JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, sırasıyla CGRP ve phalloidin ile immünoforezan ve floresan histokmisi kullanarak kraniyal dura materdeki kalsitonin genle ilişkili peptid (CGRP)-immünoreaktif sinir lifleri ve kan damarlarının mekansal korelasyonunu görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Ek olarak, bu sinir liflerinin kökeni floresan bir nöral izleyici ile retrograd izlenmiştir.

Özet

Bu çalışmanın amacı immünofluoresans, üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon ve retrograd izleme tekniği kullanılarak kraniyal dura mater'in kalsitonin genle ilişkili peptid (CGRP)-immünoreaktif duyusal sinir liflerinin dağılımını ve kökenini incelemektir. Burada sinir lifleri ve kan damarları sırasıyla CGRP ve floresan phalloidin ile immünofluoresans ve histokrimi teknikleri kullanılarak lekelendi. Dural CGRP-immuoreaktif sinir lifleri ve kan damarlarının mekansal korelasyonu 3D rekonstrüksiyon ile gösterilmiştir. Bu arada, CGRP-immünreaktif sinir liflerinin kökeni, kraniyal dura materdeki orta meningeal arter (MMA) çevresindeki bölgeden trigeminal ganglion (TG) ve servikal (C) sırt kök gangliyonlarına (DRG) florogold (FG) ile nöral izleme tekniği ile saptandı. Ayrıca TG ve DRG'lerdeki FG etiketli nöronların kimyasal özellikleri de çift immünoflüoresans kullanılarak CGRP ile birlikte incelenmiştir. Şeffaf tam montajlı örnek ve 3D rekonstrüksiyondan yararlanarak, CGRP-immünreaktif sinir lifleri ve falloidin etiketli arteriyolların birlikte koştuğu veya 3D görünümde ayrı ayrı bir dural nörovasküler ağ oluşturduğu gösterilmiştir, FG etiketli nöronlar TG'nin oftalmik, maksiller ve mandibular dallarında bulunurken, bazı FG etiketli nöronların CGRP-immünreaktif ekspresyonla sunulduğu izleyici uygulamasının yanına C2-3 DRG'ler ipsilateral bulundu. Bu yaklaşımlarla kraniyal dura materdeki kan damarlarının etrafındaki CGRP-immünreaktif sinir liflerinin dağılım özelliklerinin yanı sıra bu sinir liflerinin kökenini TG ve DRG'lerden gösterdik. Metodoloji açısından bakıldığında, kraniyal dura mater'in fizyolojik veya patolojik durum altındaki karmaşık nörovasküler yapısını anlamak için değerli bir referans sağlayabilir.

Giriş

Kranial dura mater, beyni korumak için en dıştaki menenjit tabakasıdır ve bol miktarda kan damarı ve farklı sinir lifleri içerir1,2. Birçok çalışma, duyarlı kranial dura mater'in anormal vazodilasyon ve innervasyon içeren baş ağrısı oluşumuna yol açan anahtar faktör olabileceğini göstermiştir3,4,5. Bu nedenle, kranial dura materdeki nörovasküler yapı bilgisi, özellikle migren için baş ağrısı patogenezini anlamak için önemlidir.

Dura innervasyonu daha önce konvansiyonel immünhistokimya ile çalışılmış olsa da, kraniyal dura materdeki sinir liflerinin ve kan damarlarının mekansal korelasyonu daha az çalışılmıştır6,7,8,9. Dural nörovasküler yapıyı daha ayrıntılı olarak ortaya çıkarmak için, kalsitonin genle ilişkili peptit (CGRP) ve phalloidin, tüm mount kraniyal dura materdeki dural sinir liflerini ve kan damarlarını immünofluoresan ve floresan histokimya10ile boyamak için belirteçler olarak seçildi. Nörovasküler yapının üç boyutlu (3D) bir görünümünü elde etmek en uygun seçim olabilir. Ek olarak, florogold (FG), CGRP-immünreaktif sinir liflerinin kökenini belirlemek için kraniyal dura materinde orta meningeal arter (MMA) etrafındaki bölgeye uygulandı, trigeminal ganglion (TG) ve servikal (C) dorsal kök gangliyonlarına (DRG) kadar izlenirken, FG etiketli nöronlar immünofluoresans kullanılarak CGRP ile birlikte daha fazla incelendi.

Bu çalışmanın amacı, CGRP-immünreaktif innervasyon ve kökeni için kraniyal dura materdeki nörovasküler yapıyı araştırmak için etkili bir araç sağlamaktı. Şeffaf tam montajlı dura mater'den yararlanarak ve immünofluoresans, retrograd izleme, konfokal teknikler ve 3D rekonstrüksiyonu birleştirerek, kraniyal dura materdeki nörovasküler yapının yeni bir 3D görünümünü sunmayı bekliyorduk. Bu metodolojik yaklaşımlar, farklı baş ağrılarının patogenezini keşfetmek için daha fazla hizmet verebilir.

Protokol

Bu çalışma Çin Tıp Bilimleri Akademisi Akupunktur ve Moxibustion Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (referans numarası D2018-09-29-1). Tüm prosedürler Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne uygun olarak yapılmıştır (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Bu çalışmada 12 yetişkin Sprague-Dawley erkek sıçanı (ağırlık 220 ± 20 g) kullanılmıştır. Hayvanlar [lisans numarası SCXK (JING) 2017-0005] Ulusal Gıda ve İlaç Kontrol Enstitüleri tarafından sağlanmıştır.

1. Sıçan kranial dura mater innervasyonu

  1. Perfüzyonlar
    1. İntraperitoneally ötanazi indükleme için sıçana tribromoethanol çözeltisi (250 mg / kg) aşırı doz enjekte.
    2. Nefes durduğunda, transkardiyal olarak %0,9 normal salin 100 mL ile perfüzyoz ve ardından 0,1 M fosfat tamponunda %4 paraformaldehitin 250-300 mL'si (PB, pH 7,4).
    3. Perfüzyondan sonra, kafa derisini çıkarın ve beynin dura mater ve dorsal tarafını ortaya çıkarmak için kafatasını açın. Daha sonra beyin sapı boyunca kranial dura mater'i tüm montaj deseninde koku ampulüne kadar parçalara ayırın (Şekil 1). 2 saat boyunca %4 paraformaldehitte post-fiksasyon ve ardından 4 °C'de 24 saatten fazla 0,1 M PB'de %25 sakkarozda kriyoproteks işlemi gerçekleştirin.
  2. CGRP ve phalloidin etiketleme için floresan immünhistokmiya
    NOT: Sıçan kraniyal dura materinde dural sinir lifleri ve kan damarlarının tüm montaj düzeninde mekansal korelasyonunu ortaya çıkarmak için CGRP ve phalloidin floresan lekelenmesi kombinasyonu uygulandı.
    1. Kranial dura mater'i yaklaşık 1 dakika boyunca 0,1 M PB'de durulayın.
    2. Dura mater'i% 3 normal eşek serumu ve 0.1 M PB'de% 0.5 Triton X-100 içeren bir blokaj çözeltisinde 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
    3. Dura mater'i 4 °C 11'de bir gecede %1 normal eşek serumu ve %0,5 Triton X-100 içeren 0,1 M PB'de fare anti-CGRP antikoruna(1:1000)aktarın.
    4. Dura mater'i ertesi gün 0,1 M PB'de üç kez yıkayın.
    5. Dura mater'i eşek anti-fare Alexa Fluor 488 sekonder antikor (1:500) ve phalloidin 568 (1:1000) karışık bir çözeltisinde% 1 normal eşek serumu ve% 0.5 Triton X-100 oda sıcaklığında (26 ° C) 0.5 m PB içinde kuluçkaya bırakın.
    6. Dura mater'i 0,1 M PB'de üç kez yıkayın.
    7. Kenarları kırpın ve mikroskop slaytlarına monte etmenin (bkz. Malzeme Tablosu).
    8. Gözlemden önce% 50 gliserin ile kapak örtüleri takin.
  3. Gözlem ve kayıt
    1. Floresan mikroskop veya konfokal görüntüleme sistemi altında floresan örneklerini gözlemleyin.
    2. Dijital kamera (4x, NA: 0,13) ile donatılmış floresan mikroskopla tüm montajlı dura mater'in görüntülerini alın ve 500 ms pozlama süresi kullanın. Dura mater'in görüntü mozaikleri floresan mikroskop yazılımı ile tamamlanmıştır (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Konfokal mikroskop kullanarak dura mater'deki CGRP-immünreaktif sinir liflerinin ve phalloidin etiketli kan damarlarının görüntülerini alın. Ekscitasyon ve emisyon dalga boyları 488 nm (yeşil) ve 594 nm (kırmızı) olarak belirlendi. Konfokal iğne deliği 110 (20x) ve 105 μm 'dir (40x). Görüntü yakalama çözünürlüğü 640 x 640 pikseldir.
    4. Her 40 μm kalınlığındaki bölümden 2 μm karede 20 görüntü yakalayın ve 3D analiz için konfokal görüntü işleme ilişkili yazılım sistemiyle tek odak içi görüntü tümleştirmesini aşağıdaki gibi gerçekleştirin: Odak Düzlemini Başlat | Son odak düzlemini | ayarlama Adım boyutu | ayarlama Derinlik Deseni |'nı seçin Görüntü Yakalama | Z serisi.
    5. Görselleştirmeyi optimize etmek için görüntülerin parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için bir fotoğraf düzenleme yazılımı kullanın. Görüntülerden herhangi bir veri kaldırmamaya dikkat edin.

2. FG ile retrograd izleme çalışması

  1. Cerrahi prosedürler
    1. Sıçan kranial dura mater'in koordinat alanını belirleyin.
    2. 10 μL mikro şırınga hazırlayın ve sıvı parafin ile test edin.
    3. Fareleri intraperitoneal enjeksiyon ile tribromoethanol çözeltisi (150 mg/ kg) ile uyuşturun. Parmak sıkışmasına yanıt vermeyerek anestezideki derinliği kontrol edin.
    4. Farenin kafasını elektrikli jiletle tıraş edin.
    5. Sıçana künt kulak çubukları koyun ve stereotaksik cihaza yerleştirin. Daha sonra ağız tutucuyu koyun ve gözlere oftalmik merhem uygulayın.
    6. %10 povidon iyot ve ardından %75 etanol kullanarak baş derisinin cerrahi bölgesini temizleyin.
    7. Kafa derisinin orta çizgisi boyunca bir kesi yapın.
    8. Periosteum ve kas dokularını steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak kafatasından açıkça çıkarın (Şekil 1A).
    9. MMA 12'nin üzerindeki sol parietal ve temporal kemiklerde yuvarlak uçlu (#106) bir çapak matkabı kullanarak küçük bir delik(~5-7mm) delin ve kranial dura mater'in sağlam tutulduğundan emin olun (Şekil 1B).
    10. İzleyicinin yayılmasını sınırlamak için diş silikat çimentosu ile deliğin etrafına bir banka inşa edin (Şekil 1C).
    11. MMA çevresindeki deliğe 10 μL mikro şırınga ile 2 μL% 2 FG ekleyin (Şekil 1D).
    12. Deliği küçük bir hemostatik sünger parçasıyla kapatın.
    13. Deliğe bir parça parafin filmi koyun ve izleyicinin sızmasını önlemek ve çevredeki dokulara kirlenmeyi önlemek için kenarları kemik balmumu ile kapatın.
    14. Yarayı steril iplikle dikin.
    15. Sıçanları tamamen iyileşene kadar sıcak bir alanda tutun.
    16. Sıçanları kafeslerine geri koyun ve içme suyuna bir antibiyotik ve analjezik ekleyin.
  2. Perfüzyonlar ve bölümler
    1. 7 hayatta kalma gününden sonra, bölüm 1.1'deki prosedürlerde yukarıda belirtildiği gibi bu sıçanları perfuse edin.
    2. TG ve C1-4 DRG'leri parçalara ayrıştırın, sonra bölüm 1.1.3'te(Şekil 1F)belirtildiği gibi düzeltin ve kriyoproteks).
    3. TG ve DRG'leri sagittal yönde kriyostat mikrotom sistemi üzerinde 30 μm kalınlığında kesin ve silane kaplı cam kaydıraklara monte edin.
  3. TG ve DRG'lerde FG ve CGRP etiketleme için çift immünofluoresans
    NOT: FG etiketlemesi ek boyama olmadan cıva lambası altında UV aydınlatma ile doğrudan gözlemlenebilsede, 13,14,15,16, FG ile etiketlenmiş nöronlar, TG ve DRG'lerdeki dural CGRP-immünoreaktif sinir liflerinin kökenlerini ortaya çıkarmak için FG ve CGRP ile çift immünofluoresans kullanılarak TG ve servikal DRG'lerde daha fazla incelenmiştir.
    1. Histokimyasal kalemle bölümleri daire içine uza.
    2. Bölümleri% 3 normal eşek serumu ve% 0.5 Triton X-100 0.1 M PB içeren bir bloklama çözeltisinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Örnekleri% 1 normal eşek serumu ve% 0.5 Triton X-100 içeren 0.1 M PB'de tavşan anti-florogold (1:1000) ve fare anti-CGRP antikoru (1:1000) çözeltisine aktarın.
    4. Bölümleri ertesi gün 0,1 M PB'de üç kez yıkayın.
    5. Eşeğin anti-tavşanı Alexa Fluor 594 (1:500) ve eşek fare karşıtı Alexa Fluor 488 (1:500) ikincil antikorun karışık bir çözeltisinde% 1 normal eşek serumu ve% 0.5 Triton X-100 oda sıcaklığında 1.5 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. 1.2.6 ve 1.2.8.
  4. Gözlem ve kayıt
    1. Dijital kamera ile donatılmış floresan mikroskop ile UV aydınlatması altında TG ve DRG'lerdeki FG etiketli nöronların görüntülerini çekin.
    2. Dijital kamera ile donatılmış floresan mikroskop altında TG ve DRG'lerdeki FG ve CGRP etiketli nöronların görüntülerini yakalayın.
    3. Görüntülerin parlaklığını ve kontrastını ayarlamak ve resimlere etiketler eklemek için düzenleme yazılımını kullanın.

Sonuçlar

Kranial dura mater'in nörovasküler yapısı
CGRP ve phalloidin ile immünofluoresan ve floresan histokimyasal boyamadan sonra, CGRP-immünoreaktif sinir lifleri ve phalloidin etiketli dural arteriyüller ve bağ dokuları tüm mount kraniyal dura mater boyunca 3D desende açıkça gösterilmiştir (Şekil 2C,D, E,F). Hem kalın hem de ince CGRP-immünreaktif sinir liflerinin dural arteriyoküllere paralel olarak, damar d...

Tartışmalar

Bu çalışmada, kraniyal dura materdeki CGRP-immünoreaktif sinir liflerinin dağılımını ve kökenini, CGRP antikoru ve FG nöral izleyici ile immünofluoresans, 3D rekonstrüksiyon ve nöral izleme yaklaşımlarını kullanarak, dural nörovasküler ağı daha iyi anlamak için histolojik ve kimyasal kanıtlar sağlayarak başarıyla gösterdik.

Bilindiği gibi, CGRP migren patogenezinde kritik bir rol oynar4,17. Artan CGRP'nin v...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (Proje Kodu no. 2019YFC1709103; no. 2018YFC1707804) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Proje Kodu no. 81774211; no. 81774432; no. 81801561) projesi ile desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)Invitrogen by Thermo Fisher ScientificA21202Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrumentNarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympusVersion 1.1Software of fluorescent microscope
Confocal imaging systemOlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Protect from light
Fluorescent imaging systemOlympusBX53
Freezing microtomeThermoMicrom International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympusVersion 4.2Confocal image processing software system
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Mouse anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin 568Molecular ProbesA12380Protect from light
Photoshop and  IllustrationAdobeCS6Photo editing software
Rabbit anti- FluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738
Sprague DawleyNational Institutes for Food and Drug ControlSCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slidesThermo#4951PLUS-00125x75x1mm

Referanslar

  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 167kranial dura materorta meningeal arterkalsitonin gen ile ilgili peptitn ral izleme tekni iflorogold

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır