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Resumo

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Resumo

O sequenciamento transposon (Tn-seq) é um método poderoso que combina mutagênese transposon e sequenciamento paralelo maciço para identificar genes e caminhos que contribuem para a aptidão bacteriana sob uma ampla gama de condições ambientais. As aplicações tn-seq são extensas e não só permitiram o exame das relações genótipo-fenótipo a nível de organismo, mas também nos níveis populacional, comunitário e de sistemas. As bactérias gram-negativas estão altamente associadas com fenótipos de resistência antimicrobiana, o que aumentou os incidentes de falha no tratamento de antibióticos. A resistência antimicrobiana é definida como crescimento bacteriano na presença de antibióticos letais de outra forma. A colistina antimicrobiana de "última linha" é usada para tratar infecções bacterianas gram-negativas. No entanto, vários patógenos Gram-negativos, incluindo Acinetobacter baumannii podem desenvolver resistência à colistina através de uma série de mecanismos moleculares, alguns dos quais foram caracterizados usando Tn-seq. Além disso, as vias de transdução de sinais que regulam a resistência à colistina variam dentro das bactérias Gram-negativas. Aqui propomos um método eficiente de mutagênese transposon em A. baumannii que agiliza a geração de uma biblioteca de inserção transposon saturada e construção de biblioteca de amplicon, eliminando a necessidade de enzimas de restrição, ligadura adaptadora e purificação de gel. Os métodos aqui descritos permitirão uma análise aprofundada dos determinantes moleculares que contribuem para a aptidão de A. baumannii quando desafiados com colistina. O protocolo também é aplicável a outros patógenos ESKAPE gram negativos, que estão principalmente associados a infecções hospitalares resistentes amedicamentos.

Introdução

A descoberta de antibióticos é, sem dúvida, um dos eventos mais impactantes relacionados à saúde do séculoXX. Os antibióticos não só resolvem rapidamente infecções bacterianas graves, como também desempenham um papel fundamental na medicina moderna. Cirurgias de grande porte, transplantes e avanços em medicina neonatal e quimioterapia deixam pacientes suscetíveis a infecções que ameaçam a vida e essas terapias não seriam possíveis sem antibióticos1,,2. No entanto, o rápido desenvolvimento e disseminação da resistência a antibióticos entre patógenos humanos diminuiu significativamente a eficácia de todas as classes clinicamente importantes de antibióticos3. Muitas infecções bacterianas que antes eram facilmente eliminadas com tratamento de antibióticos, não respondem mais a protocolos clássicos de tratamento, causando uma grave ameaça à saúde pública global1. Resistência antimicrobiana (AMR) é onde as células bacterianas crescem em concentrações letais de antibióticos, independentemente da duração do tratamento4,5. É urgente compreender fatores moleculares e bioquímicos que regulam a RM, o que ajudará a orientar o desenvolvimento antimicrobiano alternativo. Especificamente, os patógenos ESKAPE são problemáticos em ambientes clínicos e associados a amr extensa. Estes incluem Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp. Enquanto vários mecanismos contribuem para a AMR em patógenos ESKAPE, os quatro últimos organismos são Gram-negativos.

Bactérias gram-negativas montam uma membrana externa que as protege de condições ambientais adversas. A membrana externa serve como uma barreira de permeabilidade para restringir a entrada de moléculas tóxicas, como antibióticos, na célula. Ao contrário de outras membranas biológicas, a membrana externa é assimétrica. O folheto externo é enriquecido com lipopólise exposto à superfície, enquanto o folheto interno é uma mistura de fosfolipídios6. Moléculas de lipopolisacarídeo são ancoradas na membrana externa por um lipídio conservado Uma moiety incorporada dentro da bicamada lipídica7. O lipídio canônico Um domínio de Escherichia coli lipopolysaccharide é necessário para o crescimento da maioria das bactérias Gram-negativas e é sintetizado por uma via enzimática de nove passos que é uma das vias mais fundamentais e conservadas em organismos Gram-negativos6,,7,,8.

Polimicônias são peptídeos antimicrobianos cônicos que visam o domínio lipídico A de lipopólise para perturbar a membrana externa e lise a célula. A interação eletrostática entre resíduos carregados positivamente de polimíxinos e os grupos lipídicos lipídicos abofíticos carregados negativamente interrompem a membrana celular bacteriana, levando à morte celular9,,10,,11,,12,13. Colistina (polimicina E) é um antimicrobiano de última instância usado para tratar infecções causadas por patógenos nosocomias gram-negativos multidrogas, como acinetobacter baumannii14,,15,16. Descoberto pela primeira vez em 1947, os polimíxinos são produzidos pelas bactérias do solo, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polimíxins foram prescritos para tratar infecções gram-negativas por anos antes de seu uso clínico ser limitado devido a relatos de nefrocígenidade significativa20,21.

A. baumannii é um patógeno gram-negativo nosocomial que aumentou drasticamente a morbidade e mortalidade dos desfechos dos pacientes nas últimas décadas22. O que antes era considerado um patógeno de baixa ameaça, agora representa um risco significativo para infecção hospitalar em todo o mundo devido à sua incrível capacidade de adquirir AMR e alto risco de epidemia23,24. A. baumannii é responsável por mais de 10% das infecções nosocomiais nos estados unidos. A doença se manifesta como pneumonia, bacteremia, infecções do trato urinário, infecções de pele e tecidos moles, meningite e endocardite25. As opções de tratamento para infecções de A. baumannii diminuíram devido à resistência contra quase todas as classes de antibióticos, incluindo β-lactams, fluoroquinolones, tetraciclina e aminoglycosides23,24. A prevalência de isolamentos a. baumannii, resistentes a medicamentos multidrogas, extensivamente resistentes a medicamentos e resistentes a medicamentos, levou a um ressurgimento do tratamento da colistina, que foi considerado uma das poucas opções terapêuticas remanescentes ainda eficazes contra a resistência multidroga A. baumannii. No entanto, o aumento da resistência à colistina entre os isolados A. baumannii ampliou ainda mais sua ameaça à saúde pública global10,11,12,13,27,30,31.

Os recentes avanços em tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, como o sequenciamento transposon (Tn-seq), forneceram ferramentas importantes para avançar nossa compreensão da aptidão bacteriana in vitro e in vivo. Tn-seq é uma ferramenta poderosa que pode ser aproveitada para estudar interações genótipo-fenótipo em bactérias. O Tn-seq é amplamente aplicável entre patógenos bacterianos, onde combina mutagênese transposon tradicional com sequenciamento paralelo maciço a locais de inserção de mapas rápidos, que podem ser usados para ligar mutações de DNA a variantes fenotípicas em uma escala de genoma32,,33,,34,35. Embora os métodos de mutagênese transposon tenham sido descritos anteriormente, os passos gerais são semelhantes33. Primeiro, uma biblioteca de inserção é gerada usando mutagênese transposon, onde cada célula bacteriana dentro de uma população é restrita a uma única inserção transposon dentro do DNA genômico (gDNA). Após mutagênese, mutantes individuais são agrupados. gDNA é extraído da piscina mutante de inserção e as junções transposon são amplificadas e submetidas a sequenciamento de alto rendimento. As leituras representam locais de inserção, que podem ser mapeados para o genoma. Inserções transposon que reduzem o condicionamento físico rapidamente caem da população, enquanto as inserções benéficas são enriquecidas. Tn-seq tem sido fundamental para avançar nossa compreensão de como os genes impactam a aptidão bacteriana no estresse33.

O sistema de transposon himar1 marítimo codificado em pJNW684 foi especificamente construído e otimizado para fins de mutagênese transposon. Inclui um transposon da família marinerflanqueando o gene de resistência à kanamicina, que é usado para a seleção de mutantes de inserção transposon em A. baumannii. Ele também codifica um promotor específico de A. baumannii que impulsiona a expressão do gene de codificação transposase36. O transposon baseado em marinheirotambém contém dois terminadores translacionais a jusante do gene de resistência à kanamicina, que impede a leitura a jusante da inserção37. pJNW684 também carrega uma origem RP4/oriT/oriR6K-condicional de replicação que requer o gene λpir contribuído pela cepa do doador para replicar38. Na ausência do gene λpir, o vetor pJNW684 que transporta o maquinário de transposição não poderá se replicar na cepa receptora A. baumannii 10,,36,38. Portanto, durante a conjugação bacteriana, apenas o transposon é inserido no genoma receptor sem inserção de fundo do plasmídeo, que carrega o gene transposase. Isso é significativo porque a perda da atividade de transposase juntamente com o plasmídeo resulta em evento de transposição único e estável que impede o transposon de se mover para diferentes locais uma vez que insere no genoma receptor.

pJNW648 também foi testado para atividade em outro organismo Gram-negativo, E. coli. A montagem bem sucedida de uma biblioteca Sn-seq saturada na cepa E. coli W3110 indicou que o sistema é capaz de realizar mutagênese em uma ampla gama de patógenos, incluindo Enterobacteriaceae. Além disso, o promotor específico A. baumannii que impulsiona a expressão transposase pode ser rapidamente trocado com um promotor específico da espécie. Por fim, o gene de resistência à kanamicina pode ser trocado por outras fitas de resistência, dependendo do fenótipo amr do organismo que está sendo estudado.

Um fator que contribui para a resistência à colistina em A. baumannii é a administração de doses insuficientes, onde as bactérias são expostas à pressão seletiva em níveis nãoletais 39. Vários relatos mostraram que concentrações antimicrobianas subinibitórias podem induzir respostas regulamentadas que alteram a fisiologia celular para reduzir a suscetibilidade de toda a população bacteriana11,,12,,30,,31. Usando Tn-seq, descobrimos fatores que regulam a resistência à colistina em A. baumannii cep ATCC 17978 após exposição a concentrações inibitórias10 e subinibitórias de colistina. Este exemplo detalha um método Tn-seq que agiliza a construção e o enriquecimento de uma biblioteca mutante transposon saturada usando a família detransposons40,41. Enquanto vários protocolos Tn-seq geram 20.000 - 100.000 mutantes35,42,43,44,45,46, o protocolo aqui descrito pode gerar rapidamente uma biblioteca transposon de 400.000 + mutantes, que equivale aproximadamente a uma inserção transposon a cada pares de 10 bases em A. baumannii10. Além disso, o tamanho da biblioteca pode ser ampliado sem um esforço adicional significativo. Este método também elimina a exigência de restrição de endonucleases, ligadura adaptador e purificação de gel, o que pode reduzir a diversidade final da biblioteca.

Protocolo

1. Preparação de cepas bacterianas

  1. Listrar a cepa "doador"(E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabela de Materiais) para colônias isoladas no ágar Luria-Bertani suplementado com ácido diaminopimelic de 600 μM (DAP), 100 mg/L de ampicillina e 25 mg/L de kanamicina. Incubar durante a noite a 37 °C. Utilizando uma única colônia isolada, inocular 50 mL de caldo de Luria (LB) suplementado com 600 μM DAP, 100 mg/L de ampicillina e 25 mg/L de kanamicina em um frasco erlenmeyer de 250 mL e rotulá-lo como "doador".
  2. Listrar a cepa "receptora"(A. baumannii cep ATCC 17978, Tabela de Materiais) para colônias isoladas no ágar Luria-Bertani. Incubar durante a noite a 37 °C. Usando uma única colônia isolada, inocular 50 mL de LB em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL e rotulá-lo como "destinatário".
  3. Incubar ambas as culturas ("doador" e "receptor") durante a noite a 37 °C com agitação.

2. Acasalamento bacteriano

  1. Transfira culturas durante a noite para tubos cônicos de 50 mL.
  2. Pelotas tanto culturas receptoras quanto doadoras usando centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  3. Descarte o supernasal e resuspenque a pelota de cepa "doador" em 35 mL de LB complementada com DAP para lavar antibióticos residuais.
  4. Pelota as células de cepa "doador" usando centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  5. Descarte o supernasal e resuspenque a pelota de esma de estirpe "doador" em 4,5 mL de LB complementada com DAP. Use uma pipeta sorológica de 10 mL.
  6. Transfira a cepa "doador" resuspended para o tubo de tensão "receptor", que contém as células "receptoras" pelleted. Use a mesma pipeta sorológica de 10 mL da etapa 2.5 para misturar as culturas. Mova-se imediatamente para o próximo passo.
    NOTA: O volume total da suspensão final deve ser de 5 mL.
  7. Distribua a suspensão de acasalamento individual de 100 μL em placas de ágar LB suplementadas com DAP (5-7 gotículas por placa)(Figura 1A).
  8. Incubar placas em temperatura ambiente por 30 minutos.
  9. Sem perturbar as gotículas, transfira cuidadosamente as placas para uma incubadora de 37 °C e permita que as culturas acasalem por 1h.
    NOTA: Períodos de incubação superiores a 1h arriscam a geração de mutantes irmãos.
  10. Após a incubação, adicione 1,5 mL de LB em cada placa e colher resutilheira das placas. Use uma micropipette de 1 mL para ressuspensão. O volume final deve ser de aproximadamente 12 a 15 mL.
  11. Combine células colhidas em um tubo cônico de 50 mL.
  12. Pelota as células acasaladas usando centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  13. Descarte as células supernascidas e resuspendas em 50 mL de LB para remover o DAP residual.
  14. Pelota o acasalamento usando centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  15. Repita a etapa de lavagem (passos 2.13 e 2.14).
  16. Utilizando uma pipeta sorológica de 10 mL, resuspense a pelota em 10 mL de LB suplementada com 25% de glicerol.
  17. Usando células lavadas, faça cinco diluições seriais no caldo LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000).
  18. Espalhe 100 μL de cada diluição em 4 placas diferentes usando contas de vidro estéreis: ágar Luria-Bertani suplementado com kanamicina, ágar suplementado com ampicillina, ágar suplementado apenas com DAP e ágar.
  19. Incubar placas a 37 °C durante a noite.
  20. Aliquot o acasalamento restante em alíquotas de 1 mL e armazene a -80 °C.

3. Determine a diluição apropriada da biblioteca transposon

  1. Registrar unidades formadoras de colônias (UFC) a partir de placas noturnas.
  2. Imagem uma placa com colônias contáveis para cada condição de placa diferente(Figura 2A).
    NOTA: Tanto as cepas de "doador" quanto "receptor" devem crescer em placas de ágar complementadas com DAP, de modo que a maioria das diluições banhadas produzirá um gramado. Apenas a cepa "receptora" pode crescer em placas de ágar. Nem o "doador" nem a cepa "receptora" podem crescer em placas de ágar suplementadas com ampicillina, por isso não deve haver nenhum/crescimento mínimo. Somente as células-alvo que codificam a inserção transposon podem crescer em placas de ágar suplementadas com kanamicina. As colônias devem variar de tamanho, indicando inserções transposon em genes que contribuem para o condicionamento físico no ágar suplementado com kanamicina.
  3. Calcule o número de mutantes transposon no acasalamento congelado contando o número de colônias em placas de ágar LB suplementadas com kanamicina.
    NOTA: Para o genoma A. baumannii (aproximadamente 4 Mbps), o objetivo era obter cerca de 400.000 colônias para gerar uma biblioteca mutante de alta resolução (aproximadamente uma inserção transposon/10 pares de bases). No entanto, esse número deve ser otimizado com base no tamanho do genoma da espécie-alvo).

4. Geração da biblioteca final de mutantes bacterianos

  1. Descongele uma alíquota do acasalamento congelado no gelo.
  2. Acasalamento de placas de 150 mm Placas de ágar Luria-Bertani complementadas com kanamicina baseada em UFC calculado na etapa 3.1. Ajuste o volume com LB para produzir 13.333 colônias por 150 μL antes de emplacamento.
    NOTA: A contagem da UFC aqui foi determinada em cerca de10 5 UFC/mL, de modo que o volume de acasalamento foi ajustado para obter 13.333 colônias por placa, pois isso forneceria um número ideal de colônias em 30 placas para uma biblioteca mutante de alta resolução sem superlotar as placas.
  3. Use contas de vidro estéreis para espalhar 150 μL da diluição por placa em placas de ágar Luria-Bertani de 30 x 150 mm complementadas com kanamicina para obter 400.000 colônias(Figura 1C).
    NOTA: Varas estéreis ou qualquer tipo de ferramenta de espalhador estéril (ou seja, contas de vidro) podem ser usadas para espalhar as bactérias em placas.
  4. Descarte o tubo usado contendo excesso de acasalamento.
    NOTA: Ciclos de congelamento/degelo adicionam pressões seletivas sobre a cultura bacteriana, o que pode distorcer os resultados do experimento Tn-seq. Use uma alíquota fresca cada vez.
  5. Incubar placas a 37 °C por 14 h.
    NOTA: O tempo de incubação é otimizado para evitar o crescimento excessivo (colônias tocando). Sugere-se minimizar o crescimento reduzindo o tempo de incubação.

5. Estimando a densidade da biblioteca e a agrupamento para armazenamento

  1. Conte CFUs em cada placa para estimar o total de mutantes na biblioteca transposon. Conte 20% de pelo menos 3 placas para determinar a estimativa de contagem de colônias para todo o grupo de placas (Figura 2A). Certifique-se de que as colônias não estão tocando outra colônia.
  2. Depois de calcular o rendimento estimado da colônia, adicione 3-5 mL de LB (ou mais, se necessário) a cada placa e raspe as bactérias usando uma ferramenta de raspagem estéril.
    NOTA: Laços inoculadores estéreis foram usados para raspar eficientemente as placas.
  3. Suspensões bacterianas da piscina de todas as placas em tubos cônicos de 50 mL(Figura 1D). Isso exigirá vários tubos cônicos de 50 mL, pelo menos 3.
  4. Suspensão bacteriana agrupada com centrifugação a 5.000 x g por 7 min.
  5. Descarte a pelota supernascerante e resuspend em 5 mL de LB suplementada com 30% de glicerol.
  6. Aliquot 1 mL da biblioteca transposon em criovials e armazenar a -80 °C.

6. Identificação de fatores que regulam a resistência à colistina em A. baumannii

  1. Prepare frascos de 4 x 250 mL Erlenmeyer com cada um contendo caldo e etiqueta lb de 50 mL como (Figura 2B)
    1. A. baumannii cep ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (-) colistin_1
    2. A. baumannii cep ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (-) colistin_2
    3. A. baumannii cep ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (+) colistin_1
    4. A. baumannii cep ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (+) colistin_2
      NOTA: No desafio que o crescimento aqui descrito, cada condição, (-) controle de colistina e (+) desafio colistina, está sendo testada em duplicata. Portanto, a configuração requer frascos de 4 x 250 mL Erlenmeyer, dois por condição.
  2. Adicione 50 μL de 0,5 mg/L colistina aos (+) frascos de colistina (6.1.3 e 6.1.4) e 50 μL de água para (-) frascos de colistina (6.1.1 e 6.1.2).
  3. Descongele uma biblioteca Tn-seq congelada do passo 5 no gelo.
  4. Pipeta 1 μL da biblioteca descongelada em 1 mL de PBS.
  5. Meça a densidade óptica em 600 nm (OD600) e multiplique por 1.000.
    NOTA: Isso determina o OD600 de 1 μL da biblioteca Tn.
  6. Com base no cálculo da etapa 6.5, inocular cada frasco contendo 50 mL LB para um ODfinal 600 0.001.
  7. Cultivar culturas em uma incubadora de agitação a 37 °C a600 0,5.
    NOTA: É importante que as culturas permaneçam em fase de crescimento logarítmico, portanto, se sua cepa estiver em um OD600 diferente durante o crescimento exponencial, o OD600 precisa ser ajustado para garantir que a cultura se reproduza o máximo de vezes possível dentro da fase de crescimento logarítmico. Se a cultura só se replica 3 vezes, o poder de detectar defeitos de aptidão em mutantes é limitado a diferenças de 3 vezes, em teoria. Como diferentes bactérias têm tempos de duplicação diferentes, é importante semear as culturas em um OD600 fixo para normalizar o inóculo inicial. Isso garante uma representação consistente de toda a biblioteca em todas as culturas.
  8. Culturas de colheita usando centrifugação a 5.000 x g a 4 °C por 7 min.
  9. Retire o supernatante e lave com 50 mL de PBS.
  10. Pelota usando centrifugação a 5.000 x g a 4 °C por 7 min.
  11. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de PBS. Aliquot ~ 200 μL em 5 tubos de microcentrífuga.
  12. Pelota usando centrifugação a 5.000 x g a 4 °C por 5 min. Remova todo o supernatante usando uma ponta de pipeta.
  13. Armazene pelotas a -20 °C ou proceda com extração gDNA.

7. extração gDNA

  1. Descongele uma bala de celular no gelo.
  2. Adicione 0,6 mL tampão de lise(Tabela de Materiais) e vórtice para resususpensar completamente a pelota.
  3. Incubar a 37 °C por 1 h.
  4. Adicione 0,6 mL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico à amostra e vórtice vigorosamente.
  5. Fases separadas usando centrifugação em uma microcentrifuagem a velocidade máxima na temperatura da sala por 5 minutos.
  6. Transfira a fase superior aquosa para um novo tubo. Evite perturbar a interface de fase durante a transferência.
  7. Adicione um volume igual de clorofórmio à fase aquosa obtida acima e vórtice vigorosamente.
  8. Fases separadas usando centrifugação em microcentrifuge a velocidade máxima na temperatura da sala por 5 minutos.
  9. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo.
    NOTA: Certifique-se de evitar perturbar a interface durante a transferência.
  10. Adicione 2,5x de volume de fase aquosa de 100 % de etanol frio e misture suavemente. DNA precipitado será visível.
  11. Coloque o tubo a -80 °C por pelo menos 1 h.
  12. DNA de pelota usando centrifugação a velocidade máxima a 4 °C por 30 min.
  13. Remova cuidadosamente o supernasce sem perturbar a pelota de DNA e lave com 150 μL de 70 % de etanol por pipetação.
  14. DNA de pelota usando centrifugação a velocidade máxima a 4 °C por 2 min.
  15. Remova cuidadosamente o supernatante.
  16. Repita o passo 7.14 uma vez. Remova cuidadosamente todo o etanol restante.
  17. DNA seco incubando na temperatura da sala por 5-10 min.
  18. Resuspend pellet de DNA em 100 μL TE tampão por pipetação.

8. Tesoura de DNA (Figura 3A)

  1. Diluir gDNA com tampão te para uma concentração de 250 ng/mL em um volume total de 200 μL.
  2. Coloque tubos em um sonicator de banho de água.
  3. Sonicate DNA para produzir fragmentos de aproximadamente 300 nucleotídeos. Potência: 60 %, Tempo total: 20 min, Ciclos: 10 s ON e 10 s OFF a 4 °C(Figura 3A).
  4. Confirme que o DNA é coletado apropriadamente separando 10 μL de DNA não emararado e 10 μL de DNA desarquiado em um gel de 1% de agarose. Repita a sonicação ou otimize conforme necessário(Figura 3B).

9. Adição da cauda poly-C ao final de 3'(Figura 3A)

  1. Configuração de reação poly-C de acordo com a Tabela 1.
  2. Incubar a reação a 37 °C por 1 h.
  3. Purifique a reação poli-C com 40 μL de contas paramagnéticas de seleção de tamanho(Figura 3A)seguindo os passos abaixo.
    1. Adicione 40 μL de contas paramagnéticas de seleção de tamanho a cada amostra. Vórtice ~ 5 s ou pipeta para cima e para baixo.
    2. Incubar amostras em temperatura ambiente por 5 minutos.
    3. Resumidamente, tubos centrífugas para coletar líquido na parte inferior do tubo (~ 2 s).
    4. Transfira os tubos para um rack magnético e incubar à temperatura ambiente por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    5. Com tubos no rack magnético, remova cuidadosamente o supernaspe.
    6. Com tubos no rack magnético, adicione 200 μL de etanol recém-preparado 80% (não perturbe as contas).
    7. Incubar amostras por pelo menos 30 s até que a solução esteja clara.
    8. Com tubos no rack magnético, remova cuidadosamente o supernaspe.
    9. Repita a etapa de lavagem (passos 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Colete líquido na parte inferior do tubo usando uma breve etapa de centrifugação (~ 2 s).
    11. Transfira os tubos para o rack magnético e remova qualquer líquido restante.
    12. Incubar em temperatura ambiente por 2-5 minutos para secar amostras. Não seque demais.
    13. Remova os tubos do rack magnético e adicione 25 μL de água a cada um. Vórtice para ~ 5 s ou pipeta para cima e para baixo.
    14. Resumidamente, tubos centrífugas para coletar líquido na parte inferior do tubo (~ 2 s).
    15. Transfira os tubos para o rack magnético e deixe descansar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    16. Com tubos no rack magnético, remova o líquido sem perturbar as contas e transfira para um novo tubo (~ 23 μL de DNA).

10. Amplificação da junção Transposon(Figura 3A)

  1. Configuração PCR 1 conforme descrito na Tabela 1 para o primeiro PCR aninhado (Tabela 2).
  2. Execute o PCR 1 usando condições descritas na Tabela 1.
  3. Purificar produtos PCR com 40 μL de contas paramagnéticas de seleção de tamanho (etapas 9.3.1 – 9.3-12). Elute em 50 μL de água (etapas 9.3.13 – 9.3.16). Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C.
  4. Prepare contas paramagnéticas acopléticas a streptavidin:
    1. Resuspend Streptavidin implora tremendo vigorosamente.
    2. Adicione 32 μL de contas por amostra a um tubo de microcentrifutura fresco.
      NOTA: As contas para 6 + amostras podem ser preparadas em um único tubo.
    3. Transfira o tubo para um rack magnético. Incubar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    4. Com tubo no rack magnético, remova o supernaspeso.
    5. Remova o tubo do rack magnético. Lave as contas reutilizando em 1 mL 1x tampão B&W por tubulação para cima e para baixo.
    6. Transfira o tubo para o rack magnético. Incubar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    7. Com o tubo no rack magnético, remova o supernaspeso.
    8. Repita a etapa de lavagem com 1 mL 1x B&W buffer (passos 10.4.5 – 10.4.7) duas vezes mais para um total de 3 lavagens.
    9. Remova o tubo do rack magnético e retire as contas em 52 μL de tampão de B&W de 2x por amostra.
  5. Combine 50 μL das contas preparadas com 50 μL de PCR1 purificado (a partir da etapa 10.3). Pipeta para misturar.
  6. Gire em temperatura ambiente por 30 minutos.
  7. Lavar o DNA desvinculado:
    1. Resumidamente, centrífuga para coletar líquido na parte inferior do tubo (~ 2 s).
    2. Transfira o tubo para o rack magnético. Incubar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    3. Com o tubo no rack magnético, remova o supernaspeso.
    4. Remova o tubo do rack magnético, lave as contas resusus pendentes em 100 μL 1x B&W tampão e pipetação para cima e para baixo.
    5. Transfira o tubo para o rack magnético. Incubar por ~ 2 min até que a solução esteja clara.
    6. Com tubo no rack magnético, remova o supernaspeso.
    7. Repita as etapas de lavagem com 100 μL LoTE (etapas 10.7.4 – 10.7.6) duas vezes mais para um total de 3 lavagens.
  8. Configuração PCR 2 conforme descrito na Tabela 1 para amplificar as junções transposon e adicionar um único código de barras a cada amostra(Tabela 2 e Tabela 3).
  9. Execute o PCR 2 usando condições descritas na Tabela 1.
  10. Purifique com 40 μL de contas paramagnéticas de seleção de tamanho (etapas 9.3.1 – 9.3.12). Elute em 17 μL de água (passos 9.3.13 – 9.3.16), coletar ~ 15 μL.
  11. Quantifique a concentração de DNA usando um fluorômetro. As concentrações finais devem ser de ~ 50 a 250 ng/μl.
  12. Avalie a qualidade do DNA utilizando eletroforese capilar baseada em chip(Figura 4A).

Resultados

Os métodos descritos descrevem a geração de uma biblioteca transposon de alta densidade em A. baumannii cep ATCC 17978 através de conjugação bacteriana utilizando E. coli MFD DAP-, que replica o plasmídeo pJNW684 (Figura 4B). O protocolo detalhado utiliza a conjugação bacteriana bi-parental para transferência de pJNW684 da cepa E. coli λpir+ doador para a cepa receptora A. baumannii. Este é um método eficiente e barato pa...

Discussão

A. baumannii é uma ameaça emergente à saúde pública global devido à rápida aquisição da AMR contra terapêuticas de "última linha", como colistina10,,11,12,,23,,24,,30,,31. Nas últimas décadas, tn-seq tem desempenhado um papel crítico na elucidação das interações ge...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por financiamento do Instituto Nacional de Saúde (Grant AI146829 a J.M.B.) e é reconhecido com gratidão.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-TriphosphateAffymetrix77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-TriphosphateInvitrogen10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight MarkerPromegaPR-G2101
100mm x 15mm Petri DishesCorning351029
150mm x 15mm Petri DishesCorning351058
1X B&WN/AN/ADilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acidAlfa AesarB2239103used at 600 µM
2X B&WN/AN/AAdd 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTPN/AN/A9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA PolymeraseInvitrogen12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978ATCCN/AAmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)Fisher ScientificBP1760used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification systemBECKMAN COULTERA63881
BioAnalyzerAgilentG2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA AnalysisAgilent5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)New England Biolabs (NEB)N0447L
DynaMag-2 Magnetic rackInvitrogen12321D
E.coli MFD Dap-N/AN/ADAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
EthanolFisher ScientificA4094
Externally Threaded Cryogenic VialsCorning09-761-71
Glass beadsCorning72684
GlycerolFisher ScientificG33
Inoculating loopsFisher Scientific22-363-602Scraping tool
KanamycinFisher ScientificBP906used at 25 mg/L
LB agar, MillerFisher ScientificBP1425
LB broth, MillerFisher ScientificBP1426
LoTEN/AN/AAdd 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis bufferN/AN/A9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)Fisher ScientificBP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X SolutionFisher ScientificBP39920Diluted to 1X
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33238
Qubit Assay TubesThermo FisherQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851
Sonicator with refridgerated waterbathQsonica SonicatorsQ2000FCE
Streptavidin Magnetic BeadsNew England Biolabs (NEB)S1420S
TE bufferN/AN/A10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)PromegaPR-M1875

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