞裂解物 （WCL），用于通过 western blotting 检测 Ago2 蛋白。取 10 μL 预澄清的裂解物，加入 10 μL 样品缓冲液（含 10% DTT），在 85 °C 下加热 4 分钟，在工作台上冷却，并在 -20 °C 下储存。
3. 使用固定在蛋白 G 琼脂糖珠上的抗 Ago2 抗体对 Ago2 复合物进行免疫沉淀
   1. 将与步骤 1.4.4 中制备的蛋白 G 珠偶联的抗 Ago2 抗体在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 1 分钟，除去上清液并丢弃。用 500 μL mi-裂解缓冲液 （+） 洗涤磁珠一次，像以前一样离心，然后再次弃去上清液。
   2. 将步骤 2.2.6 中 500 μL 的预清除细胞裂解物与与蛋白 G 珠缀合的抗 Ago2 抗体混合，并在冷藏室中旋转孵育 3 小时 （8 rpm）。
   3. 将试管从冰上的冷藏室带到工作台上，并在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 1 分钟。 然后取出并丢弃上清液。
   4. 用含有共免疫沉淀 miRNA 的固定化抗 Ago2 抗体-Ago2 复合物和 1 mL mi-Wash 缓冲液 （+） 洗涤蛋白 G 琼脂糖珠，在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 1 分钟，然后弃去上清液。重复此过程两次。
   5. 用 1 mL mi-Wash 缓冲液 （+） 重悬磁珠，并将 100 μL 浆液提取到新试管中，用于免疫沉淀后蛋白质样品，用于蛋白质印迹。
   6. 将试管在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 1 分钟，然后弃去上清液。
   7. 加入 20 μL 样品缓冲液 （10% DTT），在 85 °C 下加热 5 分钟，混合，并在室温下以 2,000 x g 离心 1 分钟。将样品储存在 -20 °C。
   8. 将步骤 2.3.5 中剩余的 900 μL 固定化抗 Ago2 抗体-Ago2 复合物在 4 °C 下以 2,000 x g 离心管 1 分钟，吸走并弃去上清液。将样品放在冰上。

3. RNA 分离

1. 在接下来的步骤中，为每个样品标记两个 1.5 mL 试管，用于分离小 RNA 和大 RNA，并向每个试管中加入 2 μL mi-solution IV，用于步骤 3.5 和 3.8。
2. 将 RIP 检测试剂盒中的 10 μL 溶液 I 和 240 μL 溶液 II 添加到 1.5 mL 试管中，制备预混液，并将试管保持在室温下。
3. 向每个含有固定化抗 Ago2 抗体-Ago2 复合物（在步骤 2.3.8 中制备）的试管中加入 250 μL 预混液，涡旋，并在室温下以 2,000 x g 离心 1 分钟。
4. 在同一管中加入 150 μL mi-solution III 并充分混合。然后在室温下以 2,000 x g 离心 2 分钟。此步骤的上清液除了含有小 RNA（即总 RNA）外，还含有大 RNA。
5. 小心地将上清液转移到含有 2 μL mi-solution IV 的试管中，在步骤 3.1 中制备。避免用微珠污染上清液以干扰 qRT-PCR。
6. 向每个含有总 RNA 的试管中加入 300 μL 冰冷的 2-popanol，涡旋，旋转，并在 -20 °C 下孵育 2 小时，以实现大 RNA 的最佳沉淀。
7. 在 -20 °C 下孵育后，将样品在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟，以分离分别包含在上清液和沉淀中的小 RNA 和大 RNA。将颗粒放在冰上，直到步骤 3.11。
8. 将含有小 RNA 的上清液转移到步骤 3.1 中制备的试管中（含有 2 μL mi-solution IV），并加入 500 μL 冰冷的 2-丙醇，涡旋并旋转。
9. 将上清液在 -20 °C 下孵育过夜，以实现小 RNA 的最佳沉淀。
10. 第二天，从-20°C冰箱中取出含有小RNA的试管，并在4°C下以12,000 x g 离心10分钟。 吸出上清液，不干扰沉淀，并按照步骤 3.11 洗涤含有大部分小 RNA 的沉淀。
11. 分别用 500 μL 冰冷的 70% 乙醇冲洗含有大 RNA（步骤 3.7）和小 RNA（步骤 3.10）的沉淀。将沉淀与冰冷的 70% 乙醇缓慢混合，然后在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 3 分钟。 小心吸出上清液，不要干扰沉淀。再次重复洗涤过程。
12. 用较小体积（10 μL 或 20 μL）的移液管吸出剩余的乙醇，并在室温下在无 RNase 的环境中风干 30 分钟。
13. 加入 50 μL 不含核酸酶的水并在 65 °C 下加热 5 分钟，重构小 RNA 和大 RNA 沉淀。然后将 RNA 储存在 -80 °C 直至进一步使用，通过纳米滴检查RNA的质量和浓度后。

