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요약

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

초록

트랜스포슨 시퀀싱(Tn-seq)은 광범위한 환경 조건하에서 세균 적합성에 기여하는 유전자와 경로를 식별하기 위해 트랜스포슨 돌연변이 발생과 대규모 병렬 시퀀싱을 결합한 강력한 방법입니다. Tn-seq 응용 프로그램은 광범위하고 유기체 수준에서 뿐만 아니라 인구, 지역 사회 및 시스템 수준에서 유전자형 표현형 관계의 검사를 가능하게했다. 그람 음성 박테리아는 항균 저항 표현형과 매우 관련이 있으며, 이는 항생제 치료 실패의 인시던트를 증가시켰습니다. 항균 저항은 그렇지 않으면 치명적인 항생제의 존재에 세균성 성장으로 정의됩니다. "마지막 줄" 항균 colistin 그람 음성 세균 감염을 치료 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 아신토박터 baumannii를 포함한 몇몇 그람 음성 병원체는 Tn-seq를 사용하여 특징지어진 분자 기계장치의 범위를 통해 colistin 저항을 개발할 수 있습니다. 또한, colistin 저항을 조절 하는 신호 변환 경로 그람 부정적인 박테리아 내에서 변화. 여기서 는 제한 효소, 어댑터 리칭 및 젤 정화의 필요성을 제거하여 포화 트랜스포온 삽입 라이브러리 및 앰플리션 라이브러리 건설의 생성을 간소화하는 A. baumannii에서 트랜스포슨 돌연변이 발생의 효율적인 방법을 제안합니다. 본 원에 기재된 방법은 colistin에 도전할 때 A. baumannii 피트니스에 기여하는 분자 결정요인의 심층분석을 가능하게 할 것이다. 프로토콜은 또한 그밖 그람 음성 ESKAPE 병원체에 적용됩니다, 주로 약 저항하는 병원 취득한 감염과연관됩니다.

서문

항생제의 발견은 의심 할 여지없이 20세기의 가장 영향력있는 건강 관련 사건 중 하나입니다. 항생제는 심각한 세균 감염을 신속하게 해결할 뿐만 아니라 현대 의학에서도 중추적인 역할을 합니다. 신생아 의과 및 화학요법의 주요 수술, 이식 및 어드밴스는 생명을 위협하는 감염에 취약한 환자를 남겨두고 이러한 치료법은 항생제1,,2없이는 불가능할 것이다. 그러나, 인간 병원체 중 항생제 내성의 급속한 발달 및 확산은 항생제3의모든 임상적으로 중요한 클래스의 효능을 현저히 감소시켰습니다. 한 번 쉽게 항생제 치료로 삭제 된 많은 세균 성 감염, 더 이상 글로벌 공중 보건에 심각한 위협을 일으키는 고전적인 치료 프로토콜에 응답하지않습니다 1. 항균 성 내성 (AMR)은 치료 기간4,,5에관계없이 세균 세포가 항생제의 치명적인 농도에서 성장하는 곳입니다. AMR을 조절하는 분자 및 생화학적 요인을 이해해야 하는 긴급한 필요성이 있으며, 이는 대체 항균 발달을 안내하는 데 도움이 될 것입니다. 특히, ESKAPE 병원체는 임상 환경에서 문제가 있으며 광범위한 AMR과 관련이 있습니다. 여기에는 Enterococcus faecium, Staphylococcus 아우레우스, K렙시엘라 폐렴, 시네토박터바우마니, P수도모나스 아에루기노사 및 Enterobacter spp가 포함됩니다. 몇몇 기계장치는 ESKAPE 병원체에 있는 AMR에 기여하는 동안, 후자의 4개의 유기체는 그람 음성입니다.

그람 음성 박테리아는 불리한 환경 조건으로부터 그들을 보호하는 정의 외부 막을 조립합니다. 외부 막은 항생제와 같은 독성 분자의 진입을 세포로 제한하는 투과성 장벽역할을 합니다. 다른 생물학적 멤브레인과 달리 외부 막은 비대칭입니다. 외부 전단지는 표면에 노출된 리포폴리사카라이드로 풍부하고, 내부 전단지는 인지질6의혼합물이다. 지질성 당항 분자는 지질 이중층7내에 내장된 보존된 지질 A moiety에 의해 외부 막에 고정된다. 에세리치아 대장균 리포폴리사카라이드의 정식 지질 은 대부분의 그램 음성 박테리아의 성장에 필요하며 그람 음성 유기체에서 가장 근본적이고 보존된 통로 중 하나인 9단계 효소 경로에 의해 합성된다6,,7,,8.

다묘신은 외막을 교란시키고 세포를 분해하기 위해 지질 A 도메인을 표적으로 하는 양이온 항균 펩티드입니다. 폴리마이신의 양전하 잔류물과 음전하 지질 A 인산염 군 사이의 정전기 상호 작용은 궁극적으로 세포사멸9,,10,,11,,12,,13로이어지는 세균세포막을 방해한다. Colistin (polymyxin E)는 아신토박터 baumannii14,,15,,16과같은 다약물 내성 그람 음성 외유성 병원균으로 인한 감염을 치료하는 데 사용되는 최후의 수단 항균제이다. 1947년에 처음 발견된 폴리마이신은 토양 박테리아인 파니바실러스 폴리멕사17,,18,,19에의해 생산된다. 다각형은 중요한 신증후군 및 신경독성20,,21의보고 때문에 그들의 임상 사용이 제한되기 전에 년 동안 그람 음성 감염을 취급하기 위하여 처방되었습니다.

A. baumannii는 최근 수십 년 동안 환자 결과의 이환율과 사망률을 극적으로 증가시킨 nosocomial Gram 음성 병원체입니다22. 한 때 저위협 병원체로 여겨졌던 것은, 이제 AMR을 취득하는 놀라운 능력과 전염병23,,24의고위험 때문에 전 세계적으로 병원 취득한 감염에 대한 중요한 위험을 제기합니다. A. baumannii는 미국에서 nosocomial 감염의 10% 이상을 차지합니다. 질병은 폐렴, 세균, 요로 감염, 피부 및 연조직 감염, 뇌막염 및 내막염(25)으로나타납니다. A. baumannii 감염에 대한 치료 옵션은 β- lactams, 불소 퀴놀론, 테트라사이클린 및 아미노 글리코 사이드23,,24를포함하여 거의 모든 항생제 클래스에 대한 저항으로 인해 감소되었습니다. 다약물 내성, 광범위하게 약물 내성 및 범약 내성 A. baumannii 격리의 보급은 colistin 치료에 부활을 주도하고있다, 이는 여전히 다약물 내성 A. baumannii에대한 효과적인 몇 가지 남아있는 치료 옵션 중 하나가 될 것으로 생각되었다. 그러나, A. baumannii 격리 중 증가 된 colistin 저항은 글로벌 공중 보건,10,11,,12,13,27,,,,30,,31에대한 위협을 더욱 증폭시켰다.30

트랜스포슨 시퀀싱(Tn-seq)과 같은 고처리량 시퀀싱 기술의 최근 발전은 시험관 내 및 생체 내 세균 적합성에 대한 이해를 증진시키는 중요한 도구를 제공했습니다. Tn-seq는 박테리아에서 유전자형 표현형 상호 작용을 연구하기 위해 활용할 수 있는 강력한 도구입니다. Tn-seq는 기존의 트랜스포손 돌연변이 발생과 대규모 병렬 시퀀싱을 결합하여 삽입 부위를 빠르게 매핑하는 세균 병원체 전반에 광범위하게 적용되며, 이는 DNA 돌연변이를 게놈 전체 척도32,,33,,34,35에대한 페노티픽 변이체에 연결하는 데 사용될 수 있다., 트랜스포슨 돌연변이 발생 방법은 이전에 설명되었지만 일반적인 단계는33과유사합니다. 첫째, 삽입 라이브러리는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 사용하여 생성되며, 인구 내의 각 세균 세포는 게놈 DNA(gDNA) 내의 단일 트랜스포슨 삽입으로 제한됩니다. 돌연변이 발생 에 따라 개별 돌연변이가 풀로 들어오게됩니다. gDNA는 삽입 돌연변이 풀에서 추출되고 트랜스포슨 접합은 증폭되고 고처리량 시퀀싱을 받습니다. 판독은 게놈에 매핑될 수 있는 삽입 부위를 나타냅니다. 체력을 감소시키는 트랜스포슨 삽입은 인구에서 빠르게 떨어지고 유익한 삽입은 풍부합니다. Tn-seq는 유전자가 스트레스33에서세균 성 피트니스에 미치는 영향에 대한 이해를 증진시키는 데 중요한 역할을해 왔습니다.

pJNW684에 인코딩된 히마1 마리너 트랜스포슨 시스템은 트랜스포슨 돌연변이 발생을 목적으로 특별히 제작및 최적화되었다. 그것은 A. baumannii에서 트랜스포슨 삽입 돌연변이의 선택에 사용되는 카나마이신 저항 유전자를 측면에 선원- 가족 트랜스 포슨을 포함한다. 또한 트랜스포사제 인코딩유전자(36)의발현을 구동하는 A. baumannii 특정 프로모터를 인코딩한다. 마리너기반 트랜스포슨은 또한 삽입37의판독 다운스트림을 방지하는 카나마이신 저항 유전자의 하류에 두 개의 번역 종기를 포함한다. pJNW684는 또한38을복제하기 위해 기증자 균주에 의해 기여된 λpir 유전자를 필요로 하는 복제의 RP4/oriT/oriR6K-조건부 기원을 전달한다. λpir 유전자가 없는 경우, 전치 기계를 운반하는 pJNW684 벡터는 A. baumannii 수신자 균주10,,36,,38에서복제할 수 없다. 따라서, 세균성 컨쥬게이션 도중, 트랜스포지온만이 트랜스포지아제 유전자를 운반하는 플라스미드의 배경 삽입 없이 수신자 게놈에 삽입된다. 이것은 플라스미드와 함께 트랜스포지아제 활동의 손실이 수신자 게놈에 삽입되면 트랜스포슨이 다른 위치로 이동하는 것을 방지하는 단일, 안정적인 전치 이벤트에서 결과하기 때문에 중요합니다.

pJNW648은 또 다른 그램 음성 유기체인 대장균에서의활성을 테스트하였다. 대장균 균주 W3110에서 포화 Tn-seq 라이브러리의 성공적인 조립은 시스템이 엔테로박테리아를 포함한 광범위한 병원균에서 돌연변이 발생을 수행할 수 있음을 나타냈다. 또한 트랜스포세아제 발현을 구동하는 A. baumannii 특정 프로모터는 종별 프로모터와 신속하게 교환할 수 있습니다. 마지막으로, 카나마이신 저항 유전자는 연구 중인 유기체의 AMR 표현형에 따라 다른 저항 카세트로 교환될 수 있다.

A. baumannii에서 colistin 저항에 기여하는 한 가지 요인은 박테리아가 비 치명적인 수준에서 선택적 압력에 노출되는 불충분한 복용량의 관리입니다39. 여러 보고서는 억제 항균 농도가,전체 세균,집단11,12,30,31의감수성을 감소시키기 위해 세포 생리학을 변화시키는 조절된 반응을 유도할 수 있음을 보여주었다., Tn-seq를 사용하여, 우리는 A. baumannii 균주 ATCC 17978에 있는 colistin 저항을 조절하는 요인을 발견10 및 colistin의 억제 농도에 노출 한 후.10 이 예제에서는 선원기반 트랜스포슨제품군(40,,41)을사용하여 포화 트랜스포손 돌연변이 라이브러리의 구성 및 농축을 간소화하는 Tn-seq 방법을 자세히 설명합니다. 여러 Tn-seq 프로토콜은 20,000 - 100,000 돌연변이35,,42,,43,,44,,45,,46을생성하는 반면, 본원에 설명된 프로토콜은 400,000+ 돌연변이의 트랜스포슨 라이브러리를 신속하게 생성할 수 있으며, 이는 대략10개의베이스 10쌍의 아포 스트랜톤 삽입과 동일합니다. A. baumannii 또한, 라이브러리 크기를 크게 추가없이 확장할 수 있습니다. 이 방법은 또한 최종 라이브러리 다양성을 줄일 수있는 제한 엔토넥션, 어댑터 결찰 및 젤 정화에 대한 요구 사항을 제거합니다.

프로토콜

1. 세균 균주 준비

  1. 루리아-베르타니 한천에 분리된 콜로니에 대한 "기증자" 균주(E.coli MFD DAP-/pJNW684, 재료 의 표)를600 μM 디아미노피멜산(DAP), 100 mg/L의 암피실린 및 가나마이신 25 mg/L로 보충하였다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 단일 고립 된 식민지를 사용 하 여, Inoculate 50 luria 국물의 mL (LB) 600 μM DAP, 100 암피실린의 mg/L 및 25 mg/L 에서 카나마이신의 25 mg/L 25 mL 에를렌마이어 플라스크와 라벨 "기증자"로 라벨.
  2. 루리아-베르타니 한천에 고립된 식민지를 위한 "수신자"균주(A. baumannii 균주 ATCC 17978, 재료 테이블)를줄입니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 단일 고립 된 식민지를 사용 하 여, 250 mL Erlenmeyer 플라스크에 LB의 50 mL을 접종 하 고 "받는 사람"으로 레이블.
  3. 두 문화 ("기증자"와 "수령인")를 37 °C에서 하룻밤 동안 흔들어 보배하십시오.

2. 세균 짝짓기

  1. 야간 문화를 50mL 원문 튜브로 옮기십시오.
  2. 7 분 동안 5,000 x g에서 원심 분리를 사용하는 수령인 과 기증자 문화.
  3. 상체를 버리고 잔류 항생제를 씻어 내기 위해 DAP로 보충 된 LB의 35 mL에서 "기증자"균주 펠릿을 다시 중단하십시오.
  4. 펠릿 "기증자" 변형 세포원심분리를 사용 하 여 5,000 x g에 대 한 7 분.
  5. 상체를 버리고 DAP로 보충 된 LB의 4.5 mL에서 "기증자"변형 펠릿을 다시 중단하십시오. 10mL 세로지피펫을 사용하십시오.
  6. "수령인" 균주 튜브로 재일시 중단된 "기증자" 균주를 전송하여 펠릿 "받는 사람" 세포를 포함합니다. 2.5단계에서 동일한 10mL 세로지피펫을 사용하여 배양을 혼합합니다. 즉시 다음 단계로 이동합니다.
    참고: 최종 서스펜션의 총 부피는 5mL여야 합니다.
  7. DAP(플레이트당 5-7방울)로 보충된 LB 천판에 개별 100 μL 방울로 결합 현탁액을 분배합니다(도1A).
  8. 30 분 동안 실온에서 접시를 배양하십시오.
  9. 물방울을 방해하지 않고 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 문화가 1 h로 메이트 할 수있습니다.
    참고 : 1 h를 초과하는 잠복기는 자매 돌연변이의 생성을 위험합니다.
  10. 인큐베이션에 따라 각 접시에 1.5mL의 LB를 추가하고 접시에서 박테리아를 재연하여 수확하십시오. 1mL 마이크로피펫을 사용하여 리서스펜션을 사용할 수 있습니다. 최종 부피는 약 12 ~ 15mL여야 합니다.
  11. 수확된 세포를 50mL 원추형 튜브에 결합합니다.
  12. 7 분 동안 5,000 x g에서 원심 분리를 사용하여 메이트 된 세포를 펠렛.
  13. 잔류 DAP를 제거하기 위해 상체를 버리고 LB의 50mL에서 셀을 다시 중단합니다.
  14. 7 분 동안 5,000 x g에서 원심 분리를 사용하여 짝짓기를 펠렛.
  15. 세척 단계(2.13 및 2.14 단계)를 반복합니다.
  16. 10 mL 세로지 피펫을 사용하여 25 % 글리세롤로 보충 된 LB의 10 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
  17. 세척 된 세포를 사용하여, LB 국물에 5 개의 연속 희석을 합니다 (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000)
  18. 멸균 유리 구슬을 사용하여 4 개의 다른 접시에 각 희석의 100 μL을 확산 : 카나마이신으로 보충 루리아 - 베르타니 한천, 암피실린으로 보충 된 한천, DAP와 한천으로 보충 된 한천.
  19. 하룻밤 사이에 37 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
  20. Aliquot는 나머지 짝짓기를 1 mL 알리쿼트에 쿼트하고 -80 °C에 저장합니다.

3. 트랜스포슨 라이브러리의 적절한 희석 을 결정

  1. 야간 플레이트에서 콜로니 형성 유닛(CFU)을 기록합니다.
  2. 각 상이한 플레이트 조건에 대해 카운트 가능한 콜로니가 있는 플레이트를이미지(그림 2A).
    참고: "기증자"와 "수령인" 균주는 DAP로 보충된 한천 접시에서 자라야 하므로 대부분의 도금 희석은 잔디밭을 생성합니다. 만 "받는 사람"변형은 천접시에서 성장할 수 있습니다. "기증자"도 "받는 사람"균주는 암피실린으로 보충 된 한천 접시에서 성장할 수 없으므로 성장이 최소화되지 않아야합니다. 트랜스포지 삽입을 인코딩하는 표적 스트레인 세포만이 카나마이신으로 보충된 한천 플레이트에서 자랄 수 있다. 식민지크기는 크기가 다양해야 하며, 이는 카나마이신으로 보충된 한천의 적합성에 기여하는 유전자의 트랜스포슨 삽입을 나타냅니다.
  3. 카나마이신으로 보충된 LB 한천 플레이트의 콜로니 수를 계산하여 냉동 결합에서 트랜스포슨 돌연변이의 수를 계산합니다.
    참고: A. baumannii 게놈(약 4Mbps)의 경우, 고해상도 돌연변이 라이브러리(약 1개의 트랜스포손 삽입/10 베이스 쌍)를 생성하기 위해 약 400,000개의 식민지를 획득하는 것이 목표였습니다. 그러나, 이 숫자는 표적 종의 게놈 크기에 기초하여 최적화되어야 한다).

4. 최종 세균 돌연변이 라이브러리의 세대

  1. 얼음 위에 얼어붙은 짝짓기의 알리쿼트를 해동합니다.
  2. 150mm 루리아-베르타니 식기 판의 플레이트 결합은 3.1단계에서 계산된 CFU를 기반으로 카나마이신으로 보충됩니다. 도금 전에 150 μL 당 13,333 개의 식민지를 산출하기 위해 LB로 부피를 조정합니다.
    참고: 여기서 CFU 카운트는 약105 CFU/mL로 결정되었기 때문에 플레이트당 13,333개의 콜로니를 획득하도록 조정되었기 때문에 플레이트를 과밀화하지 않고 고해상도 돌연변이 라이브러리를 위해 30플레이트에 최적의 콜로니 수를 제공할 수 있습니다.
  3. 멸균 유리 구슬을 사용하여 접시당 희석150 μL을 30 x 150mm 루리아-베르타니 식기 판에 30x 150mm루리아-베르타니 식기 판으로 분산하여 400,000개의식민지(그림 1C)를얻습니다.
    참고: 멸균 막대 또는 모든 종류의 멸균 스프레더 도구(즉, 유리 구슬)는 박테리아를 접시에 퍼뜨리는 데 사용될 수 있다.
  4. 초과 짝짓기가 포함된 중고 튜브를 폐기하십시오.
    참고: 동결/해동 주기는 박테리아 배양에 선택적 압력을 추가하여 Tn-seq 실험 결과를 왜곡할 수 있습니다. 매번 신선한 알리쿼트를 사용하십시오.
  5. 14 시간 동안 37 °C에서 플레이트를 배양합니다.
    참고: 인큐베이션 시간은 자라나는 것을 방지하기 위해 최적화되어 있습니다(식민지가 만지는). 인큐베이션 시간을 줄임으로써 성장을 최소화하는 것이 좋습니다.

5. 라이브러리 밀도 예측 및 스토리지풀

  1. 각 플레이트의 CfU를 계산하여 트랜스포슨 라이브러리의 총 돌연변이를 추정합니다. 플레이트의 전체 그룹에 대한 콜로니 카운트 추정을 결정하기 위해 최소 3 플레이트의 20%를 계산합니다(그림2A). 식민지가 다른 식민지를 건드리지 않도록 하십시오.
  2. 추정 된 식민지 수율을 계산 한 후, LB의 3-5 mL을 추가 (또는 필요한 경우 이상) 각 접시에 멸균 스크래핑 도구를 사용하여 박테리아를 긁어.
    참고: 멸균 접종 루프는 플레이트를 효율적으로 긁어내는 데 사용되었습니다.
  3. 모든 플레이트에서 50mL 원판 튜브(그림1D)로풀 세균 현탁액을 합니다. 이렇게 하려면 여러 50mL 원문 튜브가 필요하며, 적어도 3개이상이 필요합니다.
  4. 펠릿은 7 분 동안 5,000 x g에서 원심 분리를 사용하여 세균 현탁액을 풀었다.
  5. 상체를 버리고 30 % 글리세롤로 보충 된 LB5 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
  6. Transposon 라이브러리의 Aliquot 1 mL은 극저온으로 저장하여 -80°C에 저장합니다.

6. A. 바우마니의 콜리신 저항을 조절하는 요인 식별

  1. 4 x 250 mL Erlenmeyer 플라스크를 각각 50 mL LB 국물 및 라벨로 준비(그림 2B)
    1. A. 바우마니 균주 ATCC 17978 Tn-seq 라이브러리; (-) colistin_1
    2. A. 바우마니 균주 ATCC 17978 Tn-seq 라이브러리; (-) colistin_2
    3. A. 바우마니 균주 ATCC 17978 Tn-seq 라이브러리; (+) colistin_1
    4. A. 바우마니 균주 ATCC 17978 Tn-seq 라이브러리; (+) colistin_2
      참고: 여기에 설명된 도전 성장에서 각 조건(-) colistin 제어 및 (+) colistin 챌린지가 중복으로 테스트되고 있습니다. 따라서 설정에는 4 x 250 mL Erlenmeyer 플라스크가 필요하며 조건당 2 개가 필요합니다.
  2. (+) 콜리스테인 플라스크(6.1.3 및 6.1.4)에 0.5 mg/L 콜리신의 50 μL과 50 μL 을 (-) 콜리스테인 플라스크(6.1.1 및 6.1.2)에 추가합니다.
  3. 얼음 에 5 단계에서 얼어 붙은 Tn-seq 라이브러리 알리쿼트해.
  4. 해동 된 라이브러리의 피펫 1 μL을 PBS의 1 mL로 넣습니다.
  5. 600nm(OD600)에서광학 밀도를 측정하고 1,000을 곱합니다.
    참고: Tn 라이브러리의 1 μL 중 OD600을 결정합니다.
  6. 6.5단계의 계산에 기초하여, 최종 OD600 0.001에 50mL LB를 포함하는 각 플라스크를 접종한다.
  7. 37°C에서 OD600 0.5로 흔들리는 인큐베이터에서 배양물을 성장시다.
    참고: 문화권은 로그자리트 성장 단계에 남아 있는 것이 중요하므로 기하급수적으로 증가하는 동안 변형이 다른 OD600에 있는 경우 OD600을 조정하여 문화가 로그리스믹 성장 단계에서 가능한 한 여러 번 복제되도록 조정해야 합니다. 문화가 3 번만 복제하는 경우, 돌연변이의 피트니스 결함을 감지하는 힘은 이론적으로 3 배 차이로 제한됩니다. 다른 박테리아는 서로 다른 두 배로 시간이 있기 때문에, 시작 접종을 정상화하기 위해 고정 OD600에서 배양을 종자하는 것이 중요하다. 이렇게 하면 모든 문화권에서 전체 라이브러리를 일관되게 표현할 수 있습니다.
  8. 원심분리기를 사용하여 4°C에서 5,000xg에서 7분 동안 수확배양.
  9. 상체를 제거하고 PBS의 50mL로 씻어.
  10. 4°C에서 5,000 x g에서 원심분리를 사용하여 7분 동안 펠릿.
  11. 상체를 제거하고 PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 알리쿼트 ~ 200 μL을 5개의 미세원심분리기 튜브로 넣습니다.
  12. 4°C에서 5,000 x g에서 원심분리를 사용하여 5분 동안 펠릿. 파이펫 팁을 사용하여 모든 상체를 제거합니다.
  13. -20°C에 펠릿을 저장하거나 gDNA 추출을 진행합니다.

7. gDNA 추출

  1. 얼음 위에 한 개의 세포 펠릿을 해동하십시오.
  2. 0.6 mL 리시스버퍼(재료 표)와소용돌이를 추가하여 펠릿을 완전히 재연합니다.
  3. 1 h에 대한 37 °C에서 인큐베이션.
  4. 피놀/클로로폼/이소아밀 알코올을 0.6mL로 첨가하여 시료와 소용돌이에 적극적으로 넣습니다.
  5. 5 분 동안 방 온도에서 최대 속도로 미세 원심 분리기에서 원심 분리를 사용하여 별도의 단계.
  6. 상부 수성 단계를 새 튜브로 옮기습니다. 전송 하는 동안 위상 인터페이스를 방해 하지 마십시오.
  7. 위에서 얻은 수성 상에 동일한 부피의 클로로폼을 추가하고 적극적으로 소용돌이를 한다.
  8. 5 분 동안 방 온도에서 최대 속도로 미세 원심 분리기를 사용하여 별도의 단계.
  9. 상부 수성 단계를 새로운 튜브로 옮기.
    참고: 전송 하는 동안 인터페이스를 방해 하지 않도록 해야 합니다.
  10. 차가운 100 % 에탄올의 2.5 배 수성 상 부피를 넣고 부드럽게 섞습니다. 침전된 DNA가 보입니다.
  11. 튜브를 -80°C에서 1시간 이상 배치합니다.
  12. 펠릿 DNA는 최대 속도로 원심분리를 사용하여 4°C에서 30분 동안.
  13. DNA 펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하고 파이펫팅하여 70 % 에탄올의 150 μL로 세척하십시오.
  14. 펠릿 DNA는 최대 속도에서 원심분리를 사용하여 4°C에서 2분 동안.
  15. 상체를 조심스럽게 제거합니다.
  16. 7.14 단계를 한 번 반복합니다. 나머지 에탄올을 모두 조심스럽게 제거합니다.
  17. 5-10 분 동안 방 온도에서 배양하여 DNA를 건조.
  18. 파이펫팅을 통해 100 μL TE 버퍼에서 DNA 펠릿을 다시 중단합니다.

8. DNA 전단(그림 3A)

  1. TE 버퍼로 gDNA를 총 200 μL의 농도로 희석합니다.
  2. 튜브를 수조 초음파 처리기에 놓습니다.
  3. 약 300개의 뉴클레오티드의 단편을 산출하기 위하여 DNA를 초음파 처리합니다. 전원 : 60 %, 총 시간 : 20 분, 사이클 : 10 s ON 과 10 s OFF 4 ° C(그림 3A).
  4. DNA가 1% 아가로즈 젤에 10 μL의 미광택 DNA 및 10 μL의 전염된 DNA를 분리하여 적절하게 전염된다는 것을 확인합니다. 초음파 처리를 반복하거나 필요에 따라 최적화하십시오(그림3B).

9. 3 엔드에 폴리-C 꼬리 추가(그림 3A)

  1. 표 1에 따라 폴리-C 반응을 설정합니다.
  2. 1 h에 대한 37 °C에서 반응을 배양.
  3. 아래 단계를 따라 크기 선택 파라자성 구슬(그림3A)의40 μL로 폴리-C 반응을 정화합니다.
    1. 각 샘플에 크기 선택 파라자성 구슬 40 μL을 추가합니다. 소용돌이 ~ 5 s 또는 파이펫 위아래로.
    2. 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.
    3. 간단히, 원심 분리관은 튜브의 바닥에 액체를 수집 (~ 2 s).
    4. 튜브를 자기 랙으로 옮기고 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 실온에서 배양하십시오.
    5. 마그네틱 랙에 튜브를 장착하면 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
    6. 마그네틱 랙에 튜브를 장착하면 새로 준비된 80% 에탄올 200 μL(구슬을 방해하지 않음)을 추가합니다.
    7. 용액이 명확해질 때까지 샘플을 30s 이상 배양합니다.
    8. 마그네틱 랙에 튜브를 장착하면 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
    9. 세척 단계 (단계 9.3.6 - 9.3.8)를 반복합니다.
    10. 간단한 원심분리 단계(~2s)를 사용하여 튜브 바닥에 액체를 수집합니다.
    11. 튜브를 마그네틱 랙으로 옮기고 남은 액체를 제거합니다.
    12. 실온에서 2-5분 동안 배양하여 시료를 건조시로 바립니다. 지나치게 건조하지 마십시오.
    13. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 각각 25 μL의 물을 추가합니다. ~ 5 s 또는 파이펫 위아래로 소용돌이.
    14. 간단히, 원심 분리관은 튜브의 바닥에 액체를 수집 (~ 2 s).
    15. 튜브를 자기 랙으로 옮기고 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 앉을 수 있습니다.
    16. 자기 랙에 튜브를 사용하면 구슬을 방해하지 않고 액체를 제거하고 새로운 튜브 (DNA의 23 μL)로 옮김하십시오.

10. 트랜스포슨 접합 증폭(그림 3A)

  1. 첫 번째 중첩 PCR(표 2)에대한 표 1에 설명 된 대로 설정 PCR 1.
  2. 표 1에 설명된 조건을 사용하여 PCR 1을 수행합니다.
  3. 크기 선택 파라자성 구슬40 μLPCR 제품을 정화합니다(9.3.1단계 – 9.3-12단계). 50 μL의 물(9.3.13 ~ 9.3.16)의 엘루트. 이 시점에서 샘플은 -20 °C에 저장될 수 있습니다.
  4. 스트렙타비딘 커플 파라자성 구슬 준비:
    1. 스트렙타비딘 구슬을 격렬하게 흔들어 재차 질한다.
    2. 샘플당 32μL의 비드를 신선한 미세센심분리기 튜브에 추가합니다.
      참고: 6 + 샘플에 대한 구슬은 하나의 튜브로 제조 할 수 있습니다.
    3. 튜브를 자기 랙으로 옮기습니다. 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 배양하십시오.
    4. 자기 랙에 튜브를 사용하면 상체를 제거하십시오.
    5. 자기 랙에서 튜브를 제거합니다. 1mL 1x B&W 버퍼에서 위아래로 파이프를 배싱하여 구슬을 세척합니다.
    6. 튜브를 자기 랙으로 옮기습니다. 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 배양하십시오.
    7. 자기 랙에 튜브를 사용하면 상체를 제거하십시오.
    8. 1mL 1x B&W 버퍼(10.4.5 ~ 10.4.7단계)로 반복 세척 단계는 총 3개의 세척을 위해 두 번 더 번 반복합니다.
    9. 자기 랙에서 튜브를 제거하고 샘플 당 2배 B&W 버퍼의 52 μL에서 구슬을 재축합니다.
  5. 준비된 구슬의 50 μL과 50 μL의 정제 된 PCR1 (10.3 단계에서)를 결합합니다. 파이펫을 섞어.
  6. 실온에서 30분 동안 회전합니다.
  7. 언바운드 DNA를 씻어내세요:
    1. 간단히, 원심 분리기는 튜브의 바닥에 액체를 수집 (~ 2 s).
    2. 튜브를 자기 랙으로 옮기습니다. 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 배양하십시오.
    3. 자기 랙에 튜브를 사용하면 상체를 제거하십시오.
    4. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고, 100 μL 1x B&W 버퍼로 재연하고 위아래로 파이프를 통해 구슬을 씻으십시오.
    5. 튜브를 자기 랙으로 옮기. 용액이 명확해질 때까지 ~ 2 분 동안 배양하십시오.
    6. 자기 랙에 튜브를 사용하면 상체를 제거하십시오.
    7. 100 μL LoTE (단계 10.7.4 - 10.7.6)로 반복 세척 단계는 총 3 개의 세척을 위해 두 번 더 번 번.
  8. 표 1에 설명된 대로 PCR 2를 설정하여 트랜스포슨 접합을 증폭하고 각 샘플(표2 및 표 3)에단일 바코드를 추가합니다.
  9. 표 1에설명된 조건을 사용하여 PCR 2를 수행합니다.
  10. 크기 선택 파라자성 구슬 40 μL로 정화 (단계 9.3.1 – 9.3.12). 17 μL의 물(단계 9.3.13 – 9.3.16)에서 엘루테는 15 μL을 수집합니다.
  11. 불소계를 사용하여 DNA 농도를 정량화합니다. 최종 농도는 ~ 50 ~ 250 ng /μl이어야합니다.
  12. 칩 기반 모세관 전기포진(도4A)을사용하여 DNA 품질을 평가합니다.

결과

설명된 방법은 플라스미드 pJNW684(도4B)를복제하는 대장균 MFD DAP를 이용한 세균융합을 통해- A. baumannii 균주 ATCC 17978에서 고밀도 트랜스포슨 라이브러리의 생성을 기술한다. 상세한 프로토콜은 대장균 λpir+ 기증자 균주에서 A. baumannii 받는 사람 균주로 pJNW684의 전송을 위한 이중 부모 세균 연상을 사용합니다. 이 방법은 조밀한 트랜스...

토론

A. baumannii는 colistin,,,10,11,12, 23,,24,2330, 31과같은 "최후의 라인"치료에 대한 AMR의 급속한 인수로 인해 글로벌 공중 보건에 새로운 위협이되고30있습니다., 최근 수십 년 동안 Tn-seq는 수많은 세균 종에 걸쳐 유전자형 표?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작품은 국립 보건 원 (그랜트 AI146829에서 J.M.B.에 대한 자금 지원)에 의해 지원되었으며 감사하게 인정받고 있습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-TriphosphateAffymetrix77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-TriphosphateInvitrogen10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight MarkerPromegaPR-G2101
100mm x 15mm Petri DishesCorning351029
150mm x 15mm Petri DishesCorning351058
1X B&WN/AN/ADilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acidAlfa AesarB2239103used at 600 µM
2X B&WN/AN/AAdd 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTPN/AN/A9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA PolymeraseInvitrogen12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978ATCCN/AAmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)Fisher ScientificBP1760used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification systemBECKMAN COULTERA63881
BioAnalyzerAgilentG2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA AnalysisAgilent5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)New England Biolabs (NEB)N0447L
DynaMag-2 Magnetic rackInvitrogen12321D
E.coli MFD Dap-N/AN/ADAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
EthanolFisher ScientificA4094
Externally Threaded Cryogenic VialsCorning09-761-71
Glass beadsCorning72684
GlycerolFisher ScientificG33
Inoculating loopsFisher Scientific22-363-602Scraping tool
KanamycinFisher ScientificBP906used at 25 mg/L
LB agar, MillerFisher ScientificBP1425
LB broth, MillerFisher ScientificBP1426
LoTEN/AN/AAdd 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis bufferN/AN/A9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)Fisher ScientificBP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X SolutionFisher ScientificBP39920Diluted to 1X
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33238
Qubit Assay TubesThermo FisherQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851
Sonicator with refridgerated waterbathQsonica SonicatorsQ2000FCE
Streptavidin Magnetic BeadsNew England Biolabs (NEB)S1420S
TE bufferN/AN/A10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)PromegaPR-M1875

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