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Resumen

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Resumen

La secuenciación de Transposon (Tn-seq) es un método potente que combina la mutagénesis transposon y la secuenciación paralela masiva para identificar genes y vías que contribuyen a la aptitud bacteriana bajo una amplia gama de condiciones ambientales. Las aplicaciones de Tn-seq son extensas y no sólo han permitido examinar las relaciones genotipo-fenotipo a nivel de organismo, sino también a nivel de población, comunidad y sistemas. Las bacterias gramnegativas están altamente asociadas con fenotipos de resistencia a los antimicrobianos, lo que ha aumentado los incidentes de fracaso del tratamiento con antibióticos. La resistencia a los antimicrobianos se define como crecimiento bacteriano en presencia de antibióticos letales. La colistina antimicrobiana de "última línea" se utiliza para tratar las infecciones bacterianas Gram-negativas. Sin embargo, varios patógenos Gram-negativos, incluyendo Acinetobacter baumannii pueden desarrollar resistencia a la colistina a través de una gama de mecanismos moleculares, algunos de los cuales se caracterizaron usando Tn-seq. Además, las vías de transducción de señales que regulan la resistencia a la colistina varían dentro de las bacterias Gram-negativas. Aquí proponemos un método eficiente de mutagénesis transposon en A. baumannii que agiliza la generación de una biblioteca de inserción de transposon saturante y la construcción de la biblioteca de amplicon eliminando la necesidad de enzimas de restricción, ligadura de adaptador y purificación de gel. Los métodos descritos en este documento permitirán un análisis en profundidad de los determinantes moleculares que contribuyen a la aptitud de A. baumannii cuando se enfrentan al desafío con colistina. El protocolo también es aplicable a otros patógenos GRAM-negativos ESKAPE, que se asocian principalmente con infecciones adquiridas en hospitales resistentes a losmedicamentos.

Introducción

El descubrimiento de antibióticos es sin duda uno de los eventos más impactantes relacionados con la saluddel siglo XX. Los antibióticos no solo resuelven rápidamente las infecciones bacterianas graves, sino que también desempeñan un papel fundamental en la medicina moderna. Las cirugías mayores, los trasplantes y los avances en la medicina neonatal y la quimioterapia dejan a los pacientes susceptibles a infecciones potencialmente mortales y estas terapias no serían posibles sin antibióticos1,2. Sin embargo, el rápido desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos entre los patógenos humanos ha disminuido significativamente la eficacia de todas las clases clínicamente importantes de antibióticos3. Muchas infecciones bacterianas que una vez fueron fácilmente despejadas con tratamiento con antibióticos, ya no responden a los protocolos de tratamiento clásicos, causando una grave amenaza a la salud pública mundial1. La resistencia a los antimicrobianos (AMR) es donde las células bacterianas crecen en concentraciones letales de antibióticos, independientemente de la duración del tratamiento4,5. Es urgente comprender los factores moleculares y bioquímicos que regulan la resistencia a los antimicrobianos, lo que ayudará a guiar el desarrollo antimicrobiano alternativo. Específicamente, los patógenos de ESKAPE son problemáticos en entornos clínicos y asociados con una amplia ERM. Estos incluyen Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp. Mientras que varios mecanismos contribuyen a la AMR en patógenos ESKAPE, estos últimos cuatro organismos son Gram-negativos.

Las bacterias Gram-negativas ensamblan una membrana externa definitoria que las protege de condiciones ambientales adversas. La membrana externa sirve como una barrera de permeabilidad para restringir la entrada de moléculas tóxicas, como antibióticos, en la célula. A diferencia de otras membranas biológicas, la membrana externa es asimétrica. El prospecto exterior está enriquecido con lipopolisacárido expuesto a la superficie, mientras que el prospecto interno es una mezcla de fosfolípidos6. Las moléculas de lipopolisacárido están ancladas a la membrana externa por una mitad de lípido conservada Una incrustada dentro de la bica procapa lipídica7. El lípido canónico Un dominio de Escherichia coli lipopolisacárido es necesario para el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-negativas y es sintetizado por una vía enzimática de nueve pasos que es una de las vías más fundamentales y conservadas en organismos Gram-negativos6,,7,,8.

Las polimixinas son péptidos antimicrobianos catiónicos que se dirigen al lípido Un dominio de lipopolisacárido para perturbar la membrana externa y izar la célula. La interacción electrostática entre los residuos cargados positivamente de polimixinas y los grupos de fosfato A de lípidos cargados negativamente interrumpen la membrana celular bacteriana, lo que en última instancia conduce a la muerte celular9,10,11,12,13. La colistina (polimixina E) es un antimicrobiano de último recurso utilizado para tratar infecciones causadas por patógenos nosocomiales Gram-negativos multirresistentes, como Acinetobacter baumannii14,15,16. Descubiertas por primera vez en 1947, las polimixinas son producidas por las bacterias del suelo, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Las polimixinas se recetaron para tratar las infecciones Gram-negativas durante años antes de que su uso clínico fuera limitado debido a los informes de nefro- y neurotoxicidad significativa20,21.

A. baumannii es un patógeno Gram-negativo nosocomial que ha aumentado drásticamente la morbilidad y mortalidad de los resultados de los pacientes en las últimas décadas22. Lo que antes se consideraba un patógeno de baja amenaza, ahora supone un riesgo significativo para la infección adquirida en el hospital en todo el mundo debido a su increíble capacidad para adquirir AMR y alto riesgo de epidemia23,,24. A. baumannii representa más del 10% de las infecciones nosocomiales en los Estados Unidos. La enfermedad se manifiesta como neumonía, bacteriemia, infecciones del tracto urinario, infecciones de la piel y de los tejidos blandos, meningitis y endocarditis25. Las opciones de tratamiento para las infecciones por A. baumannii han disminuido debido a la resistencia contra casi todas las clases de antibióticos, incluyendo lactamos β, fluoroquinolonas, tetraciclina y aminoglucósidos23,,24. La prevalencia de aislados multirresistentes, ampliamente resistentes a los medicamentos y pan-drogas resistentes a A. baumannii ha dado lugar a un resurgimiento del tratamiento con colistina, que se pensaba que era una de las pocas opciones terapéuticas restantes que todavía eran eficaces contra A. baumanniimultirresistente. Sin embargo, el aumento de la resistencia a la colistina entre los aislados de A. baumannii ha amplificado aún más su amenaza para la salud pública mundial10,11,12,13,27,30,31.

Los recientes avances en las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, como la secuenciación de transposon (Tn-seq), han proporcionado herramientas importantes para avanzar en nuestra comprensión de la aptitud bacteriana in vitro e in vivo. Tn-seq es una poderosa herramienta que se puede aprovechar para estudiar las interacciones genotipo-fenotipo en bacterias. Tn-seq es ampliamente aplicable entre patógenos bacterianos, donde combina la mutagénesis de transposon tradicional con la secuenciación paralela masiva para mapear rápidamente sitios de inserción, que se pueden utilizar para vincular mutaciones de ADN a variantes fenotípicas en una escala genómica32,,33,,34,,35. Si bien los métodos de mutagénesis de transposon se han descrito previamente, los pasos generales son similares33. En primer lugar, se genera una biblioteca de inserción utilizando la mutagénesis transposon, donde cada célula bacteriana dentro de una población está restringida a una sola inserción de transposon dentro del ADN genómico (GDNA). Después de la mutagénesis, los mutantes individuales se agrupan. GDNA se extrae de la piscina mutante de inserción y las uniones transposon se amplifican y se someten a secuenciación de alto rendimiento. Las lecturas representan sitios de inserción, que se pueden asignar al genoma. Las inserciones de Transposon que reducen la condición física se caen rápidamente de la población, mientras que las inserciones beneficiosas se enriquecen. Tn-seq ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de cómo los genes afectan la aptitud bacteriana en el estrés33.

El sistema de transposión de marinero Himar1 codificado en pJNW684 fue construido y optimizado específicamente para el propósito de mutagénesis transposon. Incluye un marinertransposón marinero -familia que flanquea el gen de resistencia a la kanamicina, que se utiliza para la selección de mutantes de inserción transposon en A. baumannii. También codifica un promotor específico de A. baumannii que impulsa la expresión del gen codificante transposasa36. El transposon basado en marinerostambién contiene dos terminadores traslacionales aguas abajo del gen de resistencia a la kanamicina, que impide la lectura aguas abajo de la inserción37. pJNW684 también lleva un origen de replicación condicional RP4/oriT/oriR6K que requiere que el gen -pir aportado por la cepa del donante se replique38. En ausencia del gen de lospir, el vector pJNW684 que transporta la maquinaria de transposición no podrá replicarse en la cepa receptora A. baumannii 10,36,38. Por lo tanto, durante la conjugación bacteriana, sólo se inserta el transposón en el genoma receptor sin la inserción de fondo del plásmido, que transporta el gen de la transposasa. Esto es significativo porque la pérdida de actividad transposasa junto con el plásmido da como resultado un evento de transposición único y estable que impide que el transposón se mueva a diferentes lugares una vez que se inserta en el genoma receptor.

pJNW648 también ha sido probado para la actividad en otro organismo Gram-negativo, E. coli. El éxito en el montaje de una saturación de la biblioteca Tn-seq en la cepa de E. coli W3110 indicó que el sistema es susceptible de realizar mutagénesis en una amplia gama de patógenos, incluyendo Enterobacteriaceae. Además, el promotor específico de A. baumannii que impulsa la expresión transposasa puede intercambiarse rápidamente con un promotor específico de la especie. Por último, el gen de resistencia a la kanamicina se puede cambiar por otros casetes de resistencia, dependiendo del fenotipo AMR del organismo que se está estudiando.

Un factor que contribuye a la resistencia a la colistina en A. baumannii es la administración de dosis insuficientes, donde las bacterias están expuestas a la presión selectiva a niveles no letales39. Varios informes mostraron que las concentraciones antimicrobianas subinhibitorias pueden inducir respuestas reguladas que alteran la fisiología celular para reducir la susceptibilidad de toda la población bacteriana11,12,30,31. Usando Tn-seq, descubrimos factores que regulan la resistencia a la colistina en la cepa de A. baumannii ATCC 17978 después de la exposición a concentraciones inhibitorios10 y subinhibitorias de colistina. Este ejemplo detalla un método Tn-seq que agiliza la construcción y el enriquecimiento de una biblioteca mutante transposon saturada utilizando la familia basada en marinerosde transposones40,,41. Mientras que varios protocolos Tn-seq generan 20.000 - 100.000 mutantes35,42,43,44,45,46, el protocolo descrito en este documento puede generar rápidamente una biblioteca de transposonía de 400.000 + mutantes, que equivale aproximadamente a una inserción de transposon cada 10 pares de bases en A. baumannii10. Además, el tamaño de la biblioteca se puede escalar verticalmente sin un esfuerzo adicional significativo. Este método también elimina el requisito de endonucleos de restricción, ligaduras de adaptador y purificación de gel, lo que puede reducir la diversidad final de la biblioteca.

Protocolo

1. Preparación de tensión bacteriana

  1. Rayar la cepa "donante" (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabla de materiales) para colonias aisladas en agar Luria-Bertani complementado con 600 M de ácido diaminopélico (DAP), 100 mg/L de ampicilina y 25 mg/L de kanamicina. Incubar durante la noche a 37oC. Utilizando una sola colonia aislada, inocular 50 ml de caldo de Luria (LB) complementado con DAP de 600 m, 100 mg/L de ampicilina y 25 mg/L de kanamicina en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y etiquetarlo como "donante".
  2. Rayar la cepa "receptora" (A. baumannii cepa ATCC 17978, Tabla de materiales) para colonias aisladas en agar Luria-Bertani. Incubar durante la noche a 37oC. Usando una sola colonia aislada, inocular 50 mL de LB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y etiquetarlo como "receptor".
  3. Incubar ambos cultivos ("donante" y "receptor") durante la noche a 37 oC con temblores.

2. Apareamiento bacteriano

  1. Transfiera cultivos nocturnos a tubos cónicos de 50 ml.
  2. Cultivos de pellets tanto receptores como donantes utilizando centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  3. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet de cepa "donante" en 35 ml de LB complementado con DAP para lavar los antibióticos residuales.
  4. Pele las células de cepa "donante" utilizando centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  5. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet de cepa "donante" en 4.5 mL de LB complementado con DAP. Utilice una pipeta serológica de 10 ml.
  6. Transfiera la cepa resuspendida "donante" en el tubo de cepa "receptor", que contiene las células peletadas del "receptor". Utilice la misma pipeta serológica de 10 ml del paso 2.5 para mezclar los cultivos. Pase inmediatamente al siguiente paso.
    NOTA: El volumen total de la suspensión final debe ser de 5 ml.
  7. Distribuir la suspensión de acoplamiento como gotas individuales de 100 l en placas de agar LB suplementadas con DAP (5-7 gotas por placa) (Figura 1A).
  8. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 min.
  9. Sin perturbar las gotas, transfiera cuidadosamente las placas a una incubadora de 37oC y permita que los cultivos se apareen durante 1h.
    NOTA: Los períodos de incubación superiores a 1 h corren el riesgo de la generación de mutantes hermanos.
  10. Después de la incubación, añadir 1,5 ml de LB en cada plato y cosechar resuspendiendo bacterias de las placas. Utilice una micropipeta de 1 ml para la resuspensión. El volumen final debe ser de aproximadamente 12 - 15 ml.
  11. Combine las células cosechadas en un tubo cónico de 50 ml.
  12. Pele el pelado de las células acopladas usando centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  13. Deseche las células sobrenadantes y resuspendidas en 50 ml de LB para eliminar el DAP residual.
  14. Pele el apareamiento usando centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  15. Repita el paso de lavado (pasos 2.13 y 2.14).
  16. Usando una pipeta serológica de 10 ml, resuspender el pellet en 10 ml de LB complementado con 25% de glicerol.
  17. Usando células lavadas, haga cinco diluciones en serie en caldo LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Esparce 100 l de cada dilución en 4 placas diferentes utilizando cuentas de vidrio estériles: Agar Luria-Bertani complementado con kanamicina, agar complementado con ampicilina, agar complementado con DAP y agar solamente.
  19. Incubar las placas a 37oC durante la noche.
  20. Aliquot el apareamiento restante en 1 mL alícuotas y almacenar a -80 oC.

3. Determinar la dilución adecuada de la biblioteca transposon

  1. Registre las unidades formadoras de colonias (CFU) de placas nocturnas.
  2. Imagen de una placa con colonias con recuento para cada condición de placa diferente (Figura 2A).
    NOTA: Tanto las cepas de "donante" como las "receptoras" deben crecer en placas de agar suplementadas con DAP, por lo que la mayoría de las diluciones chapadas producirán un césped. Sólo la cepa "receptora" puede crecer en las placas de agar. Ni el "donante" ni la cepa "receptora" pueden crecer en placas de agar suplementadas con ampicilina, por lo que no debe haber ningún crecimiento/mínimo. Sólo las células de deformación unitaria objetivo que codifican la inserción del transposon pueden crecer en placas de agar suplementadas con kanamicina. Las colonias deben variar en tamaño, lo que indica inserciones de transposon en genes que contribuyen a la aptitud en el agar complementado con kanamicina.
  3. Calcular el número de mutantes transposon en el apareamiento congelado contando el número de colonias en placas de agar LB complementadas con kanamicina.
    NOTA: Para el genoma de A. baumannii (aproximadamente 4 Mbps), el objetivo era obtener alrededor de 400.000 colonias con el fin de generar una biblioteca mutante de alta resolución (aproximadamente una inserción de transposon/10 pares base). Sin embargo, este número debe optimizarse en función del tamaño del genoma de la especie objetivo).

4. Generación de la biblioteca mutante bacteriana final

  1. Descongelar una alícuota del apareamiento congelado sobre hielo.
  2. Acoplamiento de placas en placas de agar Luria-Bertani de 150 mm suplementadas con kanamicina basada en UFC calculadas en el paso 3.1. Ajuste el volumen con LB para producir 13.333 colonias por 150 ml antes del enchapado.
    NOTA: Se determinó que el recuento de UFC era de unos 105 CFU/ml, por lo que el volumen de acoplamiento se ajustó para obtener 13,333 colonias por placa, ya que esto proporcionaría un número óptimo de colonias en 30 placas para una biblioteca mutante de alta resolución sin hacinamiento de las placas.
  3. Utilice perlas de vidrio estériles para esparcir 150 l de la dilución por placa en placas de agar Luria-Bertani de 30 x 150 mm complementadas con kanamicina para obtener 400.000 colonias(Figura 1C).
    NOTA: Se pueden utilizar varillas estériles o cualquier tipo de herramienta de esparcidor estéril (es decir, cuentas de vidrio) para esparcir las bacterias en las placas.
  4. Deseche el tubo usado que contiene el exceso de apareamiento.
    NOTA: Los ciclos de congelación/descongelación añaden presiones selectivas sobre el cultivo bacteriano, que pueden sesgar los resultados del experimento Tn-seq. Use una alícuota fresca cada vez.
  5. Incubar las placas a 37oC durante 14 h.
    NOTA: El tiempo de incubación está optimizado para evitar el crecimiento excesivo (colonias que se tocan). Se sugiere minimizar el crecimiento reduciendo el tiempo de incubación.

5. Estimación de la densidad de la biblioteca y agrupación para el almacenamiento

  1. Cuenta las UFC en cada plato para estimar el total de mutantes en la biblioteca de transposones. Contar el 20% de al menos 3 placas para determinar la estimación del recuento de colonias para todo el grupo de placas (Figura 2A). Asegúrese de que las colonias no toquen otra colonia.
  2. Después de calcular el rendimiento estimado de la colonia, agregue 3-5 mL de LB (o más si es necesario) a cada plato y raspe las bacterias usando una herramienta de raspado estéril.
    NOTA: Se utilizaron bucles de inoculación estériles para raspar placas de manera eficiente.
  3. Agrupación de suspensiones bacterianas de todas las placas en tubos cónicos de 50 ml(Figura 1D). Esto requerirá múltiples tubos cónicos de 50 ml, al menos 3.
  4. Suspensión bacteriana agrupada con pellets mediante centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  5. Deseche el sobrenadante y el pellet resuspend en 5 ml de LB complementado con 30% de glicerol.
  6. Aliquot 1 mL de la biblioteca transposon en criooviales y almacenar a -80 oC.

6. Identificación de factores que regulan la resistencia a la colistina en A. baumannii

  1. Preparar matraces Erlenmeyer de 4 x 250 ml con cada uno de los que contengan caldo y etiqueta LB de 50 ml como (Figura 2B)
    1. A. baumannii cepa ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (-) colistin_1
    2. A. baumannii cepa ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (-) colistin_2
    3. A. baumannii cepa ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (+) colistin_1
    4. A. baumannii cepa ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (+) colistin_2
      NOTA: En el crecimiento del desafío descrito aquí, cada condición, (-) control de colistina y (+) desafío de colistina, se está probando por duplicado. Por lo tanto, la configuración requiere matraces Erlenmeyer de 4 x 250 ml, dos por condición.
  2. Añadir 50 ml de 0,5 mg/L de colistina a (+) matraces de colistina (6.1.3 y 6.1.4) y 50 ml de agua a (-) frascos de colistina (6.1.1 y 6.1.2).
  3. Descongelar una alícuota de la biblioteca Tn-seq congelada del paso 5 sobre hielo.
  4. Pipetear 1 l de la biblioteca descongelada en 1 ml de PBS.
  5. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600)y multiplique por 1.000.
    NOTA: Esto determina el OD600 de 1 l de la biblioteca Tn.
  6. Basándose en el cálculo del paso 6.5, inocular cada matraz que contenga 50 ml de LB a un OD final600 0.001.
  7. Cultivar cultivos en una incubadora de temblores a 37 oC aOD 600 0.5.
    NOTA: Es importante que las culturas permanezcan en fase de crecimiento logarítmico, por lo que si su cepa está en un OD600 diferente durante el crecimiento exponencial, el OD600 debe ajustarse para garantizar que el cultivo se replique tantas veces como sea posible dentro de la fase de crecimiento logarítmico. Si la cultura sólo se replica 3 veces, el poder de detectar defectos de aptitud en mutantes se limita a diferencias de 3 veces, en teoría. Dado que las diferentes bacterias tienen diferentes tiempos de duplicación, es importante sembrar los cultivos en un OD600 fijo para normalizar el inóculo inicial. Esto garantiza una representación coherente de toda la biblioteca en todas las referencias culturales.
  8. Cultivos de cosecha utilizando centrifugación a 5.000 x g a 4oC durante 7 min.
  9. Retire el sobrenadante y lávelo con 50 ml de PBS.
  10. Pellets que utilizan centrifugación a 5.000 x g a 4oC durante 7 min.
  11. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 1 ml de PBS. Alícuota a 200 ml en 5 tubos de microcentrífuga.
  12. Pellet usando centrifugación a 5.000 x g a 4oC durante 5 min. Retire todo el sobrenadante con una punta de pipeta.
  13. Almacene los pellets a -20 oC o proceda con la extracción de gDNA.

7. extracción de gDNA

  1. Descongelar un pellet de celda sobre hielo.
  2. Añadir 0,6 ml de tampón de lísis(Tabla de materiales)y vórtice para resuspender completamente el pellet.
  3. Incubar a 37oC durante 1 h.
  4. Añadir 0,6 ml de alcohol fenol/cloroformo/isoamilo a la muestra y vórtice vigorosamente.
  5. Separe las fases utilizando centrifugación en una microcentrífuga a máxima velocidad a temperatura de la habitación durante 5 minutos.
  6. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Evite perturbar la interfaz de fase durante la transferencia.
  7. Añadir un volumen igual de cloroformo a la fase acuosa obtenida arriba y vórtice vigorosamente.
  8. Separe las fases utilizando centrifugación en microcentrífuga a máxima velocidad a temperatura de la habitación durante 5 min.
  9. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
    NOTA: Asegúrese de evitar perturbar la interfaz durante la transferencia.
  10. Añadir 2,5 veces el volumen de fase acuosa de etanol frío al 100 % y mezclar suavemente. El ADN precipitado será visible.
  11. Colocar el tubo a -80 oC durante al menos 1 h.
  12. ADN de pellets utilizando centrifugación a velocidad máxima a 4 oC durante 30 min.
  13. Retire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet de ADN y lave con 150 ml de etanol al 70 % por pipeteo.
  14. ADN de pellets utilizando centrifugación a velocidad máxima a 4 oC durante 2 min.
  15. Retire con cuidado el sobrenadante.
  16. Repita el paso 7.14 una vez. Retire con cuidado todo el etanol restante.
  17. Seque el ADN incubando en la temperatura de la habitación durante 5-10 min.
  18. Resuspend PELLET de ADN en tampón de 100 l TE por pipeteo.

8. Cizallamiento del ADN (Figura 3A)

  1. Diluir el gDNA con tampón TE a una concentración de 250 ng/ml en un volumen total de 200 l.
  2. Coloque los tubos en un sonicador de baño de agua.
  3. Sonicar ADN para producir fragmentos de aproximadamente 300 nucleótidos. Potencia: 60 %, Tiempo total: 20 min, Ciclos: 10 s ON y 10 s OFF a 4oC(Figura 3A).
  4. Confirmar que el ADN se corta adecuadamente separando 10 ml de ADN sin alinear y 10 ml de ADN cizallado en un gel de agarosa al 1%. Repita la sonicación u optimice según sea necesario(Figura 3B).

9. Adición de cola poly-C al extremo 3'(Figura 3A)

  1. Configure la reacción de poli-C de acuerdo con la Tabla 1.
  2. Incubar la reacción a 37oC durante 1 h.
  3. Purifique la reacción de poli-C con 40 ml de perlas paramagnéticas de selección de tamaño (Figura 3A) siguiendo los pasos a continuación.
    1. Añadir 40 l de perlas paramagnéticas de selección de tamaño a cada muestra. Vórtice a 5 s o pipeta arriba y abajo.
    2. Incubar muestras a temperatura ambiente durante 5 min.
    3. Brevemente, tubos centrífugos para recoger líquido en la parte inferior del tubo (2 s).
    4. Transfiera los tubos a un bastidor magnético e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos hasta que la solución esté limpia.
    5. Con los tubos en el bastidor magnético, retire cuidadosamente el sobrenadante.
    6. Con tubos en rack magnético, agregue 200 l de etanol 80% recién preparado (no moleste perlas).
    7. Incubar muestras durante al menos 30 s hasta que la solución esté clara.
    8. Con los tubos en el bastidor magnético, retire cuidadosamente el sobrenadante.
    9. Repita el paso de lavado (pasos 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Recoger el líquido en la parte inferior del tubo utilizando un breve paso de centrifugación (2 s).
    11. Transfiera los tubos al bastidor magnético y retire el líquido restante.
    12. Incubar a temperatura ambiente durante 2-5 min para secar las muestras. No secar demasiado.
    13. Retire los tubos del bastidor magnético y añada 25 ml de agua a cada uno. Vórtice para 5 s o pipeta arriba y abajo.
    14. Brevemente, tubos centrífugos para recoger líquido en la parte inferior del tubo (2 s).
    15. Transfiera los tubos al bastidor magnético y deje reposar durante 2 minutos hasta que la solución esté clara.
    16. Con los tubos en el bastidor magnético, retire el líquido sin alterar las perlas y transfiera a un tubo nuevo (23 l de ADN).

10. Amplificación de la unión Transposon (Figura 3A)

  1. Configuración de PCR 1 como se describe en el Cuadro 1 para el primer PCR anidado (Tabla 2).
  2. Realice el PCR 1 utilizando las condiciones descritas en el Cuadro 1.
  3. Productos de PCR de purificación con 40 ml de perlas paramagnéticas de selección de tamaño (pasos 9.3.1 – 9.3-12). Eluido en 50 l de agua (pasos 9.3.13 – 9.3.16). En este punto, las muestras se pueden almacenar a -20 oC.
  4. Preparar cuentas paramagnéticas acopladas a Streptavidin:
    1. Resuspend Streptavidin cuentas agitando vigorosamente.
    2. Añadir 32 l de perlas por muestra a un tubo de microcentrífuga fresco.
      NOTA: Las perlas para 6 + muestras se pueden preparar en un solo tubo.
    3. Transfiera el tubo a un bastidor magnético. Incubar durante 2 min hasta que la solución esté clara.
    4. Con el tubo en el bastidor magnético, retire el sobrenadante.
    5. Retire el tubo del bastidor magnético. Lave las perlas resuspending en 1 ml 1x B&W buffer pipetting arriba y abajo.
    6. Transfiera el tubo al bastidor magnético. Incubar durante 2 min hasta que la solución esté clara.
    7. Con el tubo en el bastidor magnético, retire el sobrenadante.
    8. Repita el paso de lavado con 1 ml de tampón en blanco y en blanco (pasos 10.4.5 – 10.4.7) dos veces más para un total de 3 lavados.
    9. Retire el tubo del bastidor magnético y los perlas resuspendidas en 52 ml de tampón en blanco y en blanco 2 veces por muestra.
  5. Combine 50 l de las perlas preparadas con 50 ml de PCR1 purificado (del paso 10.3). Pipeta para mezclar.
  6. Gire a temperatura ambiente durante 30 min.
  7. Lavar el ADN sin ataduras:
    1. Brevemente, centrífuga para recoger líquido en la parte inferior del tubo (2 s).
    2. Transfiera el tubo al bastidor magnético. Incubar durante 2 min hasta que la solución esté transparente.
    3. Con el tubo en el bastidor magnético, retire el sobrenadante.
    4. Retire el tubo del bastidor magnético, lave las perlas resuspendiendo en un tampón de 100 l 1x B&W y pipeteando arriba y abajo.
    5. Transfiera el tubo al bastidor magnético. Incubar durante 2 min hasta que la solución esté transparente.
    6. Con el tubo en el bastidor magnético, retire el sobrenadante.
    7. Repita los pasos de lavado con 100 l de LoTE (pasos 10.7.4 – 10.7.6) dos veces más para un total de 3 lavados.
  8. Configure PCR 2 como se describe en la Tabla 1 para amplificar los cruces de transposon y añadir un único código de barras a cada muestra(Tabla 2 y Tabla 3).
  9. Realice el PCR 2 utilizando las condiciones descritas en el Cuadro 1.
  10. Purificar con 40 l de perlas paramagnéticas de selección de tamaño (pasos 9.3.1 – 9.3.12). Eluuto en 17 l de agua (pasos 9.3.13 – 9.3.16), recoger a 15 l.
  11. Cuantificar la concentración de ADN utilizando un fluorómetro. Las concentraciones finales deben ser de 50 a 250 ng/l.
  12. Evaluar la calidad del ADN mediante electroforesis capilar a base de virutas (Figura 4A).

Resultados

Los métodos descritos describen la generación de una biblioteca transposon de alta densidad en la cepa A. baumannii ATCC 17978 a través de la conjugación bacteriana utilizando E. coli MFD DAP-, que replica el plásmido pJNW684 (Figura 4B). El protocolo detallado utiliza la conjugación bacteriana bi-parental para la transferencia de pJNW684 de la cepa de donante E. coli ápir+ a la cepa receptora de A. baumannii. Este es un métod...

Discusión

A. baumannii es una amenaza emergente para la salud pública mundial debido a la rápida adquisición de AMR contra las terapias de "última línea", como la colistina10,,11,12,23,24,30,31. En las últimas décadas, Tn-seq ha desempeñado un papel fundamental en el esclarecer las in...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la financiación del Instituto Nacional de Salud (Grant AI146829 a J.M.B.) y es reconocido con gratitud.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-TriphosphateAffymetrix77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-TriphosphateInvitrogen10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight MarkerPromegaPR-G2101
100mm x 15mm Petri DishesCorning351029
150mm x 15mm Petri DishesCorning351058
1X B&WN/AN/ADilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acidAlfa AesarB2239103used at 600 µM
2X B&WN/AN/AAdd 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTPN/AN/A9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA PolymeraseInvitrogen12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978ATCCN/AAmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)Fisher ScientificBP1760used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification systemBECKMAN COULTERA63881
BioAnalyzerAgilentG2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA AnalysisAgilent5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)New England Biolabs (NEB)N0447L
DynaMag-2 Magnetic rackInvitrogen12321D
E.coli MFD Dap-N/AN/ADAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
EthanolFisher ScientificA4094
Externally Threaded Cryogenic VialsCorning09-761-71
Glass beadsCorning72684
GlycerolFisher ScientificG33
Inoculating loopsFisher Scientific22-363-602Scraping tool
KanamycinFisher ScientificBP906used at 25 mg/L
LB agar, MillerFisher ScientificBP1425
LB broth, MillerFisher ScientificBP1426
LoTEN/AN/AAdd 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis bufferN/AN/A9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)Fisher ScientificBP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X SolutionFisher ScientificBP39920Diluted to 1X
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33238
Qubit Assay TubesThermo FisherQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851
Sonicator with refridgerated waterbathQsonica SonicatorsQ2000FCE
Streptavidin Magnetic BeadsNew England Biolabs (NEB)S1420S
TE bufferN/AN/A10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)PromegaPR-M1875

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