면역 형광 및 신경 추적을 가진 쥐 두개골 듀라 마터의 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 면역 반응성 내적 내부 발산 시각화

요약

여기서 우리는 CGRP 및 phalloidin을 이용한 면역형광 및 형광 히스토화학을 사용하여 두개골 듀라 메이트에서 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)-면역반응성 신경 섬유 및 혈관의 공간 상관관계를 시각화하는 프로토콜을 각각 제시한다. 또한, 이러한 신경 섬유의 기원은 형광 신경 추적자로 역행하였다.

초록

이 연구의 목적은 면역형광, 3차원(3D) 재구성 및 역행 추적 기술을 사용하여 두개골 dura mater의 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)-면역 반응성 감각 신경 섬유의 분포 와 기원을 검사하는 것이었습니다. 여기서, 신경 섬유와 혈관은 CGRP와 형광 프할로이드를 이용한 면역형광 및 히스토케미크 기술을 각각 사용하여 염색하였다. dural CGRP-immuoreactive 신경 섬유및 혈관의 공간 상관 관계는 3D 재건에 의해 입증되었다. 한편, CGRP-면역반응성 신경 섬유의 기원은 두개골 성두막 마터에서 중간 수막 동맥(MMA) 주위 영역에서 플루오로골드(FG)를 가진 신경 추적 기술에 의해 검출되어 삼차 신경절(TG) 및 자궁 경부(C) 등류(DGS)에 의해 검출되었다. 또한, TG 및 DRGs에서 FG 표지 뉴런의 화학적 특성도 이중 면역 형광을 사용하여 CGRP와 함께 검사하였다. 투명한 전산 시료 및 3D 재구성을 활용하여 CGRP-면역반응성 신경섬유및 팔로이드인 라벨이 부착된 아질리올이 함께 실행되거나 별도로 3D 뷰에서 두루알 신경혈관 네트워크를 형성하는 것으로 나타났다. FG 표지된 뉴런은 TG의 안과, 상악, 및 하악 성 나뭇가지뿐만 아니라 C2-3 DRGs ipsilateral에서 발견되었지만, 일부 FG 표지 뉴런중 일부가 CGRP-면역 반응성 발현으로 제시되는 추적기 적용 의 측면에 있다. 이러한 접근법으로, 우리는 두개골 듀라 메이터의 혈관 주위CGRP 면역 반응성 신경 섬유의 분포 특성뿐만 아니라 TG와 DRGs에서 이러한 신경 섬유의 기원을 입증했다. 방법론의 관점에서, 생리학적 또는 병리학적 조건 하에서 두개골 두라 메이트의 복잡한 신경 혈관 구조를 이해하는 데 귀중한 참조를 제공 할 수 있습니다.

서문

두개골 두라 메이트는 뇌를 보호하기 위해 수막의 가장 바깥쪽 층이며 풍부한 혈관과 다양한 종류의 신경^섬유1,2를함유하고 있다. 많은 연구는 민감 두개골 두라 mater 가 비정상적인 혈관 확장 및 내면3,^4,5를포함하는 두통의 발생으로 이어지는 핵심 요인이 될 수 있음을 보여 주었다. 따라서, 두개골 두라 메이트에서 신경 혈관 구조의 지식은 두통의 병발생을 이해하는 데 중요하다, 특히 편두통에 대한.

두라 내분은 이전에 종래의 면역히스토케로 연구되었지만, 두개골 두라 메이트의 신경 섬유와 혈관의 공간 상관관계는^6,7,8,9로덜 연구되었다. 둘레 신경혈관 구조를 보다 자세하게 밝히기 위해, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)와 프할로이드인은 면역형과 형광을 가진 전산 두개골 두라 메이트에서 각각 두루 신경 섬유와 혈관을 염색하기 위한 마커로선택되었다. 신경혈관 구조의 3차원(3D) 뷰를 얻기에 최적의 선택이 될 수 있다. 또한, 형광금(FG)은 CGRP-면역반응성 신경섬유의 기원을 결정하기 위해 두개골 듀라 메이트러의 중간 수막 동맥(MMA) 주변 부위에 적용되었고, 삼차 신경절(TG) 및 자궁경부(C)를 추적하여 FG-면역성 신경망을 함께 검사하였다.

이 연구의 목적은 CGRP 면역 반응성 이내및 그 기원을 위한 두개골 듀라 메이트의 신경혈관 구조를 조사하기 위한 효과적인 도구를 제공하는 것이었습니다. 투명한 전산 듀라 메이트를 활용하고 면역형광, 역행 추적, 공초점 기술 및 3D 재구성을 결합함으로써 두개골 듀라 메이트에서 신경혈관 구조에 대한 새로운 3D 뷰를 제시할 것으로 기대됩니다. 이러한 방법론적 접근법은 다른 두통의 병발생을 탐구하기 위해 더 많이 제공 될 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 중국 의학 아카데미(참조 번호 D2018-09-29-1)의 침술 및 목시부시 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 절차는 실험실 동물의 치료 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행되었다 (국립 아카데미 프레스, 워싱턴, D.C., 1996). 12 성인 Sprague-Dawley 수 컷 쥐 (무게 220 ± 20 g)이 연구에서 사용 되었다. 동물 [면허 번호 SCXK (JING) 2017-0005]는 식품 의약품 통제에 대한 국립 연구소에 의해 제공되었다.

1. 쥐 두개골 듀라 메이트의 내면

1. 관류
   1. 자궁 내역은 안락사를 유도하기 위해 쥐에 트리브로모에탄올 용액 (250 mg/kg)의 과다 복용을 주입합니다.
   2. 호흡이 멈추면, 0.9%의 정상 식염수의 100mL로 전염된 후 0.1M 인산염 버퍼(PB, pH 7.4)에서 파라포름알데히드의 4%의 250-300mL가 뒤를 이었다.
   3. 관류 후, 머리 피부를 제거하고 뇌의 두라 메이터와 등쪽을 노출하기 위해 두개골을 엽니 다. 그런 다음 뇌간을 따라 두개골 듀라 메이트를 전체 마운트 패턴의 후각 전구로 해부합니다(도1). 2 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 사후 고정을 수행 한 다음 4 °C에서 24 시간 이상 0.1 M PB에서 25 % 자당보호합니다.
2. CGRP 및 판로이드 라벨링을 위한 형광 면역히스토케
   참고: CGRP와 프할로이딘의 형광 염색의 조합이 적용되어 쥐 두개골 듀라 메이트의 두루신경 섬유및 혈관의 공간 상관관계를 전체 마운트 패턴으로 드러냈다.
   1. 두개골 듀라 마터를 0.1 M PB에서 약 1 분 동안 헹구는 다.
   2. 30분 동안 0.1M PB에서 일반 당나귀 혈청 3%, 트리톤 X-100 0.5%를 포함하는 블로킹 용액에서 듀라 메이트를 배양한다.
   3. 두라 메이트를 마우스 항 CGRP 항체(1:1000)로 전송하여 0.1 M PB로 0.1M PB를 함유하여 1% 정상 당나귀 혈청과 0.5% 트리톤 X-100을 4°C^11에서하룻밤 사이에 함유한다.
   4. 다음날 0.1 M PB로 듀라 마터를 세 번 씻는다.
   5. 당나귀 항마우스 알렉사 플루어 488 이차 항체(1:500) 및 팔로이드진 568(1:1000)의 혼합 용액에서 듀라 마터를 0.1M PB로 1% 정상 당나귀 혈청과 0.5% 트리톤 X-100을 실내 온도(26°C)에서 배양한다.
   6. 0.1 M PB로 듀라 메이트를 세 번 씻으시다.
   7. 가장자리를 다듬고 현미경 슬라이드에 장착합니다(재료 표참조).
   8. 관찰 하기 전에 50% 글리세린커버립에 넣어.
3. 관찰 및 녹음
   1. 형광 현미경 또는 공초점 이미징 시스템에서 형광 샘플을 관찰하십시오.
   2. 디지털 카메라(4배, NA: 0.13)가 장착된 형광 현미경으로 전체 마운트 듀라 메이트의 이미지를 찍고 500ms의 노출 시간을 사용합니다. 듀라 마터의 이미지 모자이크는 형광 현미경 의 소프트웨어로 완료되었다 (재료의 표참조).
   3. 공초점 현미경을 사용하여 듀라 마터에서 CGRP 면역 반응성 신경 섬유 및 phalloidin 표지 혈관의 이미지를 가져 가라. 여기와 방출 파장488nm(녹색) 및 594nm(빨간색)이었다. 공초점 핀홀은 110(20배) 및 105 μm(40배)이다. 이미지 캡처해상도는 640 x 640픽셀입니다.
   4. 각 40 μm 두께 섹션에서 2 μm 프레임에 20 개의 이미지를 캡처하고 다음과 같이 3D 분석을위한 공초점 이미지 처리 관련 소프트웨어 시스템과 단일 초점 이미지 통합을 수행합니다: 시작 초점 평면 | 최종 초점 평면 | 설정 단계 크기 | 설정 깊이 패턴 | 선택 이미지 캡처 | Z 시리즈.
   5. 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지의 밝기와 대비를 조정하여 시각화를 최적화합니다. 이미지에서 데이터를 제거하지 않도록 주의하십시오.

2. FG로 역행 추적 연구

1. 외과 적 절차
   1. 쥐 두개골 듀라 메이트에 관심의 좌표 영역을 결정합니다.
   2. 10 μL 마이크로 주사기를 준비하고 액체 파라핀으로 테스트합니다.
   3. 트리브로모에탄올 용액(150 mg/kg)으로 쥐를 관면 주사를 통해 마취합니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족으로 마취의 깊이를 확인하십시오.
   4. 쥐의 머리를 전기 면도기로 면도합니다.
   5. 무딘 이어 바를 쥐에 넣고 스테레오 탁스 장치에 놓습니다. 그런 다음 입 홀더를 넣고 눈에 안과 연고를 바하십시오.
   6. 10% 포비도요오드를 사용하여 머리 피부의 수술 부위를 청소하고 75% 에탄올이 뒤따릅니다.
   7. 두피의 중간선을 따라 절개를 합니다.
   8. 멸균 면 기울어진 어플리케이터(도1A)를사용하여 두개골에서 골반의 골막및 근육 조직을 무뚝뚝하게 제거합니다.
   9. MMA¹²위의 왼쪽 정수리 및 측두골에 둥근 팁 비트(#106)가 있는 버 드릴을 사용하여 작은 구멍(~5-7mm)을 드릴링하고 두개골 듀라 메이트가 그대로 유지되었는지 확인합니다(그림1B).
   10. 트레이서의 확산을 제한하기 위해 치과 규산염 시멘트로 구멍 주위에 은행을 구축(도 1C).
   11. 10 μL 마이크로 주사기(도 1D)로MMA 주변구멍에 2 μL을 추가합니다.
   12. 작은 헤모성 스폰지조각으로 구멍을 덮습니다.
   13. 구멍에 파라핀 필름 조각을 넣고 트레이서의 누출을 방지하고 주변 조직에 오염되지 않도록 뼈 왁스로 가장자리를 밀봉하십시오.
   14. 멸균 실로 상처를 봉합합니다.
   15. 쥐가 완전히 회복될 때까지 따뜻한 부위에 쥐를 보관하십시오.
   16. 쥐를 다시 새장에 돌려보내 서 식수에 항생제와 진통제를 추가합니다.
2. 관류 및 섹션
   1. 7 생존 일 후, 섹션 1.1의 절차에서 위에서 언급 한 바와 같이이러한 쥐를 perfuse.
   2. TG 및 C1-4 DRG를 해부한 다음 수정 후 1.1.3(그림 1F)에서위에서 언급한 대로 냉동 을 보호합니다.
   3. TG와 DRG를 시상 방향으로 극저스트 마이크로톤 시스템에서 30 μm 두께로 자르고 실레인 코팅 유리 슬라이드에 장착합니다.
3. TG 및 DRG에서 FG 및 CGRP 라벨링을 위한 이중 면역 형광
   참고: FG 라벨링은 추가 염색 없이 수은 램프 하에서 UV 조명으로 직접 관찰할 수^{있지만, 13,14,15,16,}FG를 가진 표지된 뉴런은 FG와 CGRP를 이용한 이중 면역형광을 사용하여 TG 및 자궁 경부 DRG에서 추가로 검사하여 관자 CGRP-면역 면역 신경 섬유의 기원을 밝히기 위해 더 많이 검사하였다.
   1. 히스토케미칼 펜으로 섹션을 동그라미로 합니다.
   2. 0.1 M PB에서 일반 당나귀 혈청 3%, 트리톤 X-100 0.5%를 포함하는 블로킹 솔루션에서 30분 동안 섹션을 배양합니다.
   3. 샘플을 토끼 항 플루오로골드(1:1000) 및 마우스 안티 CGRP 항체(1:1000)의 용액으로 전송하여 0.1 M PB로 1% 정상 당나귀 혈청과 0.5% 트리톤 X-100을 4°C에서 1%로 함유한다.
   4. 다음날 0.1 M PB로 섹션을 세 번 씻습니다.
   5. 당나귀 안티 래빗 알렉사 플루오 (5:500)와 당나귀 안티 마우스 알렉사 플루어 488 (1:500) 이차 항체의 혼합 용액에서 배양 하 여 0.1 M PB에 1% 일반 당나귀 혈청 및 0.5% 트리톤 X-100 실내 온도에서 1.5 h.
   6. 1.2.6 및 1.2.8 단계의 절차로 커버립을 세척하고 섹션에 적용하십시오.
4. 관찰 및 녹음
   1. 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경으로 UV 조명 아래에서 TG 와 DRG의 FG 라벨 뉴런 이미지를 가져 가라.
   2. 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경으로 TG 및 DRG에서 FG 및 CGRP 표지 뉴런의 이미지를 캡처합니다.
   3. 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지의 밝기와 대비를 조정하고 사진에 레이블을 추가합니다.

결과

두개골 듀라 메이트의 신경 혈관 구조
CGRP 및 phalloidin을 사용하여 면역형 및 형광 조직 화학 염색 후, CGRP 면역 반응성 신경 섬유 및 프할로이드인 라벨 듀랄 동맥 및 결합 조직 전체에 걸쳐 명확하게 3D 패턴(도2C,D, E, F)을입증하였다. 두껍고 얇은 CGRP-면역반응성 신경 섬유가 두껍고 얇은 신경 섬유가 두막 동맥, 혈관 벽 주?...

토론

이 연구에서는, 우리는 성공적으로 CGRP 항체 및 FG 신경 추적자를 사용하여 면역 형광, 3D 재건 및 신경 추적 접근 방식을 사용하여 두개골 dura mater에서 CGRP 면역 반응성 신경 섬유의 분포와 기원을 입증하여 조직학적 및 화학적 증거를 제공하여 두경 신경 혈관 네트워크를 더 잘 이해할 수 있습니다.

알려진 바와 같이, CGRP는 편두통^4,17의

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Software of fluorescent microscope
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from light
Fluorescent imaging system	Olympus	BX53
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a	Olympus	Version 4.2	Confocal image processing software system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Protect from light
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6	Photo editing software
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm