JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نقدم بروتوكولا لتصور الارتباط المكاني للببتيد الكالسيتونين ذات الصلة بالجينات (CGRP) - الألياف العصبية المناعية والأوعية الدموية في طرية الجمجمة باستخدام الفلورسينس المناعي والكيمياء الهستوكسية الفلورية مع CGRP و phalloidin ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، كان أصل هذه الألياف العصبية رجعيا مع تتبع عصبي فلوري.

Abstract

كان الهدف من هذه الدراسة هو دراسة توزيع وأصل الببتيد المرتبط بالكالسيتونين المرتبط بالجينات (CGRP) - الألياف العصبية الحسية المناعية من طرية الجمجمة باستخدام الفلورة المناعية وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D) وتقنية التتبع الرجعي. هنا، كانت الألياف العصبية والأوعية الدموية ملطخة باستخدام تقنيات الفلورسينس المناعي والكيمياء النسيجية مع CGRP والفلورسنت phalloidin، على التوالي. وقد تجلى الارتباط المكاني للألياف العصبية والأوعية الدموية DURAL CGRP-immuoreactive من خلال إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. وفي الوقت نفسه، تم الكشف عن أصل الألياف العصبية النشطة المناعية CGRP عن طريق تقنية التتبع العصبي مع فلوروغولد (FG) من المنطقة المحيطة بالشريان السحائي الأوسط (MMA) في طرية الجمجمة إلى العقدة الثلاثية البروم (TG) وعنق الرحم (C) العقدة الجذرية الظهرية (DRGs). وبالإضافة إلى ذلك، تم أيضا فحص الخصائص الكيميائية للخلايا العصبية المسماة FG في TG وDRGs جنبا إلى جنب مع CGRP باستخدام الفلورفلورسينس المناعي المزدوج. الاستفادة من عينة شفافة كاملة جبل وإعادة الإعمار 3D، تبين أن الألياف العصبية CGRP-المناعية والشرايين phalloidin المسمى تشغيل معا أو تشكيل شبكة الأوعية الدموية العصبية دورال بشكل منفصل في عرض 3D، في حين تم العثور على الخلايا العصبية FG المسمى في فروع العيون، الفك العلوي، والمانديبولار من TG، فضلا عن C2-3 DRGs ipsilateral إلى جانب تطبيق التتبع الذي بعض الخلايا العصبية FG المسمى قدم مع التعبير CGRP-المناعي. مع هذه النهج، أظهرنا الخصائص التوزيعية للألياف العصبية النشطة المناعية CGRP حول الأوعية الدموية في طرية الجمجمة، فضلا عن أصل هذه الألياف العصبية من TG وDRGs. من منظور المنهجية ، قد يوفر مرجعا قيما لفهم البنية العصبية الوعائية المعقدة لمدرس الغور القحفي تحت الحالة الفسيولوجية أو المرضية.

Introduction

إن الطرية القحفية هي الطبقة الخارجية من السحايا لحماية الدماغ وتحتوي على أوعية دموية وفيرة وأنواع مختلفة من الألياف العصبية1،2. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن حساسة دورا القحفية ماتر قد يكون العامل الرئيسي الذي يؤدي إلى حدوث الصداع, تنطوي على توسع الأوعية غير طبيعية و الداخلي3,4,5. وهكذا، فإن معرفة بنية الأوعية الدموية العصبية في الطرية القحفية أمر مهم لفهم مسببات الأمراض من الصداع، وخاصة بالنسبة للصداع النصفي.

على الرغم من أن ال الداخلي دورا قد درس سابقا مع الكيمياء المناعية التقليدية، والارتباط المكاني للألياف العصبية والأوعية الدموية في الطرية القحفية كانت أقل درس6،7،8،9. من أجل الكشف عن بنية الأوعية الدموية العصبية دورال بمزيد من التفصيل، تم اختيار الببتيد الكالسيتونين الجينات ذات الصلة (CGRP) وphalloidin كعلامات لتلطيخ على التوالي الألياف العصبية الجافية والأوعية الدموية في كامل جبل دورا القحفية ماتر مع immunofluorescence والكيمياء النسيجية الفلورية10. قد يكون الخيار الأمثل للحصول على عرض ثلاثي الأبعاد (3D) للبنية العصبية الوعائية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق الفلوروغولد (FG) على المنطقة المحيطة بالشريان السحائي الأوسط (MMA) في طرية الجمجمة لتحديد أصل الألياف العصبية المناعية CGRP ، وتتبعت إلى العقدة الثلاثية البروم (TG) وعنق الرحم (C) العقدة الجذرية الظهرية (DRGs) ، في حين تم فحص الخلايا العصبية المسماة FG مع CGRP باستخدام immunofluorescence.

كان الهدف من هذه الدراسة هو توفير أداة فعالة للتحقيق في بنية الأوعية الدموية العصبية في طرية الجمجمة ل الداخلي CGRP-المناعي ومصدره. من خلال الاستفادة من شفافة كاملة جبل دورا ماتر والجمع بين immunofluorescence، تتبع الرجعية، وتقنيات confocal، وإعادة الإعمار 3D، كنا نتوقع لتقديم وجهة نظر 3D رواية من بنية الأوعية الدموية العصبية في ماتر دورا الجمجمة. ويمكن مواصلة تقديم هذه النهج المنهجية لاستكشاف مسببات الأمراض من الصداع المختلفة.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في معهد الوخز بالإبر و Moxibustion ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (الرقم المرجعي D2018-09-29-1). وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبرات (مطبعة الأكاديمية الوطنية، واشنطن، D.C، 1996). تم استخدام اثني عشر الفئران الذكور سبراغ داولي الكبار (الوزن 220 ± 20 غرام) في هذه الدراسة. تم توفير الحيوانات [رقم الترخيص SCXK (JING) 2017-0005] من قبل المعاهد الوطنية لمراقبة الأغذية والأدوية.

1. داخليا من الفئران الجمجمة دورا ماتر

  1. الانحرافات
    1. حقن Intraperitoneally جرعة زائدة من محلول تريبروموثانول (250 ملغم / كغ) إلى الفئران للحث على القتل الرحيم.
    2. بمجرد توقف التنفس ، perfuse عبر القلب مع 100 مل من 0.9 ٪ المالحة العادية تليها 250-300 مل من 4 ٪ paraformaldehyde في 0.1 متر الفوسفات العازلة (PB ، درجة الحموضة 7.4).
    3. بعد التشوه، قم بإزالة جلد الرأس وفتح الجمجمة لفضح دورة ماتر والجانب الظهري من الدماغ. ثم تشريح خارج الأم دورا الجمجمة على طول جذع الدماغ إلى لمبة الشم في نمط جبل كامل (الشكل 1). إجراء مرحلة ما بعد التثبيت في 4٪ paraformaldehyde لمدة 2 ساعة، ومن ثم cryoprotect في السكروز 25٪ في 0.1 M PB لأكثر من 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
  2. الكيمياء المناعية الفلورية ل CGRP ووضع العلامات phalloidin
    ملاحظة: تم تطبيق مزيج من تلطيخ الفلورسنت من CGRP وphalloidin للكشف عن الارتباط المكاني للألياف العصبية الجافية والأوعية الدموية في طرية الجرذ في نمط جبل كامل.
    1. شطف الطرية القحفية في 0.1 M PB لمدة 1 دقيقة تقريبا.
    2. احتضان ماتر دورا في حل حجب تحتوي على 3٪ مصل الحمير العادي و 0.5٪ تريتون X-100 في 0.1 M PB لمدة 30 دقيقة.
    3. نقل ماتر دورا إلى الأجسام المضادة للفأرة CGRP (1:1000) في 0.1 M PB تحتوي على 1٪ مصل حمار العادي و 0.5٪ تريتون X-100 بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية11.
    4. غسل ماتر دورا ثلاث مرات في 0.1 M PB في اليوم التالي.
    5. احتضان ماتر دورا في حل مختلط من الحمار المضادة للفأرة اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية (1:500) وphalloidin 568 (1:1000) في 0.1 M PB تحتوي على 1٪ مصل الحمير العادي و 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة (26 درجة مئوية).
    6. غسل ماتر دورا ثلاث مرات في 0.1 M PB.
    7. تقليم حواف وجبل على الشرائح المجهر (انظر جدول المواد).
    8. وضع على coverlips مع 50٪ الجلسرين قبل الملاحظة.
  3. المراقبة والتسجيل
    1. مراقبة عينات الفلورسنت تحت المجهر الفلوري أو نظام التصوير confocal.
    2. التقاط صور لجبل كامل دورا ماتر بواسطة المجهر الفلورسنت مجهزة كاميرا رقمية (4x، NA: 0.13)، واستخدام وقت التعرض من 500 مللي ثانية. تم الانتهاء من الفسيفساء صورة من ماتر دورا مع برنامج المجهر الفلورسنت (انظر جدول المواد).
    3. التقاط صور للألياف العصبية CGRP المناعية والأوعية الدموية التي تحمل علامة phalloidin في ماتر دورا باستخدام المجهر confocal. وكانت أطوال الموجة والانبعاثات 488 نانومتر (أخضر) و594 نانومتر (أحمر). الثقب الكونفوجال هو 110 (20x) و 105 ميكرومتر (40x). دقة التقاط الصور هي 640 × 640 بكسل.
    4. التقاط 20 صورة في إطارين 2 ميكرومتر من كل مقطع سمكه 40 ميكرومتر وتنفيذ تكامل صورة واحدة في التركيز مع نظام البرامج المرتبطة بمعالجة الصور confocal للتحليل ثلاثي الأبعاد على النحو التالي: تعيين بدء الاتصال الطائرة | تعيين | المستوى البؤري ل End تعيين حجم الخطوة | اختيار | نمط العمق | التقاط الصور سلسلة Z.
    5. استخدم برنامج تحرير الصور لضبط سطوع الصور وتباينها لتحسين التصور. انتبه إلى عدم إزالة أي بيانات من الصور.

2. دراسة تتبع الرجعية مع FG

  1. العمليات الجراحية
    1. تحديد منطقة التنسيق من الاهتمام في الفئران الجمجمة دورا ماتر.
    2. إعداد حقنة صغيرة 10 ميكرولتر واختباره مع البارافين السائل.
    3. تخدير الفئران مع حل تريبروموميثانول (150 ملغ / كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تحقق من العمق في التخدير بسبب عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
    4. حلق رأس الجرذ بشفرة حلاقة كهربائية.
    5. وضع قضبان الأذن حادة إلى الفئران ووضعه على الجهاز ستيريوتاكسيك. ثم وضع حامل الفم وتطبيق مرهم العيون على العينين.
    6. تنظيف الموقع الجراحي لجلد الرأس باستخدام 10٪ من اليود بوفيدوني يليه الإيثانول 75٪.
    7. إجراء شق على طول خط الوسط من فروة الرأس.
    8. إزالة بلانتا periosteum والأنسجة العضلية بعيدا عن الجمجمة باستخدام العقيمة القطن يميل التطبيقات (الشكل 1A).
    9. حفر حفرة صغيرة (~ 5-7 ملم) باستخدام حفر بور مع بت جولة تلميح (#106) على العظام الجدارية والزمانية اليسرى فوق مجلس العمل المتحد12، وتأكد من أن تم الاحتفاظ ماتر دورا الجمجمة سليمة(الشكل 1B).
    10. بناء بنك حول الحفرة مع أسمنت سيليكات الأسنان للحد من انتشار التتبع (الشكل 1C).
    11. إضافة 2 ميكرولتر من 2٪ FG في حفرة حول مجلس العمل المتحد مع 10 ميكرولتر حقنة صغيرة(الشكل 1D).
    12. غطي الثقب بقطعة صغيرة من إسفنجة الهيموستاتيكي.
    13. وضع قطعة من فيلم البارافين على الحفرة وختم حواف مع الشمع العظام لمنع تسرب التتبع وتجنب التلوث إلى الأنسجة المحيطة بها.
    14. خياطة الجرح مع الخيط العقيم.
    15. إبقاء الفئران في منطقة دافئة حتى أنها قد تعافى تماما.
    16. أعد الجرذان إلى أقفاصها وأضف مضادا حيويا ومسكنا إلى مياه الشرب.
  2. الانحرافات والأقسام
    1. بعد 7 أيام البقاء على قيد الحياة، perfuse هذه الفئران كما ذكر أعلاه في الإجراءات في القسم 1.1.
    2. تشريح خارج TG وC1-4 DRGs، ثم بعد الإصلاح و cryoprotect لهم كما ذكر أعلاه في القسم 1.1.3(الشكل 1F).
    3. قطع TG وDRGs في سمك 30 ميكرومتر على نظام microtome cryostat في اتجاه القوس وشنت على الشرائح الزجاجية المغلفة بالسيلان.
  3. الفلورة المناعية المزدوجة لتسمية FG وCGRP في TG وDRGs
    ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن ملاحظة وضع العلامات على FG مباشرة مع إضاءة الأشعة فوق البنفسجية تحت مصباح الزئبق دون تلطيخ إضافي13و14و15و16، فقد تم فحص الخلايا العصبية المسماة مع FG بشكل أكبر في TG وDRGs عنق الرحم باستخدام فلورة مناعية مزدوجة مع FG و CGRP للكشف عن أصول الألياف العصبية المناعية CGRP الجافة في TG وDRGs.
    1. دائرة المقاطع مع القلم الهسوتشيميكال.
    2. احتضان أقسام لمدة 30 دقيقة في حل حجب تحتوي على 3٪ مصل الحمير العادي و 0.5٪ تريتون X-100 في 0.1 M PB.
    3. نقل العينات إلى حل أرنب المضادة للفلوروغولد (1:1000) والفأر المضادة CGRP الأجسام المضادة (1:1000) في 0.1 M PB تحتوي على 1٪ مصل الحمير العادي و 0.5٪ تريتون X-100 بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    4. غسل المقاطع ثلاث مرات في 0.1 M PB في اليوم التالي.
    5. احتضان في حل مختلط من الحمار المضادة للأرنب اليكسا فلور 594 (1:500) والحمار المضادة للفأرة اليكسا فلور 488 (1:500) الأجسام المضادة الثانوية في 0.1 M PB تحتوي على 1٪ مصل الحمير العادي و 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. غسل وتطبيق الأغطية على الأقسام كما الإجراءات في الخطوتين 1.2.6 و 1.2.8.
  4. المراقبة والتسجيل
    1. التقاط صور للخلايا العصبية FG المسمى في TG وDRGs تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية بواسطة المجهر الفلوري مجهزة بكاميرا رقمية.
    2. التقاط صور للخلايا العصبية FG- وCGRP المسمى في TG وDRGs تحت المجهر الفلوري مجهزة بكاميرا رقمية.
    3. استخدم برنامج التحرير لضبط سطوع الصور وتباينها وإضافة تسميات في الصور.

النتائج

بنية الأوعية الدموية العصبية من الأم دورا الجمجمة
بعد immunofluorescent والفلورسنت تلطيخ الهستوفيميائي مع CGRP وphalloidin، CGRP-المناعية الألياف العصبية والشرايين الجافية phalloidin المسمى والأنسجة الضامة أظهرت بوضوح في جميع أنحاء كامل جبل الجمجمة دورا ماتر في نمط 3D (

Discussion

في هذه الدراسة، أثبتنا بنجاح توزيع وأصل الألياف العصبية النشطة المناعية CGRP في طرية الجمجمة باستخدام الفلورة المناعية، وإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد ونهج التتبع العصبي مع الأجسام المضادة CGRP والمتتبع العصبي FG، وتوفير الأدلة النسيجية والكيميائية لفهم أفضل لشبكة الأوعية الدموية العصبية ال...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذه الدراسة من خلال مشروع البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رمز المشروع رقم 2019YFC1709103؛ رقم 2018YFC1707804) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رمز المشروع رقم 81774211؛ رقم 81774432؛ رقم 81801561).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)Invitrogen by Thermo Fisher ScientificA21202Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrumentNarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympusVersion 1.1Software of fluorescent microscope
Confocal imaging systemOlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Protect from light
Fluorescent imaging systemOlympusBX53
Freezing microtomeThermoMicrom International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympusVersion 4.2Confocal image processing software system
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Mouse anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin 568Molecular ProbesA12380Protect from light
Photoshop and  IllustrationAdobeCS6Photo editing software
Rabbit anti- FluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738
Sprague DawleyNational Institutes for Food and Drug ControlSCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slidesThermo#4951PLUS-00125x75x1mm

References

  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved