השפעות אקולוגיות של מיקרופלסטיק על התפתחות עובר ציפור על ידי בקיעה ללא קליפת ביצה

Summary

מאמר זה מציג שיטה של בקיעה ללא שימוש קליפת ביצה למחקרים טוקסיקולוגיים של מזהמי חלקיקים כגון מיקרופלסטיק.

Abstract

מיקרופלסטיק הוא סוג מזהם עולמי מתפתח המהווה איום בריאותי גדול על בעלי חיים בשל ספיגתם והעברתם ברקמות ובאיברים של בעלי חיים. השפעות אקולוגיות של מיקרופלסטיק על התפתחות עוברים ציפורים אינן ידועות. ביצת הציפור היא מערכת פיתוח ותזונה מלאה, וכל התפתחות העובר מתרחשת על קליפת הביצה. לכן, תיעוד ישיר של התפתחות העובר ציפור תחת הלחץ של מזהמים כגון מיקרופלסטיק מוגבל מאוד על ידי קליפת ביצה אטומה בקיעה המסורתית. במחקר זה, ההשפעות של מיקרופלסטיק על התפתחות עובר שליו היו מנוטרים חזותית על ידי בקיעה ללא קליפת ביצה. השלבים העיקריים כוללים ניקוי וחיטוי של ביצים מופרות, דגירה לפני החשיפה, הדגירה לטווח קצר לאחר החשיפה, ואת מיצוי המדגם. התוצאות מראות כי בהשוואה לקבוצת הביקורת, המשקל הרטוב ואורך הגוף של הקבוצה החשופה למיקרופלסטיק הראו הבדל סטטיסטי ושיעור הכבד של כל הקבוצה החשופה גדל באופן משמעותי. בנוסף, הערכנו גורמים חיצוניים המשפיעים על הדגירה: טמפרטורה, לחות, זווית סיבוב ביצה, ותנאים אחרים. שיטה ניסיונית זו מספקת מידע רב ערך על האקוטוקסיולוגיה של מיקרופלסטיק ודרך חדשנית לחקור את ההשפעות השליליות של מזהמים על התפתחות העוברים.

Introduction

ייצור פסולת הפלסטיק היה כ-6,300 הרים בשנת 2015, עשירית ממנו מוחזר, והשאר נשרף או נקבר מתחת לאדמה. ההערכה היא כי כ -12,000 הר של פסולת פלסטיק ייקבר מתחת לאדמה עד 2050¹. עם תשומת הלב של הקהילה הבינלאומית לפסולת פלסטיק, תומפסון הציע לראשונה את הרעיון של מיקרופלסטיק בשנת 2004². מיקרופלסטיק (MPs) מתייחס פלסטיק חלקיקים קטנים עם קוטר חלקיקים פחות מ 5 מ"מ. כיום, חוקרים זיהו את נוכחותם בכל מקום של חברי פרלמנט בקו החוף של יבשות שונות, האיים האטלנטיים, האגמים היבשתיים, הקוטב הצפוני ובתי גידול במעמקי הים^3,4,5,6,7. לכן, חוקרים נוספים החלו לחקור את הסיכונים הסביבתיים של חברי פרלמנט.

אורגניזמים יכולים לבלוע חברי פרלמנט בסביבה. חברי פרלמנט נמצאו במערכת העיכול של 233 אורגניזמים ימיים ברחבי העולם (כולל 100% מיני צבים, 36% מיני כלבי ים, 59% מיני לווייתנים, 59% מיני עופות ים, 92 סוגים של דגי ים ו -6 סוגים של חסרי חוליות)⁸. יתר על כן, חברי פרלמנט עשויים לחסום את מערכת העיכול של האורגניזמים, לצבור ולעבור בבובות שלהם⁹. נמצא כי חברי פרלמנט ניתן להעביר באמצעות שרשרת המזון, ואת צריכתם שונה עם השינויים של בית הגידול, שלב הצמיחה, הרגלי האכלה, ומקורות^{מזון 10}. כמה חוקרים דיווחו על קיומם של חברי פרלמנט גללים של עופות^{ים 11}, כלומר עופות ים לפעול כנשא של חברי פרלמנט. בנוסף, בליעה של חברי פרלמנט יכולה להשפיע על בריאותם של אורגניזמים מסוימים. לדוגמה, חברי פרלמנט יכולים להסתבך במערכת העיכול, ובכך להגדיל את התמותה של cetaceans¹².

חברי פרלמנט לבדם יש השפעות רעילות על אורגניזמים, כמו גם השפעות רעילות משותפות על אורגניזמים עם מזהמים אחרים. בליעה של ריכוזים הקשורים לסביבה של פסולת פלסטיק עלולה להפריע לתפקוד המערכת האנדוקרינית של דגים בוגרים¹³. גודל המיקרופלסטיק הוא אחד הגורמים החשובים המשפיעים על ספיגתם והצטברותם על ידי אורגניזמים^14,15. הפלסטיק בגודל קטן, במיוחד הפלסטיק בגודל ננו, נוטים אינטראקציה עם תאים ואורגניזמים עם רעילות גבוהה^16,17,18,19. למרות ההשפעות המזיקות של מיקרופלסטיק בגודל ננו-חלקיקים על אורגניזמים עולה על רמת המחקר הנוכחית, זיהוי וכימות של מיקרופלסטיק עם גדלים פחות מכמה מיקרומטרים, במיוחד תת מיקרו מיקרומטר / ננו-פלסטיק בסביבה, הוא עדיין אתגר גדול. בנוסף, ננו-פלסטיק יש גם כמה השפעות על עוברים. פוליסטירן יכול לפגוע בהתפתחות עוברים של קיפודי ים על ידי ויסות פרופילי חלבון וגנים²⁰.

כדי לחקור את ההשפעה הפוטנציאלית של חברי פרלמנט על אורגניזמים, ערכנו את המחקר הזה. בשל הדמיון בין עוברים ציפורים ועוברים אנושיים, הם משמשים בדרך כלל במחקר ביולוגי התפתחותי²¹ כולל אנגיוגנזה ו antiangiogenesis, הנדסת רקמות, שתל ביו חומרי, וגידולים במוח^22,23,24. לעוברי ציפורים יש את היתרונות של עלות נמוכה, מחזור תרבות קצר ותפעול קל^25,26. לכן, בחרנו עוברים שליו עם מחזור צמיחה קצר כחיה ניסיונית במחקר זה. בו זמנית, אנו יכולים לצפות ישירות בשינויים המורפולוגיים של עוברים שליו שנחשפו לחברי פרלמנט במהלך שלב ההתפתחות העוברית באמצעות טכנולוגיית בקיעה ללא קליפת ביצה. החומרים הניסיוניים בהם נעשה שימוש היו פוליפרופילן (PP) ופוליסטירן (PS). מכיוון ש- PP ו- PS²⁷ מהווים את השיעור הגדול ביותר של סוגי פולימרים המתקבלים משקעים וגופי מים ברחבי העולם, סוגי הפולימר הנפוצים ביותר המופקים מאורגניזמים ימיים שנתפסו הם אתילן ופרופילן²⁸. פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את כל התהליך להערכה חזותית של השפעות טוקסיקולוגיות של חברי פרלמנט על עוברים שליו שנחשפו לחברי פרלמנט. אנו יכולים בקלות להרחיב שיטה זו כדי לבחון רעילות של מזהמים אחרים להתפתחות העובר של בעלי חיים אחרים.

Protocol

1. הכנה לפני החשיפה

1. בחר ביצי שליו מופרות שנולדו באותו יום לבדיקת החשיפה.
2. בחר ביצי שליו עם משקולות דומות. כל ביצת שליו מופרית היא בערך 10-12 גרם.
3. נקה לחלוטין את כל ביצי שליו מופרות מצואה חיצונית ופסולת אחרת.
4. לחטא כל ביצית שליו מופרית מראש ואת הביצים לשימוש (בחר ביצים עם צורת קליפה דומה, במיוחד את קצה הביצית) עם פתרון אנטיביוטי (פניצילין וסטסטרוטומיצין, 1:1000, טמפרטורת החדר). לחטא את האינקובטור עם 75% אתנול.
5. פתח את הביצים עם הקצה הקהה של מקדחה דנטלית, משאיר את קליפת הביצה בקצה לשימוש נוסף. לפני העברת הביציות המופרות, את התוכן של הביצים נשפכים החוצה. זה כדי לשמור על הלחות של קליפת הביצה. קוטר הפתיחה של הביצה היה כ -3 ס"מ.
   הערה: כדי להפחית את הנזק לעובר שליו, השתמש מקדחה דנטלית כדי לפתוח את הקצה הקהה של הביצה ולהפוך את הסדק חלק ככל האפשר.
6. לאחר העיקור, מניחים את ביצי השליו מופרות באינקובטור 38 מעלות צלזיוס עם 60% לחות ל-24-48 שעות. ודא כי הקצה הקהה של ביצת שליו פונה למעלה.
7. במהלך הדגירה של ביצי שליו מופרות, לעקר את הכלים הדרושים בניסויים הבאים בסיר עיקור. כלים אלה כוללים ניילון נצמד,, מים סטריליים, טיפים פיפטה, מספריים ישרים כירורגיים, פינצטה, וכפית.
   הערה: השתמש בסרט עם סובלנות טמפרטורה גבוהה מספיק כדי למנוע בעיות עם עיקור בטמפרטורה גבוהה.

2. בוקעים את ביצת שליו ללא קליפה

1. מעבירים את ביצי שליו המופריות מראש מהאינקובטור לספסל נקי ומניחים אותן שטוחות על המיכל כדי לייצב אותן במשך כ 1-2 דקות.
2. השתמש במספריים (12.5 ס"מ מספריים ישרים כירורגיים) כדי לתקוע חור קטן (קוטר 3 מ"מ) בציר המרכזי של ביצי שליו מופרות מראש ולחתוך 1-2 ס"מ פתח קטן. מעבירים בזהירות את הביצית הלבנה והחלמון של ביצי שליו מופרות לקליפת הביצית החתכה.
   הערה: בעת חיתוך פתח קטן עם מספריים, להימנע מגע של חלמון של ביצי שליו.
3. הוסף את פתרון הבקרה (ללא חברי פרלמנט) ואת הפתרון החשוף של מסות שונות (0.1, 0.2 ו-0.3 מ"ג) של מיקרופלסטיק עם שלושה גדלי חלקיקים (100, 200 ו- 500 ננומטר) לתכולת הביצה באמצעות פיפטה. יחד עם זאת, להוסיף 1 טיפה של פניצילין 1 טיפה של סטרפטומיצין עם מזרק 1 מ"ל.
4. מכסים את פתיחת קליפת הביצה בסרט המעוקר (שלב 1.6).
5. על פי שלב 2.1-2.4, לטפל בכל ביצי שליו מופרות.
6. מניחים את עוברי השליו המועברים לתוך אינקובטור 38 °C עם 60% לחות לתקופה הדרושה. בניסוי זה, השתמש בזווית סיבוב ביצה של ±30°. להפוך את הביצים פעם בשעה.
   הערה: ההעברה צריכה להיות מהירה ככל האפשר, מה שדורש יותר תרגול בשלב המוקדם.

3. איסוף דוגמאות

1. לאחר שבעה ימים של תרבות, להסיר עוברים מפותחים שנצפו בעין בלתי מן החלמון לשטוף עם פתרון חוצץ פוספט (PBS).
2. יבשו את התמיסה העודפת מחוץ לעובר המנוקה בנייר סופג ושקלו צלחת פטרי נקייה.
3. פתחו את כל חלל החזה, הפרידו את הכבד והלב מהפנים עם צבת מחט-האף, והכניסו לצינורות צנטריפוגות בגודל 1.5 מ"ל מיד לאחר הניקוי.
4. תעד במהירות את המשקל על איזון אלקטרוני וחשב את האינדקס הפטוסומטי (HIS = משקל כבד / משקל גוף x 100). למדוד את אורך החזה והגוף.
5. בהתבסס על האינדיקטורים לעיל, להעריך את ההשפעה של חברי פרלמנט על התפתחות עוברית.
   הערה: איכות העובר כאן מתייחסת לאיכות הסרת החלמון.

4. ניתוח נתונים

1. דווח על הנתונים הניסיוניים בצורה של שגיאת תקן ± ממוצעת (SEM).
2. השתמש בניתוח חד-גורם של שונות כדי להשוות את האמצעים של קבוצות מרובות של דגימות. ערך ההפרש המשמעותי היה α = 0.05.

תוצאות

לניתוח נתונים ניסיוניים השווינו משקל רטוב, אורך גוף, אורך רכי החזה ושינוי מדד הפטוסומטי בין קבוצת הביקורת לבין 6 קבוצות הניסוי, תוך מדידה והשתקפות של הצמיחה וההתפתחות של עוברים שליו מנקודת מבט מאקרו. זיהינו שישה עוברים שליו רגילים בכל קבוצה. כל עובר הגיע לשלב ההמבורגר והמילטון (HH) הנדרשים.

Discussion

מאמר זה מספק תוכנית ניסיונית יעילה להערכת התפתחות העובר שליו על ידי זיהוי מדדי הפיתוח הבסיסיים. עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות לניסוי זה.

ראשית, התמותה של עוברים שליו בשלב מאוחר יותר של הבקיעה גבוהה יותר בגלל הבקיעה ללא קליפה. ישנם גורמים בלתי נשלטים באופן מלאכותי כגון הרס של י?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi sample tissue grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	Tissuelyser-24	Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature
Electronic balance	OHAUS corporation	PR Series Precision	Used for weighing
Fertilized quail eggs	Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd.		Quail eggs for hatching without shell
Fluorescent polypropylene particles	Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd.		Types of plastics selected for the experiment
Incubator	Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd.	264 pc	Provide a place for embryo growth and development
Nanometer-scale polystyrene microspheres	Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd.	100 nm, 200 nm, 500 nm	Types of plastics selected for the experiment
Steel ruler	Deli Group	20 cm	Used to measure  length
Vertical heating pressure steam sterilizer	Shanghai Shenan Medical Instrument Factory	LDZM-80KCS-II	Sterilize the experimental articles