الآثار الإيكولوجية للبلاستيك الدقيق على نمو جنين الطيور عن طريق الفقس دون قشر البيض

Summary

تقدم هذه الورقة طريقة الفقس دون استخدام قشر البيض للدراسات السمية لملوثات الجسيمات مثل البلاستيك الدقيق.

Abstract

البلاستيك الدقيق هو نوع من الملوثات العالمية الناشئة التي تشكل تهديدا صحيا كبيرا للحيوانات بسبب امتصاصها ونقلها في الأنسجة الحيوانية والأعضاء. الآثار الإيكولوجية للبلاستيك الدقيق على تطور أجنة الطيور غير معروفة. بيضة الطيور هي نظام تطوير وتغذية كامل ، ويحدث تطور الجنين بأكمله في قشر البيض. لذلك ، فإن السجل المباشر لتطور جنين الطيور تحت ضغط الملوثات مثل البلاستيك الدقيق محدود للغاية بسبب قشر البيض المبهم في الفقس التقليدي. في هذه الدراسة، تم رصد آثار البلاستيك الدقيق على نمو جنين السمان بصريا عن طريق الفقس دون قشر البيض. وتشمل الخطوات الرئيسية تنظيف وتطهير البويضات المخصبة، والحضانة قبل التعرض، والحضانة القصيرة الأجل بعد التعرض، واستخراج العينة. تظهر النتائج أنه بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، أظهر الوزن الرطب وطول الجسم للمجموعة المعرضة للبلاستيك الدقيق فرقا إحصائيا وزادت نسبة الكبد للمجموعة المعرضة بالكامل بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتقييم العوامل الخارجية التي تؤثر على الحضانة: درجة الحرارة والرطوبة وزاوية دوران البيض وغيرها من الحالات. وتوفر هذه الطريقة التجريبية معلومات قيمة عن التكسينات الإيكولوجية للبلاستيك الدقيق وطريقة جديدة لدراسة الآثار الضارة للملوثات على نمو الأجنة.

Introduction

بلغ إنتاج النفايات البلاستيكية حوالي 6300 طن متري في عام 2015، تم إعادة تدوير عشرها، وتم حرق البقية أو دفنها تحت الأرض. وتشير التقديرات إلى أن حوالي 12000 طن من النفايات البلاستيكية سيتم دفنها تحت الأرض بحلول عام 2050^1. مع اهتمام المجتمع الدولي للنفايات البلاستيكية، اقترح طومسون لأول مرة مفهوم البلاستيك الدقيق في عام 2004². تشير البلاستيك الدقيق (أعضاء البرلمان) إلى البلاستيك الجسيمات الصغيرة التي يقل قطرها عن 5 ملم. في الوقت الحاضر، اكتشف الباحثون وجود أعضاء البرلمان في كل مكان في الساحل من مختلف القارات، وجزر المحيط الأطلسي، والبحيرات الداخلية، والقطب الشمالي، وموائل أعماق البحار^{3و4و5و6و7}. ولذلك، بدأ المزيد من الباحثين في دراسة المخاطر البيئية لأعضاء البرلمان.

يمكن للكائنات الحية استيعاب أعضاء البرلمان في البيئة. تم العثور على أعضاء البرلمان في الجهاز الهضمي من 233 الكائنات البحرية في جميع أنحاء العالم (بما في ذلك 100٪ أنواع السلاحف، 36٪ أنواع الفقمة، 59٪ أنواع الحيتان، 59٪ أنواع الطيور البحرية، 92 نوعا من الأسماك البحرية، و 6 أنواع من اللافقاريات)⁸. وعلاوة على ذلك، قد يمنع أعضاء البرلمان الجهاز الهضمي للكائنات الحية، وتتراكم، وتهاجر في البوب⁹بهم . وقد تبين أنه يمكن نقل أعضاء البرلمان عبر السلسلة الغذائية، ويختلف مداها مع التغيرات في الموائل، ومرحلة النمو، وعادات التغذية، ومصادر الغذاء^10. وأفاد بعض الباحثين بوجود أعضاء البرلمان في فضلات الطيور البحرية¹¹، مما يعني أن الطيور البحرية تعمل كناقل لأعضاء البرلمان. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤثر ابتلاع أعضاء البرلمان على صحة بعض الكائنات الحية. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون أعضاء البرلمان متشابكين في الجهاز الهضمي ، وبالتالي زيادة وفيات الحيتانيات¹².

