JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن وصف طريقة لتوليد مكتبات متحولة تشبع transposon في البكتيريا السلبية الغرام وإعداد لاحقة من مكتبات ابيرليكون الحمض النووي لتسلسل عالية الإنتاجية. على سبيل المثال، ونحن نركز على مسببات الأمراض ESKAPE، Acinetobacter baumannii، ولكن هذا البروتوكول هو قابل لمجموعة واسعة من الكائنات الحية سلبية الغرام.

Abstract

إن تسلسل الـ Transposon (Tn-eq) هو طريقة قوية تجمع بين التوازج المُتَرْكَمِيّة المُتَرْكِم والتسلسل المُزَاَتِقِي لتحديد الجينات والمسارات التي تُسهم في اللياقة البدنية الجرثومية في ظل مجموعة واسعة من الظروف البيئية. 31 - إن تطبيقات Tn-eq هي تطبيقات واسعة النطاق ولم تُمكّن فقط من فحص العلاقات بين النمط الجيني والفينوين على مستوى الكائنات الحية، بل أيضاً على مستوى السكان والمجتمع المحلي والنظم. ترتبط البكتيريا السلبية بالجرام ارتباطًا كبيرًا بالأنماط الظاهرية المقاومة للميكروبات ، والتي زادت من حوادث فشل العلاج بالمضادات الحيوية. تُعرَّف مقاومة مضادات الميكروبات بأنها نمو البكتيريا في وجود مضادات حيوية قاتلة. يستخدم الكُليسين المضاد للميكروبات "الخط الأخير" لعلاج العدوى البكتيرية السالبة بالجرام. ومع ذلك ، يمكن أن العديد من مسببات الأمراض سلبية الغرام ، بما في ذلك Acinetobacter baumannii تطوير مقاومة colistin من خلال مجموعة من الآليات الجزيئية ، والتي تم وصف بعضها باستخدام Tn-seq. وعلاوة على ذلك، تختلف مسارات نقل الإشارة التي تنظم مقاومة الكولستين داخل البكتيريا السالبة للجرام. هنا نقترح طريقة فعالة من التحول المطفرة في A. baumannii أن يبسط توليد مكتبة الإدراج transposon تشبع وبناء مكتبة أمليكون من خلال القضاء على الحاجة إلى الإنزيمات تقييد, ربط محول, وتنقية هلام. الأساليب المذكورة هنا ستمكن من التحليل المتعمق للمحددات الجزيئية التي تسهم في اللياقة البدنية A. baumannii عندما تحدى مع colistin. كما ينطبق البروتوكول على مسببات الأمراض الأخرى ESKAPE السلبية للجرام ، والتي ترتبط في المقام الأول بالعدوى التي يتم الحصول عليها من المستشفيات المقاومةللأدوية.

Introduction

اكتشاف المضادات الحيوية هو بلا شك واحدة من الأحداث الأكثر تأثيرا ذات الصلة بالصحة فيالقرن 20. لا تقتصر المضادات الحيوية على حل الالتهابات البكتيرية الخطيرة بسرعة، بل تلعب أيضًا دورًا محوريًا في الطب الحديث. العمليات الجراحية الكبرى، وعمليات زرع وتقدم في طب حديثي الولادة والعلاج الكيميائي ترك المرضى عرضة للعدوى تهدد الحياة وهذه العلاجات لن يكون ممكنا من دون المضادات الحيوية1,2. ومع ذلك ، فإن التطور السريع وانتشار مقاومة المضادات الحيوية بين مسببات الأمراض البشرية قد انخفض بشكل كبير فعالية جميع الفئات الهامة سريريًا من المضادات الحيوية3. العديد من الالتهابات البكتيرية التي تم تطهيرها مرة واحدة بسهولة مع العلاج بالمضادات الحيوية، لم تعد تستجيب لبروتوكولات العلاج الكلاسيكية، مما تسبب في تهديد خطير للصحة العامة العالمية1. مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) هي المكان الذي تنمو فيه الخلايا البكتيرية في تركيزات قاتلة من المضادات الحيوية ، بغض النظر عن مدة العلاج4،5. هناك حاجة ملحة لفهم العوامل الجزيئية والبيوكيميائية التي تنظم العلاج بمضادات الميكروبات، والتي ستساعد على توجيه التنمية البديلة لمضادات الميكروبات. على وجه التحديد، مسببات الأمراض ESKAPE هي إشكالية في البيئات السريرية والمرتبطة AMR واسعة النطاق. وتشمل هذه Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa وEnterobacter spp. في حين أن العديد من الآليات تساهم في AMR في مسببات الأمراض ESKAPE ، فإن الكائنات الأربعة الأخيرة سلبية الغرام.

البكتيريا السلبية الغرام تجميع غشاء خارجي محدد أن يحميهم من الظروف البيئية الضارة. يعمل الغشاء الخارجي كحاجز نفاذي لتقييد دخول الجزيئات السامة، مثل المضادات الحيوية، إلى الخلية. خلافا للأغشية البيولوجية الأخرى، والغشاء الخارجي غير متناظرة. يتم إثراء النشرة الخارجية مع lipopolysaccharide المكشوفة السطح ، في حين أن النشرة الداخلية هي مزيج من الفوسفاتية6. يتم إرساء جزيئات Lipopolysaccharide إلى الغشاء الخارجي من قبل الحفاظ على الدهون A moiety جزءا لا يتجزأ من ثنائي الطبقات الدهنية7. مطلوب من الدهون الكنسي المجال من الإشريكية القولونية lipopolysaccharide لنمو معظم البكتيريا سلبية الغرام ويتم تصنيعها من قبل مسار انزيمي من تسع خطوات التي هي واحدة من المسارات الأساسية الأكثر والحفاظ عليها في الكائنات الحية سلبية الغرام6,7,8.

البوليميكسينات هي الببتيدات المضادة للميكروبات الكاتيونية التي تستهدف نطاق الدهون A من السكاريد الدهنية لاضطرابات الغشاء الخارجي وثقب الخلية. التفاعل الكهربائي بين بقايا مشحونة إيجابيا من البولي الديميسينات والدهون المشحونة سلبا مجموعات الفوسفات تعطل غشاء الخلية البكتيرية مما يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلية9,10,11,12,13. Colistin (بوليميكسين E) هو الملاذ الأخير المضادة للميكروبات المستخدمة لعلاج العدوى الناجمة عن عدة مسببات الأمراض المقاومة للأدوية الغرام سلبية الرضّع، مثل Acinetobacter baumannii14،15،16. اكتشفت لأول مرة في عام 1947 ، يتم إنتاج البوليميكسينات من قبل بكتيريا التربة ، Paenibacillus بوليميكا17،18،19. وقد وصفت polymyxins لعلاج التهابات الغرام السلبية لسنوات قبل استخدامها السريري كان محدودا بسبب تقارير عن nephro كبيرة ،والأعصاب 20،21.

A. baumannii هو مرض الأمراض السلبية الغرام nosocomial التي زادت بشكل كبير من المراضة والوفيات من نتائج المرضى على مدى العقود الأخيرة22. ما كان يعتبر مرة واحدة كمسببات الأمراض منخفضة التهديد، تشكل الآن خطرا كبيرا للعدوى المكتسبة في المستشفى في جميع أنحاء العالم بسبب قدرتها لا يصدق للحصول على AMR وارتفاع خطر الوباء23،24. ألف baumannii مسؤولة عن أكثر من 10 ٪ من الإصابات النوسومية في الولايات المتحدة. يظهر المرض مثل الالتهاب الرئوي، البكتيريا، التهابات المسالك البولية، التهابات الجلد والأنسجة الرخوة، التهاب السحايا، والتهاب الشغاف25. وقد تضاءلت خيارات العلاج لعدوى A. baumannii بسبب المقاومة ضد جميع فئات المضادات الحيوية تقريبا، بما في ذلك β-lactams، الفلوروكينولون، التتراسيكلين، و aminoglycosides23،24. وقد أدى انتشار مقاومة للأدوية المتعددة، ومقاومة للأدوية على نطاق واسع ومقاومة للأدوية A. baumannii عزل إلى عودة في علاج colistin، الذي كان يعتقد أن يكون واحدا من الخيارات العلاجية القليلة المتبقية لا تزال فعالة ضد مقاومة للأدوية المتعددة A. baumannii. ومع ذلك ، زيادة مقاومة colistin بين العزل A. baumannii قد تضخيم تهديدها للصحة العامة العالمية10،11،12،13،27،30،31.

وقد وفرت التطورات الأخيرة في التكنولوجيات ذات الإنتاجية العالية التسلسل، مثل التسلسل transposon (TN-seq)، أدوات هامة لتعزيز فهمنا للياقة البدنية البكتيرية في المختبر وفي الجسم الحي. Tn-seq هي أداة قوية يمكن الاستفادة منها لدراسة التفاعلات ذات النمط الجيني-النمط الظاهري في البكتيريا. TN-seq قابلة للتطبيق على نطاق واسع عبر مسببات الأمراض البكتيرية، حيث يجمع بين التطفرة التقليدية transposon مع تسلسل متوازي ضخمة لمواقع الإدراج خريطة بسرعة، والتي يمكن استخدامها لربط طفرات الحمض النووي إلى المتغيرات الظاهرية على نطاق الجينوم على نطاق32،33،34،35. في حين أن طرق التاطفرة التي تم وصفها سابقاً، فإن الخطوات العامة مماثلة33. أولاً، يتم إنشاء مكتبة إدخال باستخدام التماطيل المُتَرَكَّة، حيث تقتصر كل خلية بكتيرية داخل مجموعة سكانية على إدخال واحد في مادة الـ DNA الجينومية (gDNA). بعد الطفرات، يتم تجميع المسوخ الفردية. يتم استخراج gDNA من تجمع متحولة الإدراج ويتم تضخيم وصلات transposon وتخضع لتسلسل عالي الإنتاجية. تمثل القراءة مواقع الإدراج، والتي يمكن تعيينها إلى الجينوم. إدراج Transposon التي تقلل من اللياقة البدنية تسقط بسرعة من السكان, في حين يتم إثراء عمليات الإدراج المفيدة. TN-seq كان له دور فعال في تعزيز فهمنا لكيفية تأثير الجينات على اللياقة البكتيرية في الإجهاد33.

وقد تم بناء نظام همار 1 للناور بالبوافير المشفّر المشفّر في pJNW684 على وجه التحديد وجرى تحسينه على النحو الأمثل لغرض التوليد المُتَجَدّ. وهو يشمل تبديل -الأسرة البحريةيحيط جين مقاومة كاناميسين, الذي يستخدم لاختيار المسوخ transposon في A. baumannii. كما أنه يشفّر A. baumannii المروج محددة أن يدفع التعبير عن ترميز transposase الجين36. يحتوي transposon أساسًامن البحار أيضًا على جهازي إنهاء تحويلي في اتجاه مجرى النهر من جين مقاومة الكاناميسين ، والذي يمنع القراءة من خلال المصب37من الإدراج . pJNW684 يحمل أيضا RP4/oriT/oriR6K-مشروط أصل النسخ المتماثل الذي يتطلب الجين λpir التي ساهمت بها سلالة المانحة لتكرار38. في غياب الجين λpir، لن يكون الناقل pJNW684 الذي يحمل آلية نقل القدرة على تكرار في سلالة المتلقي A. baumannii 10،36،38. لذلك, أثناء الاقتران بكتيريّة, فقط التبّاجن يكون أدخلت داخل الالجتم جينوم دون خلفيّة إدراج من البلازميّ, أيّ يحمل الpopoase مورثة. وهذا أمر هام لأن فقدان نشاط الـ transposase جنبا إلى جنب مع نتائج البلازميد في واحد, حدث نقل مستقرة التي تمنع transposon من الانتقال إلى مواقع مختلفة بمجرد إدراجها في الجينوم المتلقي.

PJNW648 كما تم اختبار للنشاط في كائن آخر غرام سالبة، E. القولونية. وأشار التجميع الناجح لمكتبة Tn-seq المشبعة في سلالة القولونية W3110 إلى أن النظام قابل لإجراء الطفرات في مجموعة واسعة من مسببات الأمراض ، بما في ذلك Enterobacteriaceae. وعلاوة على ذلك، يمكن بسرعة تبادل المروج A. baumannii محددة التي تدفع التعبير transposase مع المروج الأنواع المحددة. وأخيراً، يمكن استبدال جين مقاومة الكاناميسين بشرائط المقاومة الأخرى، وذلك حسب النمط الظاهري AMR للكائن الحي الذي تجري دراسته.

أحد العوامل التي تساهم في مقاومة الكولستين في A. baumannii هو إدارة جرعات غير كافية ، حيث تتعرض البكتيريا لضغوط انتقائية عند مستويات غير قاتلة39. وأظهرت عدة تقارير أن تركيزات مضادة للميكروبات دون الباطنية يمكن أن تحفز الاستجابات المنظمة التي تغير فسيولوجيا الخلية للحد من قابلية جميع السكان البكتيرية11,12,30,31. باستخدام Tn-seq، اكتشفنا العوامل التي تنظم مقاومة الكليستين في سلالة A. baumannii ATCC 17978 بعد التعرض لتركيزاتمثبطة 10 و subinhibitory من colistin. هذا المثال تفاصيل طريقة Tn-seq التي تبسط بناء وإثراء مكتبة متحولة transposon المشبعة باستخدام الأسرة أساسها marinerمن transposons40،41. في حين أن العديد من بروتوكولات Tn-seq تولد 20،000 - 100،000 المسوخ35،42،43،44،45،46، البروتوكول الموصوف هنا يمكن أن تولد بسرعة مكتبة transposon من 400،000 + المسوخ ، الذي يعادل تقريبا إلى الإدراج transposon كل أزواج 10 قاعدة في A. baumannii10. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع حجم المكتبة دون بذل جهد إضافي كبير. هذه الطريقة أيضا يلغي شرط تقييد endonucleases ، ربط محول وتنقية هلام ، والتي يمكن أن تقلل من تنوع المكتبة النهائية.

Protocol

1. إعداد سلالة بكتيرية

  1. خط "المانح" سلالة(E. القولونية MFD DAP-/ pJNW684، جدول المواد)للمستعمرات المعزولة على Luria-Bertani agar تكملها 600 ميكرومتر ديامينوميليك حمض (DAP)، 100 ملغ/لتر من الأمبيسيلين و 25 ملغم/لتر من kanamycin. احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. باستخدام مستعمرة معزولة واحدة، تلقيح 50 مل من مرق لوريا (LB) تكملها 600 ميكرومتر DAP، 100 ملغ/لتر من الأمبيسيلين و 25 ملغ/لتر من الكاناميسين في قارورة 250 مل إرلينماير وتسميتها بأنها "مانح".
  2. خط "المتلقي" سلالة(أ. baumannii سلالة ATCC 17978 ، جدول المواد) للمستعمرات المعزولة على لوريا - بيرتاني أجار. احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. باستخدام مستعمرة واحدة معزولة، تلقيح 50 مل من LB في قارورة 250 مل Erlenmeyer وتسميتها بأنها "المتلقي".
  3. احتضان كلا الثقافات ("المانحة" و "المتلقي") بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز.

2. التزاوج البكتيري

  1. نقل الثقافات بين عشية وضحاها إلى 50 مل أنابيب المخروطية.
  2. بيليه كل من الثقافات المتلقية والمانحة باستخدام الطرد المركزي في 5000 × ز لمدة 7 دقائق.
  3. تجاهل افرا و resuspend بيليه سلالة "المانحة" في 35 مل من LB تكملها DAP لغسل المضادات الحيوية المتبقية.
  4. بيليه "المانح" خلايا سلالة باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 7 دقائق.
  5. تجاهل عظمى و resuspend بيليه سلالة "المانحة" في 4.5 مل من LB تكملها DAP. استخدام ماصة المصلية 10 مل.
  6. نقل سلالة "المانح" التي أعيد فرضها إلى أنبوب سلالة "المتلقي"، الذي يحتوي على خلايا "المتلقي" الكريات. استخدم نفس ماصات المصلية 10 مل من الخطوة 2.5 لخلط الثقافات. الانتقال فورا إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي للتعليق النهائي 5 مل.
  7. توزيع تعليق التزاوج كما قطرات 100 μL الفردية على لوحات LB agar تكملها DAP (5-7 قطرات لكل لوحة) (الشكل 1A).
  8. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  9. دون إزعاج قطرات، نقل لوحات بعناية إلى حاضنة 37 درجة مئوية والسماح الثقافات لتزاوج لمدة 1ساعة.
    ملاحظة: فترات الحضانة التي تتجاوز 1 ح خطر توليد المسوخ الشقيقة.
  10. بعد الحضانة، إضافة 1.5 مل من LB على كل لوحة والحصاد عن طريق إعادة تعليق البكتيريا من لوحات. استخدام 1 مل ميكروسيبيت لإعادة النيابسيون. يجب أن يكون حجم النهائي حوالي 12 - 15 مل.
  11. الخلايا المحصّاة في أنبوب مخروطي 50 مل.
  12. بيليه الخلايا تزاوج باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 7 دقائق.
  13. تخلص من الخلايا الفائقة والخلايا التي تُدفع في 50 مل من LB لإزالة DAP المتبقية.
  14. بيليه التزاوج باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 7 دقائق.
  15. كرر خطوة الغسيل (الخطوتين 2.13 و 2.14).
  16. باستخدام ماصة 10 مل المصلية، resuspend بيليه في 10 مل من LB تكمل مع 25٪ الجلسرين.
  17. باستخدام الخلايا المغسولة، قم بعمل خمسة عمليات تخفيف متسلسلة في مرق LB (1:10، 1:100، 1:1000، 1:10،000، 1:100,000).
  18. انتشار 100 ميكرولتر من كل تخفيف على 4 لوحات مختلفة باستخدام حبات الزجاج العقيمة: لوريا-بيرتاني أجار تكملها kanamycin، أجار تكملها الأمبيسيلين، أجار تكمل مع DAP و أجار فقط.
  19. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  20. Aliquot التزاوج المتبقي في 1 مل aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. تحديد التخفيف المناسب من مكتبة transposon

  1. سجل وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) من لوحات بين عشية وضحاها.
  2. صورة لوحة مع المستعمرات العد لكل حالة لوحة مختلفة (الشكل 2A).
    ملاحظة: يجب أن تنمو كل من سلالات "المانح" و "المتلقي" على لوحات agar المكملة مع DAP ، لذلك فإن معظم التخفيفات المطلية ستسفر عن حديقة. فقط سلالة "المتلقي" يمكن أن تنمو على لوحات أجار. لا يمكن أن "المانح" ولا "المتلقي" سلالة تنمو على لوحات أجار تكملها ampicillin، لذلك ينبغي أن يكون هناك لا شيء / الحد الأدنى من النمو. فقط الخلايا سلالة الهدف ترميز الإدراج transposon يمكن أن تنمو على لوحات أجار تكملها kanamycin. يجب أن تختلف المستعمرات في الحجم، مما يشير إلى عمليات إدخال transposon في الجينات التي تساهم في اللياقة البدنية على أجار تكملها الكاناميسين.
  3. حساب عدد من المسوخ transposon في التزاوج المجمدة عن طريق عد عدد المستعمرات على لوحات أجار LB تكملها kanamycin.
    ملاحظة: بالنسبة إلى الجينوم A. baumannii (حوالي 4 ميغابت في الثانية)، كان الهدف الحصول على حوالي 400،000 مستعمرات من أجل إنشاء مكتبة متحولة عالية الدقة (تقريباً زوج واحد من أزواج قاعدة إدخال transposon/10). ومع ذلك، ينبغي أن يكون هذا العدد الأمثل على أساس حجم الجينوم للأنواع المستهدفة).

4. توليد مكتبة متحولة البكتيرية النهائية

  1. ذوبان aliquot من التزاوج المجمدة على الجليد.
  2. لوحة التزاوج على 150 ملم لوريا- برتاني أجار لوحات تكملها kanamycin على أساس CFUs تحسب في الخطوة 3.1. ضبط مستوى الصوت مع LB لتسفر عن 13333 مستعمرات لكل 150 ميكرولتر قبل الطلاء.
    ملاحظة: تم تحديد عدد CFU هنا ليكون حوالي 105 CFU / مل، لذلك تم تعديل حجم التزاوج للحصول على 13333 مستعمرة لكل لوحة لأن هذا من شأنه أن يوفر العدد الأمثل من المستعمرات على 30 لوحة لمكتبة متحولة عالية الدقة دون اكتظاظ الصفائح.
  3. استخدام حبات الزجاج المعقمة لنشر 150 ميكرولتر من التخفيف لكل لوحة على 30 × 150 ملم لوريا- Bertani أجار لوحات تكملها kanamycin للحصول على 400،000 المستعمرات(الشكل 1C).
    ملاحظة: يمكن استخدام قضبان معقمة أو أي نوع من أداة المُعممة (أي الخرز الزجاجي) لنشر البكتيريا على الألواح.
  4. تخلص من الأنبوب المستخدم الذي يحتوي على تزاوج زائد.
    ملاحظة: دورات التجميد/الذوبان تضيف ضغوطًا انتقائية على الثقافة البكتيرية، والتي يمكن أن تحرف نتائج تجربة Tn-seq. استخدام aliquot الطازجة في كل مرة.
  5. احتضنت لوحات في 37 درجة مئوية ل 14 ساعة.
    ملاحظة: تم تحسين وقت الحضانة لمنع فرط النمو (لمس المستعمرات). ويقترح تقليل النمو عن طريق تقليل وقت الحضانة.

5- تقدير كثافة المكتبة وتجميعها للتخزين

  1. عد وحدات CFUs على كل لوحة لتقدير إجمالي المسوخ في مكتبة ال transposon. عد 20٪ من لوحات 3 على الأقل لتحديد تقدير عدد المستعمرات لمجموعة كاملة من لوحات (الشكل 2A). تأكد من أن المستعمرات لا تلمس مستعمرة أخرى.
  2. بعد حساب العائد المقدر للمستعمرة، أضف 3-5 مل من LB (أو أكثر إذا لزم الأمر) إلى كل لوحة وكشط من البكتيريا باستخدام أداة كشط معقمة.
    ملاحظة: تم استخدام حلقات التلقيح العقيمة لتكشط اللوحات بكفاءة.
  3. تجمع تعليق البكتيرية من جميع لوحات في أنابيب مخروطية مل 50 (الشكل 1D). وهذا يتطلب عدة 50 مل أنابيب المخروطية, على الأقل 3.
  4. بيليه تجمع تعليق البكتيرية باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 7 دقائق.
  5. تجاهل بيليه عظمى و resuspend في 5 مل من LB تكملها مع 30٪ الجلسرين.
  6. Aliquot 1 مل من مكتبة transposon في التبريد وتخزينها في -80 درجة مئوية.

6. تحديد العوامل التي تنظم مقاومة الكُلستين في A. baumannii

  1. إعداد 4 × 250 مل قارورة Erlenmeyer مع كل تحتوي على 50 مل LB مرق وتسمية كما (الشكل 2B)
    1. A. baumannii سلالة ATCC 17978 مكتبة Tn-seq; (-) colistin_1
    2. A. baumannii سلالة ATCC 17978 مكتبة Tn-seq; (-) colistin_2
    3. A. baumannii سلالة ATCC 17978 مكتبة Tn-seq; (+) colistin_1
    4. A. baumannii سلالة ATCC 17978 مكتبة Tn-seq; (+) colistin_2
      ملاحظة: في النمو التحدي الموضح هنا، كل شرط، (-) colistin التحكم و (+) colistin التحدي، ويجري اختبار مكررة. ولذلك، يتطلب الإعداد 4 × 250 مل قارورة Erlenmeyer، واثنين في حالة.
  2. أضف 50 ميكرولتر من 0.5 ملغم/لتر كليستين إلى (+) قارورة كوليستين (6.1.3 و6.1.4) و50 ميكرولتر من الماء إلى قارورة colistin (-) (6.1.1 و6.1.2).
  3. ذوبان المجمدة Tn-seq مكتبة aliquot من الخطوة 5 على الجليد.
  4. ماصة 1 μL من المكتبة المذابة في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  5. قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600)وضرب من قبل 1،000.
    ملاحظة: هذا يحدد OD600 من 1 ميكرولتر من مكتبة Tn.
  6. استناداً إلى الحساب في الخطوة 6.5، تلقيح كل قارورة تحتوي على 50 مل LB إلى OD النهائي600 0.001.
  7. تنمو الثقافات في حاضنة تهتز في 37 درجة مئوية إلى OD600 0.5.
    ملاحظة: من المهم أن تظل الثقافات في مرحلة النمو اللوغاريتمي، لذلك إذا كانت السلالة الخاصة بك في600 OD مختلفة أثناء النمو الأسي، فإن OD600 يحتاج إلى تعديل لضمان تكرار الثقافة عدة مرات ممكنة في مرحلة النمو اللوغاريتمي. إذا كانت الثقافة يكرر فقط 3 مرات، وتوج القدرة على الكشف عن عيوب اللياقة البدنية في المسوخ في الاختلافات 3 أضعاف، من الناحية النظرية. منذ البكتيريا المختلفة لها أوقات مضاعفة مختلفة، من المهم أن بذور الثقافات في ثابت OD600 لتطبيع inoculum البداية. وهذا يضمن التمثيل المتسق للمكتبة بأكملها في جميع الثقافات.
  8. حصاد الثقافات باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  9. إزالة افرات وغسل مع 50 مل من برنامج تلفزيوني.
  10. بيليه باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  11. إزالة افرا و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني. Aliquot ~ 200 ميكرولتر في 5 أنابيب microcentrifuge.
  12. بيليه باستخدام الطرد المركزي في 5000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إزالة كل من فائقة باستخدام تلميح ماصة.
  13. تخزين الكريات في -20 درجة مئوية أو المضي قدما مع استخراج gDNA.

7. استخراج gDNA

  1. ذوبان بيليه خلية واحدة على الجليد.
  2. إضافة 0.6 مل تحلل العازلة(جدول المواد)ودوامة لإعادة بناء الكريه تماما.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. إضافة 0.6 مل من الفينول / الكلوروفورم / ايساميل الكحول إلى العينة ودوامة بقوة.
  5. مراحل منفصلة باستخدام الطرد المركزي في الطرد الجزئي في سرعة قصوى في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. نقل المرحلة مائي العلوي إلى أنبوب جديد. تجنب إزعاج واجهة المرحلة أثناء النقل.
  7. إضافة حجم متساو من الكلوروفورم إلى المرحلة مائي الحصول عليها أعلاه ودوامة بقوة.
  8. مراحل منفصلة باستخدام الطرد المركزي في microcentrifuge في سرعة قصوى في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  9. نقل المرحلة مائي العليا إلى أنبوب جديد.
    ملاحظة: تأكد من تجنب إزعاج الواجهة أثناء النقل.
  10. إضافة 2.5x حجم المرحلة مائي من الإيثانول البارد 100 ٪ ومزيج بلطف. الحمض النووي المُعجل سيكون مرئياً
  11. ضع الأنبوب عند -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
  12. بيليه الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي في سرعة قصوى في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  13. إزالة بعناية supernatant دون إزعاج بيليه الحمض النووي وغسل مع 150 ميكرولتر من 70 ٪ من الإيثانول عن طريق الأنابيب.
  14. بيليه الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي في سرعة قصوى في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  15. إزالة بعناية فائقة.
  16. كرر الخطوة 7.14 مرة واحدة. إزالة بعناية كل الإيثانول المتبقية.
  17. الحمض النووي الجاف عن طريق احتضان في غرفة درجة الحرارة لمدة 5-10 دقيقة.
  18. Resuspend الحمض النووي بيليه في 100 μL TE العازلة عن طريق الأنابيب.

8. الحمض النووي القص (الشكل 3A)

  1. تخفيف gDNA مع TE العازلة إلى تركيز 250 نانوغرام / مل في حجم إجمالي 200 ميكرولتر.
  2. ضع أنابيب في حمام مائي sonicator.
  3. سونيكات الحمض النووي إلى إنتاج شظايا من حوالي 300 نوكليوتيدات. السلطة: 60 ٪ ، إجمالي الوقت: 20 دقيقة ، دورات: 10 ق ON و 10 ق OFF عند 4 درجة مئوية(الشكل 3A).
  4. تأكيد الحمض النووي هو القص بشكل مناسب عن طريق فصل 10 ميكرولتر من الحمض النووي غير المُشحَن و10 ميكرولتر من الحمض النووي المُشَرَّد على هلام agarose بنسبة 1%. تكرار سونيكيشن أو تحسين حسب الحاجة (الشكل 3B).

9. بولي - C الذيل بالإضافة إلى نهاية 3 '(الشكل 3A)

  1. إعداد بولي جيم رد فعل وفقا للجدول 1.
  2. احتضنت رد فعل في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. تنقية تفاعل بولي-C مع 40 ميكرولتر من الخرز شبه المهاج لاختيار الحجم(الشكل 3A)باتباع الخطوات التالية.
    1. إضافة 40 ميكرولتر من الخرز شبه المغناطيسي اختيار حجم لكل عينة. دوامة ~ 5 ق أو ماصة صعودا وهبوطا.
    2. عينات احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. لفترة وجيزة، أنابيب الطرد المركزي لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب (~ 2 s).
    4. نقل أنابيب إلى رف المغناطيسي واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل ~ 2 دقيقة حتى الحل هو واضح.
    5. مع أنابيب على رف المغناطيسي، وإزالة بعناية فائقة.
    6. مع أنابيب على رف المغناطيسي، إضافة 200 ميكرولتر من الطازجة 80 إعداد الإيثانول ٪(لا تزعج الخرز).
    7. عينات احتضان لمدة 30 s على الأقل حتى حل واضح.
    8. مع أنابيب على رف المغناطيسي، وإزالة بعناية فائقة.
    9. كرر خطوة الغسيل (الخطوات 9.3.6 - 9.3.8).
    10. جمع السائل في الجزء السفلي من أنبوب باستخدام خطوة الطرد المركزي وجيزة (~ 2 s).
    11. نقل أنابيب إلى رف المغناطيسي وإزالة أي السائل المتبقية.
    12. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقيقة إلى عينات الجافة. لا أكثر من الجافة.
    13. إزالة أنابيب من رف المغناطيسي وإضافة 25 ميكرولتر من الماء لكل. دوامة ل ~ 5 ق أو ماصة صعودا وهبوطا.
    14. لفترة وجيزة، أنابيب الطرد المركزي لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب (~ 2 s).
    15. نقل أنابيب إلى رف المغناطيسي والسماح للجلوس لمدة ~ 2 دقيقة حتى الحل هو واضح.
    16. مع أنابيب على الرف المغناطيسي، وإزالة السائل دون إزعاج الخرز ونقلها إلى أنبوب جديد (~ 23 ميكرولتر من الحمض النووي).

10. تضخيم وصلة Transposon (الشكل 3A)

  1. إعداد PCR 1 كما هو موضح في الجدول 1 لـ PCR المتداخلة الأولى(الجدول 2).
  2. تنفيذ PCR 1 باستخدام الشروط الموضحة في الجدول 1.
  3. تنقية منتجات PCR مع 40 ميكرولتر من الخرز شبه المغناطيسي لاختيار الحجم (الخطوات 9.3.1 - 9.3-12). إلوت في 50 ميكرولتر من الماء (الخطوات 9.3.13 - 9.3.16). عند هذه النقطة يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
  4. إعداد Streptavidin إلى جانب البارامغناطيسية الخرز:
    1. ريسوسبيند Streptavidin الخرز عن طريق هز بقوة.
    2. إضافة 32 ميكرولتر من الخرز لكل عينة إلى أنبوب جديد microcentrifuge.
      ملاحظة: يمكن إعداد الخرز لـ 6 + عينات في أنبوب واحد.
    3. نقل أنبوب إلى رف مغناطيسي. احتضان لمدة 2 دقيقة ~ حتى الحل هو واضح.
    4. مع أنبوب على رف المغناطيسي، وإزالة فائقة.
    5. إزالة أنبوب من رف المغناطيسي. غسل الخرز عن طريق resuspending في 1 مل 1X B&W العازلة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
    6. نقل أنبوب إلى رف المغناطيسي. احتضان لمدة 2 دقيقة ~ حتى الحل هو واضح.
    7. مع أنبوب على رف المغناطيسي، وإزالة عظمى.
    8. كرر خطوة الغسيل مع 1 مل 1x B&W العازلة (الخطوات 10.4.5 - 10.4.7) مرتين أكثر لمجموع 3 يغسل.
    9. إزالة أنبوب من رف المغناطيسي والخرز resuspend في 52 ميكرولتر من 2X B&W العازلة لكل عينة.
  5. الجمع بين 50 ميكرولتر من الخرز المعد مع 50 ميكرولتر من PCR1 المنقى (من الخطوة 10.3). ماصة لخلط.
  6. تدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  7. غسل بعيدا الحمض النووي غير منضم:
    1. لفترة وجيزة، الطرد المركزي لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب (~ 2 s).
    2. نقل أنبوب إلى رف المغناطيسي. احتضان لمدة 2 دقيقة ~ حتى الحل واضح.
    3. مع أنبوب على رف المغناطيسي، وإزالة عظمى.
    4. إزالة أنبوب من رف المغناطيسي، وغسل الخرز عن طريق resuspending في 100 μL 1X B&W العازلة و pipetting صعودا وهبوطا.
    5. نقل أنبوب إلى رف المغناطيسي. احتضان لمدة 2 دقيقة ~ حتى الحل واضح.
    6. مع أنبوب على رف المغناطيسي، وإزالة فائقة.
    7. كرر خطوات الغسيل مع 100 ميكرولتر لوتي (الخطوات 10.7.4 - 10.7.6) مرتين أكثر من ذلك لمجموع 3 يغسل.
  8. إعداد PCR 2 كما هو موضح في الجدول 1 لتضخيم وصلات transposon وإضافة الباركود واحد لكل عينة(الجدول 2 والجدول 3).
  9. تنفيذ PCR 2 باستخدام الشروط الموضحة في الجدول 1.
  10. تنقية مع 40 ميكرولتر من اختيار حجم الخرز شبه المغناطيسي (الخطوات 9.3.1 - 9.3.12). Elute في 17 ميكرولتر من الماء (الخطوات 9.3.13 - 9.3.16)، جمع ~ 15 ميكرولتر.
  11. كمّي تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور. وينبغي أن تكون التركيزات النهائية ~ 50 إلى 250 نانوغرام /ميكرولتر.
  12. تقييم جودة الحمض النووي باستخدام الكهربة الشعرية القائمة على رقاقة (الشكل 4A).

النتائج

تصف الطرق المبينة توليد مكتبة نقل عالية الكثافة في سلالة A. baumannii ATCC 17978 من خلال الاقتران البكتيري باستخدام E. coli MFD DAP-، الذي يكرر pJmid pJNW684 (الشكل 4B). البروتوكول المفصل يستخدم الاقتران البكتيرية ثنائية الوالدين لنقل pJNW684 من سلالة E. القولونية λpir+ المانح...

Discussion

A. baumannii هو تهديد ناشئ للصحة العامة العالمية بسبب الاكتساب السريع لـ AMR ضد العلاجيات "الخط الأخير" مثل colistin10,11,12,23,24,30,31. في العقود الأخيرة، Tn-seq لعبت دورا حاسما ...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من المعهد الوطني للصحة (منحة AI146829 إلى J.M.B.) وهو أمر يلقى التنويه به.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-TriphosphateAffymetrix77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-TriphosphateInvitrogen10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight MarkerPromegaPR-G2101
100mm x 15mm Petri DishesCorning351029
150mm x 15mm Petri DishesCorning351058
1X B&WN/AN/ADilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acidAlfa AesarB2239103used at 600 µM
2X B&WN/AN/AAdd 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTPN/AN/A9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA PolymeraseInvitrogen12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978ATCCN/AAmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)Fisher ScientificBP1760used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification systemBECKMAN COULTERA63881
BioAnalyzerAgilentG2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA AnalysisAgilent5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)New England Biolabs (NEB)N0447L
DynaMag-2 Magnetic rackInvitrogen12321D
E.coli MFD Dap-N/AN/ADAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
EthanolFisher ScientificA4094
Externally Threaded Cryogenic VialsCorning09-761-71
Glass beadsCorning72684
GlycerolFisher ScientificG33
Inoculating loopsFisher Scientific22-363-602Scraping tool
KanamycinFisher ScientificBP906used at 25 mg/L
LB agar, MillerFisher ScientificBP1425
LB broth, MillerFisher ScientificBP1426
LoTEN/AN/AAdd 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis bufferN/AN/A9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)Fisher ScientificBP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X SolutionFisher ScientificBP39920Diluted to 1X
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33238
Qubit Assay TubesThermo FisherQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851
Sonicator with refridgerated waterbathQsonica SonicatorsQ2000FCE
Streptavidin Magnetic BeadsNew England Biolabs (NEB)S1420S
TE bufferN/AN/A10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)PromegaPR-M1875

References

  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. . The antimicrobial drugs. , (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478 (2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263 (1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24 (1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503 (2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28 (2017).
  30. Chin, C. -. Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163 (2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578 (2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033 (2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291 (2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251 (2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315 (2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298 (2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161transposonAcinetobacter baumanniicolistinESKAPE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved