JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, mikroplastikler gibi parçacık kirleticilerin toksikolojik çalışmaları için yumurta kabuğu kullanmadan bir kuluçka yöntemi sunun.

Özet

Mikroplastikler, hayvan doku ve organlarındaki alım ve translokasyon nedeniyle hayvanlar için büyük bir sağlık tehdidi oluşturan gelişmekte olan küresel bir kirletici türüdir. Mikroplastiklerin kuş embriyolarının gelişimi üzerindeki ekotoksikolojik etkileri bilinmemektedir. Kuş yumurtası tam bir gelişim ve beslenme sistemidir ve tüm embriyo gelişimi yumurta kabuğunda gerçekleşir. Bu nedenle, mikroplastikler gibi kirleticilerin stresi altında kuş embriyosu gelişiminin doğrudan bir kaydı, geleneksel kuluçkadaki opak yumurta kabuğu ile oldukça sınırlıdır. Bu çalışmada mikroplastiklerin bıldırcın embriyo gelişimi üzerindeki etkileri yumurta kabuğu olmadan yumurtadan çıkarak görsel olarak izlendi. Ana adımlar döllenmiş yumurtaların temizlenmesi ve dezenfeksiyonu, maruz kalmadan önce inkübasyon, maruziyet sonrası kısa süreli inkübasyon ve numune ekstraksiyonu içerir. Sonuçlar, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, mikroplastiklere maruz kalan grubun ıslak ağırlığı ve vücut uzunluğunun istatistiksel bir fark gösterdiğini ve maruz kalan tüm grubun karaciğer oranının önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Ek olarak, inkübasyonu etkileyen dış faktörleri değerlendirdik: sıcaklık, nem, yumurta dönüş açısı ve diğer koşullar. Bu deneysel yöntem, mikroplastiklerin ekotoksikolojisi hakkında değerli bilgiler ve kirleticilerin embriyoların gelişimi üzerindeki olumsuz etkilerini incelemenin yeni bir yolunu sağlar.

Giriş

Plastik atık üretimi 2015 yılında yaklaşık 6300 Mt idi, bunların onda biri geri dönüştürüldü ve geri kalanı yakıldı veya yeraltına gömüldü. 2050 1'e kadar yaklaşık 12.000 Mt plastikatığın yeraltına gömüleceği tahmin edilmektedir. Uluslararası toplumun plastik atıklara dikkat etmesiyle Thompson, mikroplastik kavramını ilk olarak 2004 yılında öneren2. Mikroplastikler (milletvekilleri), parçacık çapı 5 mm'den az olan küçük parçacık plastiklerini ifade eder. Şu anda, araştırmacılar çeşitli kıtaların kıyı şeridinde, Atlantik Adaları'nda, iç göllerde, Kuzey Kutbu'nda ve derin deniz habitatlarında 3 ,4,5,6,7'demilletvekillerinin her yerde bulunduğunu tespit etmişlerdir. Bu nedenle, daha fazla araştırmacı milletvekillerinin çevresel tehlikelerini incelemeye başladı.

Organizmalar çevredeki milletvekillerini yutabilir. Milletvekilleri dünya çapında 233 deniz organizmasının sindirim sisteminde bulundu (%100 kaplumbağa türleri, %36 fok türleri, %59 balina türleri, %59 deniz kuşu türleri, 92 çeşit deniz balığı ve 6 çeşit omurgasız dahil)8. Dahası, milletvekilleri organizmaların sindirim sistemini engelleyebilir, birikebilir ve bobies9 'larındagöç edebilir. Milletvekillerinin besin zinciri üzerinden transfer edilebildiği ve alımlarının habitat, büyüme aşaması, beslenme alışkanlıkları ve besin kaynaklarının değişmesiyle farklılık gösterir10. Bazı araştırmacılar, deniz kuşlarının dışkısında milletvekillerinin varlığını bildirdi11Deniz kuşlarının milletvekillerinin taşıyıcısı olarak hareket ettiği anlamına gelir. Buna ek olarak, milletvekillerinin yutulması bazı organizmaların sağlığını etkileyebilir. Örneğin, milletvekilleri gastrointestinal sisteme dolanabilir, böylece cetaceanların mortalitesini arttırabilir12.