فلنواب وحدهم لهم آثار سامة على الكائنات الحية، فضلا عن الآثار السامة المشتركة على الكائنات الحية ذات الملوثات الأخرى. ابتلاع تركيزات ذات الصلة بالبيئة من الحطام البلاستيك قد يزعج وظيفة نظام الغدد الصماء من الأسماك البالغة¹³. حجم البلاستيك الدقيق هو واحد من العوامل الهامة التي تؤثر على امتصاصها وتراكمها من قبل الكائنات الحية^14،15. البلاستيك صغير الحجم ، وخاصة البلاستيك نانو الحجم ، عرضة للتفاعل مع الخلايا والكائنات الحية ذات السمية العالية^{16،17،18،19}. وعلى الرغم من أن الآثار الضارة للبلاستيك الدقيق بحجم الجسيمات النانوية على الكائنات الحية تتجاوز مستوى البحوث الحالي، فإن الكشف عن البلاستيك الدقيق وتحديد حجمه بأحجام تقل عن عدة ميكرومترات، ولا سيما البلاستيك دون الميكرون/نانو في البيئة، لا يزال يشكل تحديا كبيرا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البلاستيك النانوي له أيضا بعض الآثار على الأجنة. البوليسترين يمكن أن تلحق الضرر تطوير أجنة قنفذ البحر من خلال تنظيم البروتين والجينات ملامح²⁰.

لاستكشاف التأثير المحتمل لأعضاء البرلمان على الكائنات الحية، أجرينا هذه الدراسة. نظرا للتشابه بين أجنة الطيور والأجنة البشرية ، وعادة ما تستخدم في بحوث البيولوجيا التنموية²¹ بما في ذلك تولد الأوعية وتولد الأوعية ، وهندسة الأنسجة ، وزرع المواد الحيوية ، وأورام الدماغ^22،23،24. أجنة الطيور لديها مزايا منخفضة التكلفة، ودورة ثقافة قصيرة وسهلة التشغيل^25،26. لذلك، اخترنا أجنة السمان مع دورة نمو قصيرة كحيوان تجريبي في هذه الدراسة. في وقت واحد، يمكننا أن نلاحظ مباشرة التغيرات المورفولوجية لأجنة السمان المعرضة لأعضاء البرلمان خلال مرحلة النمو الجنيني باستخدام تكنولوجيا الفقس الخالية من قشر البيض. وكانت المواد التجريبية المستخدمة هي البولي بروبلين (PP) والبوليسترين (PS). لأن PP و PS²⁷ تمثل أكبر نسبة من أنواع البوليمر التي تم الحصول عليها في الرواسب والمائيات في جميع أنحاء العالم، وأنواع البوليمر الأكثر شيوعا المستخرجة من الكائنات البحرية التي تم التقاطها هي الإيثيلين والبروبيلين^28. يصف هذا البروتوكول التجريبي العملية الكاملة للتقييم البصري للآثار السمية لأعضاء البرلمان على أجنة السمان المعرضة لأعضاء البرلمان. يمكننا بسهولة توسيع هذه الطريقة لفحص سمية الملوثات الأخرى لنمو الأجنة من الحيوانات الأخرى oviparous.

Protocol

1. التحضير قبل التعرض

1. اختر بويضات السمان المخصبة التي ولدت في نفس اليوم لاختبار التعرض.
2. حدد بيض السمان مع أوزان مماثلة. كل بويضة السمان المخصبة حوالي 10-12 غرام.
3. تنظيف جميع بيض السمان المخصبة بالكامل من البراز الخارجي والحطام الآخر.
4. تعقيم كل بيضة السمان المخصبة قبل فقست والبيض لاستخدامها (اختيار البيض مع شكل قذيفة مماثلة، وخاصة غيض من البيض) مع محلول مضاد حيوي (البنسلين والستريبتوميسين، 1:1000، درجة حرارة الغرفة). تعقيم الحاضنة مع الإيثانول 75٪.
5. فتح البيض مع نهاية حادة من مثقاب الأسنان، وترك قشر البيض في الطرف لمزيد من الاستخدام. قبل نقل البويضات المخصبة ، يتم سكب محتويات البويضات. هذا هو للحفاظ على رطوبة قشر البيض. وكان القطر الافتتاحي للبيضة حوالي 3 سم.
   ملاحظة: للحد من الضرر الذي يلحق بجنين السمان، استخدم مثقاب الأسنان لفتح الطرف الحاد من البويضة وجعل الكراك سلسا قدر الإمكان.
6. بعد التعقيم، ضع بويضات السمان المخصبة في حاضنة 38 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ لمدة 24-48 ساعة. تأكد من أن نهاية حادة من بيضة السمان يواجه.
7. أثناء حضانة بويضات السمان المخصبة، قم بتعقيم الأدوات اللازمة في التجارب اللاحقة في وعاء التعقيم. وتشمل هذه الأدوات التفاف البلاستيك، كوب، والمياه العقيمة، نصائح ماصة، مقص الجراحية على التوالي، ملاقط، وملعقة.
   ملاحظة: استخدم فيلما مع تحمل درجة حرارة عالية بما يكفي لتجنب المشاكل مع التعقيم في درجة حرارة عالية.

2. فقس بيضة السمان دون قذيفة

1. نقل بيض السمان المخصبة قبل فقست من الحاضنة إلى مقعد نظيف ووضعها مسطحة على الحاوية لتحقيق الاستقرار لهم لمدة 1-2 دقيقة.
2. استخدام مقص (12.5 سم الجراحية على التوالي مقص) لكزة ثقب صغير (قطر 3 ملم) في المحور المركزي للبيض السمان المخصبة قبل فقست وقطع 1-2 سم فتحة صغيرة. نقل بعناية بياض البيض وصفار بيض السمان المخصبة إلى قشر البيض قطع.
   ملاحظة: عند قطع فتحة صغيرة مع مقص، وتجنب لمس صفار بيض السمان.
3. إضافة حل التحكم (بدون أعضاء البرلمان) والحل المكشوف من الكتل المختلفة (0.1، 0.2، و 0.3 ملغ) من البلاستيك الدقيق مع ثلاثة أحجام الجسيمات (100، 200، و 500 نانومتر) إلى محتويات البيض عن طريق ماصة. في الوقت نفسه، إضافة 1 قطرة من البنسلين و 1 قطرة من الستربتومايسين مع حقنة 1 مل.
4. تغطية افتتاح قشر البيض مع الفيلم المعقم (الخطوة 1.6).
5. وفقا للخطوة 2.1-2.4، علاج جميع بويضات السمان المخصبة.
6. ضع أجنة السمان المنقولة في حاضنة 38 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ للفترة اللازمة. في هذه التجربة، استخدم زاوية دوران البيض من ±30 درجة. بدوره البيض مرة واحدة في الساعة.
   ملاحظة: يجب أن يكون النقل بأسرع وقت ممكن، الأمر الذي يتطلب المزيد من الممارسة في المرحلة المبكرة.

3. جمع العينات

1. بعد سبعة أيام من الثقافة، قم بإزالة الأجنة المتطورة التي لاحظتها العين المجردة من الصفار واغسلها بمحلول الفوسفات المخزن مؤقتا (PBS).
2. جفف محلول الفائض خارج الجنين النظيف بورق ماصة ووزنه في طبق بيتري نظيف.
3. افتح تجويف الصدر بالكامل، وافصل الكبد والقلب عن الأحشاء بكشة أنف إبرة، وضع في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل مباشرة بعد التطهير.
4. سجل بسرعة الوزن على التوازن الإلكتروني وحساب مؤشر الكبد (HIS = وزن الكبد / وزن الجسم × 100). قياس طول القص والجسم.
5. استنادا إلى المؤشرات المذكورة أعلاه، قم بتقييم تأثير أعضاء البرلمان على النمو الجنيني.
   ملاحظة: جودة الجنين هنا يشير إلى نوعية إزالة صفار.

4. تحليل البيانات

1. الإبلاغ عن البيانات التجريبية في شكل خطأ قياسي ± المتوسط (SEM).
2. استخدم تحليل الفرق أحادي العامل لمقارنة وسائل مجموعات متعددة من العينات. قيمة الفرق الهامة كانت α = 0.05.

النتائج

لتحليل البيانات التجريبية، قارنا الوزن الرطب وطول الجسم وطول القص وتغيير المؤشر الكبدي بين مجموعة التحكم والمجموعات التجريبية ال 6، وقياس وعكس نمو وتطور أجنة السمان من منظور كلي. اكتشفنا ستة أجنة سمان طبيعية في كل مجموعة. وصل كل جنين إلى مرحلة هامبورغر وهاملتون (HH) المطلوبة.

Discussion

تقدم هذه الورقة خطة تجريبية فعالة لتقييم نمو جنين السمان من خلال الكشف عن مؤشرات النمو الأساسية. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود على هذه التجربة.

أولا، معدل وفيات أجنة السمان في المرحلة اللاحقة من الفقس أعلى بسبب الفقس أقل قذيفة. هناك عوامل لا يمكن السيطرة عليها بشكل مصطنع ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi sample tissue grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	Tissuelyser-24	Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature
Electronic balance	OHAUS corporation	PR Series Precision	Used for weighing
Fertilized quail eggs	Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd.		Quail eggs for hatching without shell
Fluorescent polypropylene particles	Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd.		Types of plastics selected for the experiment
Incubator	Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd.	264 pc	Provide a place for embryo growth and development
Nanometer-scale polystyrene microspheres	Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd.	100 nm, 200 nm, 500 nm	Types of plastics selected for the experiment
Steel ruler	Deli Group	20 cm	Used to measure  length
Vertical heating pressure steam sterilizer	Shanghai Shenan Medical Instrument Factory	LDZM-80KCS-II	Sterilize the experimental articles