4. 通过定量逆转录聚合酶链反应 （qRT-PCR） 定量 miRNA

1. 通过使用 miRNA 特异性茎环引物对 miRNA 进行逆转录制备 cDNA
   注：通过标准 qRT-PCR 检测 RNA 需要至少两倍于正向或反向引物长度的模板，每个模板长度约为 20 个核苷酸。因此，最小长度至少为 40 个核苷酸，这使得小 RNA 太短而无法检测。该方案描述了 miRNA 特异性 RT 引物（材料表），其中包含高度稳定的茎环结构，可延长目标 cDNA。正向 PCR 引物增加了核苷酸的额外长度，从而优化了其熔解温度并增强了检测特异性。反向引物破坏茎环¹³。以下方案描述了使用 miRNA 逆转录试剂盒（材料表）将 RNA 对 miR-145-5p、miR-143-5p 和 miR-154-5p 的 RNA RT 到 cDNA。
   1. 通过添加 100 mM dNTP （0.3 μL）、逆转录酶 （2 μL）、10x RT 缓冲液 （3 μL）、RNase 抑制剂 （0.38 μL）、miRNA 特异性环状引物 （6 μL） 和无核酸酶水 （8.32 μL），为每种 miRNA 制备预混液。预混液的总体积为 20 μL。
   2. 对于每个 miR-145-5p、miR-143-5p 和 miR-154-5p 的 cDNA，将步骤 3.13 （50-100 ng） 中的 10 μL 小 RNA 添加到三个单独的 200 μL 试管中。
   3. 将预混液加入小 RNA 中，轻轻混匀，然后旋转至试管底部。将试管保持在冰上，直到加载到热循环仪中。
   4. 在热循环仪中将程序设置为单循环，在 16 °C 下保持 30 分钟，在 42 °C 下保持 30 分钟，在 85 °C 下保持 5 分钟，然后在 4 °C 下保持。 将反应体积设置为 30.0 μL。参见步骤 4.1.6.1。
   5. 将反应管加载到热循环仪中。启动 RT 运行。参见步骤 4.1.6.2。
   6. 打开热循环仪并将试管放入托盘中。它将显示 “System is booting， please wait”。单击 Browse/New methods。通过浏览菜单保存方法并在另一个实验中使用。从之前保存的方法列表中选择并开始运行，或创建“新”方法。将出现 “edit run” method 或 “new” method 屏幕。
      1. 如步骤 4.1.4 中所述编辑温度和周期。通过单击特定阶段或步骤，然后单击添加或删除按钮来添加或删除阶段和步骤。点击 Save 或直接运行该程序。在 “保存运行方法”中，为“运行”方法命名，设置反应体积 （30 μL），将盖板温度设置为 105 °C，保存并退出。
      2. 出现「浏览执行方法」画面时，从「执行方法」列表中选择保存的方法。单击 Start Run（开始）、Run（运行 ），然后再次确认反应体积和覆盖温度。单击 Start Run Now。屏幕将显示样品温度、覆盖温度和剩余时间。完成后记录开始和停止时间，并从热循环仪中取出试管。
         注意：含有 cDNA 的试管可以储存在 -20 °C 中，直到它们进一步用于 miRNA 的 qPCR。
2. 使用 miRNA 特异性正向/反向引物和水解探针进行 qPCR
   注：以下方案用于使用步骤 4.1 中制备的 miRNA 特异性 cDNA 对 miR-145-5p、miR-143-5p 和 miR-154-5p 进行 qPCR。单管 miRNA 检测试剂盒 （20x） 包含 miRNA 特异性正向/反向引物和水解探针（材料表）。正向引物添加核苷酸以增加长度并优化熔解温度，而反向引物破坏 cDNA¹³ 的茎环。通用 PCR 预混液（材料表）提供了 qPCR 所需的其他组分。对于每个 miRNA，反应 （20 μL） 一式三份进行。
   1. 使用相应的 miRNA 检测 （20x） （1 μL）、2x 通用 PCR 预混液（无 AmpErase UNG;10 μL）和无核酸酶的水 （7.5 μL），一式三份制备 miR-145-5p、miR-143-5p 和 miR-154-5p 的单独预混液。一次反应的总体积为 18.5 μL。
   2. 将 4.1 中制备的 miRNA 特异性 cDNA （1.5 μL） 一式三份添加到 PCR 板的每个孔中。
   3. 将步骤 4.2.1 中制备的 miRNA 特异性预混液 （18.5 μL） 添加到含有相应 cDNA （1.5 μL） 的 PCR 板孔中。
   4. 用适当的密封剂密封板，并在 qPCR 热循环仪上运行 qPCR 45 个循环（材料表）。将循环温度设置为保持在 95 °C 10 分钟，然后重复 95 °C 45 次 15 秒 （s） 和 60 °C 60 秒。参见步骤 4.2.6。
   5. 手动设置每个板的 qPCR 曲线基线，并在所有样品的扩增变为对数的点上设置所有 qPCR 运行的标准化阈值。
   6. 打开热循环仪并将 PCR 板放入托盘中。热循环仪机器使用随附计算机上安装的软件进行作。单击系统软件的图标。
      1. 单击 创建新文档 或 打开现有文档 （如果之前保存了文档）。将出现 New document 向导。该测定将是“标准曲线（绝对定量）”。单击 Next（下一步）。
      2. 添加新的检测器。单击 Create Another 将检测器逐个命名为 miR-143、miR-145 和 miR-154。选择报告染料作为 “FAM” for all（所有报告染料），然后单击 Okay（确定）。然后找到名称 miR-143、miR-145 和 miR-154，然后单击 Add（添加）将它们添加到检测器的文档中。然后单击 Next。
      3. 将出现 Set up sample plate（设置样品板）。选择检测器的孔，然后单击 Use （使用 ） 以选择相应的检测器。然后点击 完成.系统初始化将出现。
      4. 转到 仪器 并设置阶段、温度和时间，如步骤 4.2.4 中所述。将样品体积设置为 20 μL。然后单击 Start 开始运行。然后将带有名称的印版保存在所需位置。预计时间将显示在开始按钮附近的屏幕上。记下时间。
      5. 完成后，转到 File | 导出 | 结果，并将结果保存为所需位置的 CT 值。CT 值将位于 .csv 文件中。打开它并将值复制到电子表格文件中。
   7. 从 TGF-β 1 处理的样品的平均 Ct 中减去载体对照处理样品的一式三份阈值循环 （Ct） 的平均值，以计算 ΔCt。最后，使用公式 ^2-ΔCt 计算 miRNA 水平的倍数变化 （FC）。FC 值的 log2 转换可用于图形表示。

结果

我们之前已经表明，TGF-β1 增加了 CFBE41o- 细胞中 miR-145-5p、miR-143-5p 和 miR-154-5p miRNA 的总细胞水平³。接下来，我们采用 Ago2-miRNA-co-IP 测定来阐明 TGF-β1 对这些 miRNA 的功能影响。在稳定表达野生型 （WT） -囊性纤维化跨膜传导调节因子 （CFTR） 或突变型 CFTR 的 CFBE41o- 细胞中研究 miR-145-5p、miR-143-5p 和 miR-154-5p 的 RISC 募集，并在 508 位 （F508del）-CFTR

讨论

Ago2-miRNA-co-IP 测定旨在研究响应 TGF-β 1 处理的 miRNA 活性库。活性或 RISC 相关 miRNA 对于了解它们对靶标^{mRNA 4} 的抑制潜力非常重要。Panshin 等人最近表明，Ago2 和 miRNA 的免疫沉淀效率可能取决于方案¹⁶。这里的协议与上述公布的数据之间存在一些差异。这里的协议针对 CFBE41o - 细胞进行了优化。相比之下，Panshin 等人研究了人血浆或 HEK293 ?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM dNTPs (with dTTPs)	Applied Biosystems	4366596
10x Reverse Transcription Buffer (RT Buffer)	Applied Biosystems	4366596
2-propanol	Fisher BioReagents	BP2618-1
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737
7300 Real Time PCR System	Applied Biosystems	4345240
Anti-Ago2 antibody (anti-EIF2C2), mouse monoclonal against human Ago2	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd	RN003M
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	Thermo Scientific	15260037
Collagen I (Purecol-Type I Bovie collagen solution)	Advanced Biometrix	50005-100mL
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	646563-.5ML
DTT	Sigma-Aldrich	646563
Ethanol	Deacon Laboratories	64175
Fetal Bovine Serum	ATLANTA Biologicals	S10350
Goat Anti-Mouse IgG	Bio-Rad	1706516
L-glutamine (200 mM Solution; 29.20 mg/mL)	Corning	25-005-Cl
Mini cell scrapers United Biosystems	Thermo Fisher	MCS-200
Minimal Essential Medium	Thermo Fisher Scientific	11095-080
miRNA specific stem looped RT primers	Applied Biosystems	4427975
Mouse IgG2 control	Dako, Glostrup, Denmark	A0424
MultiScribe Reverse Transcriptase, 50 U/µL	Applied Biosystems	4366596
Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer	NanoDrop Technologies, Inc.	E112352
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
Opti-MEM (1x) Reduced Serum Medium	Gibco by Life Technologies	11058-021
PBS	Gibco	14190250
Penicillin-streptomycin, Sterile	Sigma-Aldrich	P0781
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-Free	Thermo Scientific	A32955
Protein G agarose beads (Pierce Protein G Plus Agarose)	Thermo Scientific	22851
Puromycin	InvivoGen	ant-pr-1
RiboCluster Profiler RIP-Assay Kit for microRNA	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd	RN1005
RNase Inhibitor, 20 U/µL	Applied Biosystems	4366596
TaqMan 2x Universal PCR master mix without AmpErase UNG	Applied Biosystems	4427975
TaqMan miRNA single tube Assay (20x) containing miRNA specific forward/reverse primers and probe	Applied Biosystems	4427975 (assay ID #002278, #002146, and #000477)
TGF-beta1	Sigma	T1654
Transwell filters (24 mm)	Corning Life Sciences Plastic	3412
Veriti 96 Well Thermal Cycler (Model:9902)	Applied Biosystems	4375786