Milletvekilleri tek başına organizmalar üzerinde toksik etkilerin yanı sıra diğer kirleticilere sahip organizmalar üzerinde de eklem toksik etkilerine sahiptir. Çevre ile ilgili plastik döküntü konsantrasyonlarının yutulması yetişkin balıkların endokrin sistem işlevini bozabilir13. Mikroplastiklerin büyüklüğü organizmalar tarafından alım ve birikimlerini etkileyen önemli faktörlerden biridir14,15. Küçük boyutlu plastikler, özellikle nanosize plastikler, yüksek toksisiteye sahip hücreler ve organizmalarla etkileşime eğilimlidir16,17,18,19. Nano parçacık boyutundaki mikroplastiklerin organizmalar üzerindeki zararlı etkileri mevcut araştırma seviyesini aşsa da, mikroplastiklerin, özellikle ortamdaki mikrokomron/nano plastikler olmak üzere birkaç mikrometreden daha küçük boyutlarda tespit edilmesi ve nicelleştirilmesi hala büyük bir zorluktur. Ek olarak, nano plastiklerin embriyolar üzerinde de bazı etkileri vardır. Polistiren protein ve gen profillerini düzenleyerek deniz kestanesi embriyolarının gelişimine zarar verebilir20.

Milletvekillerinin organizmalar üzerindeki potansiyel etkilerini araştırmak için bu çalışmayı yürüttük. Kuş embriyoları ve insan embriyoları arasındaki benzerlik nedeniyle, genellikle anjiogenez ve anangiogenez, doku mühendisliği, biyomalzeme implantı ve beyin tümörleri dahil olmak üzere gelişimsel biyoloji araştırma21'dekullanılırlar 22,23,24. Kuş embriyoları düşük maliyetli, kısa kültür döngüsü ve kolay kullanım avantajlarına sahiptir25,26. Bu nedenle bu çalışmada deney hayvanı olarak kısa büyüme döngüsüne sahip bıldırcın embriyolarını seçtik. Aynı zamanda, embriyonik gelişim aşamasında milletvekillerine maruz kalan bıldırcın embriyolarının morfolojik değişimlerini yumurta kabuğu içermeyen bir kuluçka teknolojisi kullanarak doğrudan gözlemleyebiliyoruz. Kullanılan deneysel malzemeler polipropilen (PP) ve polistiren (PS) olarak kullanılmıştır. PP ve PS27 dünya çapında çökeltilerde ve su kütlelerinde elde edilen polimer türlerinin en büyük oranını oluşturduğundan, yakalanan deniz organizmalarından çıkarılan en yaygın polimer türleri etilen ve propilen28'dir. Bu deneysel protokol, milletvekillerinin milletvekillerine maruz kalan bıldırcın embriyoları üzerindeki toksikolojik etkilerinin görsel olarak değerlendirilmesi için tüm süreci açıklar. Diğer kirleticilerin toksisitesini diğer yumurtaparöz hayvanların embriyo gelişimine incelemek için bu yöntemi kolayca genişletebiliriz.

Protokol

1. Pozlamadan önce hazırlık

  1. Maruz kalma testi için aynı gün doğan döllenmiş bıldırcın yumurtalarını seçin.
  2. Benzer ağırlıklara sahip bıldırcın yumurtalarını seçin. Her döllenmiş bıldırcın yumurtası yaklaşık 10-12 g'dır.
  3. Tüm döllenmiş bıldırcın yumurtalarını dış dışkı ve diğer döküntülerden tamamen temizleyin.
  4. Önceden taranmış her bıldırcın yumurtasını ve kullanılacak yumurtaları (Benzer kabuk şeklinde yumurtaları, özellikle yumurtanın ucunu seçin) bir antibiyotik çözeltisi (penisilin ve streptomisin, 1:1000, oda sıcaklığı) ile sterilize edin. kuluçka makinesini% 75 etanol ile sterilize edin.
  5. Yumurtaları bir diş matkabının künt ucuyla açın, yumurta kabuğunu daha fazla kullanım için uçta bırakın. Döllenmiş yumurtaları aktarmadan önce, yumurtaların içeriği dökülür. Bu, yumurta kabuğunun nemini korumaktır. Yumurtanın açılış çapı yaklaşık 3 cm idi.
    NOT: Bıldırcın embriyosuna verilen zararı azaltmak için, yumurtanın kör ucunun açılması ve çatlağın mümkün olduğunca pürüzsüz olması için bir diş matkabı kullanın.
  6. Sterilizasyondan sonra, döllenmiş bıldırcın yumurtalarını 24-48 saat boyunca% 60 neme sahip 38 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Bıldırcın yumurtasının künt ucunun yukarı doğru yüzlerinden emin olun.
  7. Döllenmiş bıldırcın yumurtalarının inkübasyonu sırasında, sonraki deneylerde ihtiyaç duyulan aletleri sterilizasyon kabında sterilize edin. Bu aletler arasında plastik sargı, bir beher, steril su, pipet uçları, cerrahi düz makas, cımbız ve kaşık bulunur.
    NOT: Yüksek sıcaklık sterilizasyonu ile ilgili sorunları önlemek için yeterince yüksek sıcaklık toleranslı bir film kullanın.

2. Bıldırcın yumurtasını kabuksuz yumurtadan çıkarmak

  1. Önceden yumurtadan çıkmış döllenmiş bıldırcın yumurtalarını inkübatörden temiz bir tezgaha aktarın ve yaklaşık 1-2 dakika stabilize etmek için kabın üzerine düz bir şekilde koyun.
  2. Önceden taranmış döllenmiş bıldırcın yumurtalarının orta ekseninde küçük bir delik (çap 3 mm) dürtmek ve 1-2 cm küçük açıklığı kesmek için makas (12,5 cm cerrahi düz makas) kullanın. Döllenmiş bıldırcın yumurtalarının yumurta akı ve sarısını kesilmiş yumurta kabuğuna dikkatlice aktarın.
    NOT: Makasla küçük bir açıklık keserken bıldırcın yumurtasının sarısına dokunmaktan kaçının.
  3. Üç parçacık boyutuna (100, 200 ve 500 nm) sahip farklı kütlelerin (0,1, 0,2 ve 0,3 mg) açıkta kalan çözeltisini (milletvekilleri olmadan) pipetle yumurta içeriğine ekleyin. Aynı zamanda, 1 mL şırınna ile 1 damla penisilin ve 1 damla streptomisilin ekleyin.
  4. Yumurta kabuğunun açıklığı sterilize edilmiş filmle örtün (adım 1.6).
  5. Adım 2.1-2.4'e göre, tüm döllenmiş bıldırcın yumurtalarını tedavi edin.
  6. Transfer edilen bıldırcın embriyolarını gerekli süre boyunca% 60 nem ile 38 ° C inkübatöre yerleştirin. Bu deneyde, ±30 ° 'lik bir yumurta dönüş açısı kullanın. Yumurtaları saatte bir kez çevirin.
    NOT: Transfer mümkün olduğunca hızlı olmalıdır, bu da erken aşamada daha fazla pratik gerektirir.

3. Örnek toplama

  1. Yedi günlük kültürden sonra, çıplak gözle gözlemlenen iyi gelişmiş embriyoları yumurta sarısından çıkarın ve fosfat tamponlu çözelti (PBS) ile yıkayın.
  2. Temizlenmiş embriyonun dışındaki fazla çözeltiyi emici kağıtla kurulayın ve temiz bir Petri kabında tartın.
  3. Tüm göğüs boşluğunu açın, karaciğeri ve kalbi iğne burun pensesi ile visseradan ayırın ve temizlendikten hemen sonra 1,5 mL santrifüj tüplerine yerleştirin.
  4. Ağırlığı elektronik bir dengeye hızla kaydedin ve hepatosomatik indeksi hesaplayın (HIS = karaciğer ağırlığı / vücut ağırlığı x 100). Sternumun ve vücudun uzunluğunu ölçün.
  5. Yukarıdaki göstergelere dayanarak, milletvekillerinin embriyonik gelişim üzerindeki etkisini değerlendirin.
    NOT: Buradaki embriyo kalitesi yumurta sarısı çıkarma kalitesini ifade eder.

4. Veri analizi

  1. Deneysel verileri ortalama ± standart hata (SEM) şeklinde bildirin.
  2. Birden fazla örnek grubunun araçlarını karşılaştırmak için varyans tek faktörlü analizini kullanın. Önemli fark değeri α = 0,05 idi.

Sonuçlar

Deneysel verilerin analizi için, ıslak ağırlık, vücut uzunluğu, sternum uzunluğu ve kontrol grubu ile 6 deney grubu arasındaki hepatosomatik indeksin değişimini karşılaştırarak bıldırcın embriyolarının büyüme ve gelişimini makro perspektiften ölçtük ve yansıttık. Her grupta altı normal bıldırcın embriyosu tespit ettik. Her embriyo gerekli Hamburger ve Hamilton (HH) aşamasına ulaştı.

Şekil 1'de,önceden taranmış döllenmiş b?...

Tartışmalar

Bu makale, temel gelişim indekslerini tespit ederek bıldırcın embriyo gelişimini değerlendirmek için etkili bir deneysel şema sunmaktadır. Ancak, bu denemede hala bazı sınırlamalar vardır.

İlk olarak, bıldırcın embriyolarının kuluçkanın sonraki aşamasında mortalitesi kabuksuz kuluçka nedeniyle daha yüksektir. Deneysel süreçte normal protein oranının yok edilmesi gibi yapay olarak kontrol edilemeyen faktörler vardır. Deneyin doğruluğunu sağlamak için embriyol...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok. Tüm yazarlar, bu makalenin çalışmalarını etkileyebilecek bilinen rakip finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Bu çalışma Sincan Uygur Özerk Bölgesi'ndeki Önemli Araştırma ve Geliştirme projeleri (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
 Multi sample tissue grinderShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.Tissuelyser-24Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature
Electronic balanceOHAUS corporationPR Series PrecisionUsed for weighing
Fertilized quail eggsGuangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd.Quail eggs for hatching without shell
Fluorescent polypropylene particlesFoshan Juliang Optical Material Co., Ltd.Types of plastics selected for the experiment
IncubatorShandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd.264 pcProvide a place for embryo growth and development
Nanometer-scale polystyrene microspheresXi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd.100 nm, 200 nm, 500 nmTypes of plastics selected for the experiment
Steel rulerDeli Group20 cmUsed to measure  length
Vertical heating pressure steam sterilizerShanghai Shenan Medical Instrument FactoryLDZM-80KCS-IISterilize the experimental articles

Referanslar

  1. Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5 (2017).
  2. Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
  3. Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
  4. Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
  5. Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
  6. Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
  7. Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R. Microplastic pollution in deep-sea sediments. Environmental Pollution. 182, 495-499 (2013).
  8. Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
  9. Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
  10. Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
  11. Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
  12. Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
  13. Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
  14. Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7 (2017).
  15. Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
  16. Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
  17. Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13 (2012).
  18. Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
  19. Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
  20. Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
  21. El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
  22. Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
  23. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  24. Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
  25. Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
  26. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  27. Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
  28. Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre BilimleriSay 174MikroplastiklerB ld rc n embriyosuEmbriyonal toksisiteYumurta kabu u olmadan kulu kalamaPar ac k boyutuK sa s reli maruz kalma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır