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要約

ここでは、CGRPおよびファロイジンを用いた免疫蛍光および蛍光組織化学を用いて、頭蓋デュラマー中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫反応性神経線維および血管の空間相関を可視化するプロトコルを提示する。また、これらの神経線維の起源は、蛍光神経トレーサーで逆行トレースした。

要約

本研究の目的は、免疫蛍光、三次元(3D)再構成および逆行トレーシング技術を用いた頭蓋硬膜のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫反応性感覚神経線維の分布と起源を調べることであった。ここで、神経線維と血管は、それぞれCGRPおよび蛍光ファロイジンを用いた免疫蛍光および組織化学技術を用いて染色した。硬膜CGRP-インミュール活性神経線維と血管の空間的相関を3D再構成によって実証した。一方、CGRP免疫反応神経線維の起源は、頭蓋頭膜神経節(TG)および子宮頸部側神経節(DrGs)の中髄膜動脈(MMA)周辺領域からフルオロゴールド(FG)を用いた神経学的追跡技術によって検出された。また、TGおよびDRGにおけるFG標識ニューロンの化学的特徴も、二重免疫蛍光を用いたCGRPと併せて調べた。透明な全実装サンプルと3D再構成を利用して、CGRP免疫反応性神経線維とファロイジン標識動脈が一緒に動くか、または別々に3Dビューで神経血管網を形成することを示した、 一方、FG標識ニューロンは、TGの眼、上顎、下顎の枝、およびFG標識ニューロンの一部がCGRP-免疫反応性を示すトレーサー適用の側にC2-3 DRGのイプシララルで発見された。これらのアプローチにより、頭蓋硬膜の血管周囲のCGRP免疫反応性神経線維の分布特性、ならびにTGおよびDRGからのこれらの神経線維の起源を実証した。方法論の観点から、生理学的または病理学的状態下での頭蓋硬膜の複雑な神経血管構造を理解するための貴重な参考文献を提供し得る。

概要

頭蓋硬膜は、脳を保護するための髄膜の最外層であり、豊富な血管と神経線維の異なる種類1、2が含まれています。多くの研究は、感作頭蓋硬膜が異常な血管拡張およびインナーベーション3、4、5を含む頭痛の発生につながる重要な要因である可能性があることを示している。したがって、頭蓋硬膜における神経血管構造の知識は、特に片頭痛の発病を理解するために重要である。

硬膜の内膜は従来の免疫検査で以前に研究されてきたが、頭蓋硬膜における神経線維と血管の空間的相関は6、7、8、9より少なかった。より詳細に神経血管構造を明らかにするために、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)およびファロイジンを、免疫蛍光および蛍光組織化学10を有する全実装頭蓋デュラ・マテルにおける硬膜神経線維および血管をそれぞれ染色するためのマーカーとして選択した。神経血管構造の三次元(3D)ビューを得るのに最適な選択であり得る。さらに、 フルオロゴールド(FG)は、脳神経筋の中髄膜動脈(MMA)周辺領域に適用され、CGRP免疫反応性神経線維の起源を決定し、3叉神経節(TG)および子宮頸部(C)後頭根神経節(DRG)に追跡され、FG標識ニューロンは免疫伝達を用いてさらに一緒に検査した。

本研究の目的は、CGRP免疫反応性の内挿とその起源に対する頭蓋硬膜の神経血管構造を調査するための有効なツールを提供することであった。透明な全実装型DURa materを利用し、免疫蛍光、逆行トレーシング、共焦点技術、および3D再構成を組み合わせることで、頭蓋デュラマーターにおける神経血管構造の新しい3Dビューを提示することが期待された。これらの方法論的アプローチは、異なる頭痛の病因を探索するためにさらに役立つ可能性がある。

プロトコル

この研究は、中国医学アカデミー鍼灸研究所の倫理委員会(参考番号D2018-09-29-1)によって承認されました。すべての手順は、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイド(国立アカデミー出版局、ワシントンD.C、1996)に従って行われました。この研究では、12匹の成人スプレイグ・ドーリー雄ラット(体重220±20g)を使用した。動物[ライセンス番号SCXK(JING)2017-0005]は、国立食品医薬品管理研究所によって提供されました。

1. ラット頭蓋硬膜のインナーブ

  1. 灌流
    1. 腹腔内にトリブロモエタノール溶液(250mg/kg)の過剰摂取をラットに注入し、安楽死を誘発する。
    2. 呼吸が止まると、100mLの通常の生理食塩基が0.9%、0.1Mのリン酸緩衝液(PB、pH 7.4)に250〜300mLの4%パラホルムアルデヒドが続きます。
    3. 灌流した後、頭の皮膚を取り除き、頭蓋骨を開いて脳の硬膜と後側を露出させる。次に、脳幹に沿って頭蓋硬膜を全マウントパターンの嗅球に解剖する(図1)。4%パラホルムアルデヒドで2時間後に固定後を行い、4°Cで24時間以上0.1M PBで25%スクロースで凍結保護を行います。
  2. CGRPおよびファロイジン標識のための蛍光免疫組織化学
    注:CGRPとファロイジンの蛍光染色の組み合わせを適用し、全マウントパターンにおけるラット頭蓋硬膜の硬膜神経線維と血管の空間的相関を明らかにしました。
    1. 頭蓋デュラマーターを0.1 M PBで約1分間リンスします。
    2. デュラマーターを、3%正常ロバ血清を含むブロッキング溶液にインキュベートし、0.5%トリトンX-100を0.1 M PBで30分間インキュベートします。
    3. デュラマーターをマウス抗CGRP抗体(1:1000)に移し、1%正常ロバ血清を含む0.1M PBおよび0.5%トリトンX-100を4°C11で一晩含有させる。
    4. 翌日0.1M PBで硬膜を3回洗います。
    5. 1%正常ロバ血清と0.5%トリトンX-100を室温(26°C)で1.5時間含む0.1M PBにロバ抗マウスアレクサフルオール488二次抗体(1:500)とファロイドン568(1:1000)の混合溶液で硬膜をインキュベートする。
    6. 硬膜を0.1M PBで3回洗います。
    7. エッジをトリムし、顕微鏡スライドに取り付けます( 材料表を参照)。
    8. 観察前に50%グリセリンでカバースリップを置きます。
  3. 観察と記録
    1. 蛍光顕微鏡または共焦点イメージングシステムで蛍光サンプルを観察します。
    2. デジタルカメラ(4x、NA:0.13)を搭載した蛍光顕微鏡で全体実装デュラマーの画像を撮影し、500 msの露光時間を使用します。硬膜の画像モザイクは、蛍光顕微鏡のソフトウェアで完成しました( 材料表を参照)。
    3. 共焦点顕微鏡を用いて、硬膜中のCGRP免疫反応性神経線維およびファロイジン標識血管の画像を撮ります。励起波長と発光波長は488nm(緑色)、594nm(赤)であった。コンフォーカルピンホールは110(20x)と105 μm(40x)です。画像キャプチャの解像度は 640 x 640 ピクセルです。
    4. 各40 μmの厚さセクションから2μmフレームの20枚の画像をキャプチャし、3D解析用の共焦点画像処理関連ソフトウェアシステムとの単一の焦点内画像統合を実行 |します。 エンドフォーカルプレーン|を設定するステップ サイズ |を設定する深度パターン|を選択イメージ キャプチャ|Zシリーズ。
    5. 写真編集ソフトウェアを使用して、画像の明るさとコントラストを調整して、ビジュアライゼーションを最適化します。画像からデータを削除しないように注意してください。

2. FGによる逆行トレース研究

  1. 手術
    1. ラット頭蓋硬膜の対象となる座標領域を決定します。
    2. 10 μL マイクロシリンジを準備し、液体パラフィンでテストします。
    3. ラットを腹腔内注射でトリブロモエタノール溶液(150mg/kg)で麻酔します。つま先ピンチへの応答の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
    4. 電気カミソリでネズミの頭を剃ります。
    5. ラットに鈍い耳の棒を置き、ステレオタックスデバイス上に置きます。その後、口ホルダーを入れ、眼科軟膏を目に当てる。
    6. 10%ポビドネヨウ素を使用して、ヘッドスキンの手術部位を洗浄し、その後75%エタノールを使用します。
    7. 頭皮の正中線に沿って切開を行います。
    8. 無菌綿先端アプリケーターを使用して頭蓋骨から骨膜組織と筋肉組織を鈍く取り除く(図1A)。
    9. MMA12の上の左頭頂部と側頭骨に丸い先端ビット(#106)を持つバリドリルを使用して小さな穴(約5〜7mm)を掘削し、頭蓋硬膜がそのまま保持されていることを確認します(図1B)。
    10. トレーサーの広がりを制限するために、歯科ケイ酸塩セメントで穴の周りにバンクを構築します(図1C)。
    11. 2%FGの2μLを10μLマイクロシリンジでMMAの周りの穴に加えます(図1D)。
    12. 小さな止血スポンジで穴を覆います。
    13. 穴にパラフィンフィルムを置き、トレーサーの漏れを防ぎ、周囲の組織への汚染を避けるために骨ワックスで縁を密封します。
    14. 傷口を無菌糸で縫合する。
    15. ラットが完全に回復するまで、暖かい場所に保管してください。
    16. ラットをケージに戻し、抗生物質と鎮痛剤を飲料水に加えます。
  2. 灌流とセクション
    1. 7日間生存後、セクション1.1の手順で上述したようにこれらのラットを浸透する。
    2. TGおよびC1-4 DRGを解剖し、後修正し、セクション1.1.3(図1F)で前述したようにそれらを凍結保護する。
    3. TGとDRGを、矢状方向のクライオスタットミクロトームシステムで30μmの厚さで切り、シランコーティングされたガラススライドに取り付けます。
  3. TGおよびDRGにおけるFGおよびCGRP標識のための二重免疫蛍光
    注:FG標識は、追加の染色なしで水銀ランプ下のUV照明で直接観察することができますが、FGを有する標識ニューロンは、TGおよびDRGにおける硬直CGRP免疫神経線維の起源を明らかにするためにFGおよびCGRPを用いた二重免疫蛍光を使用してTGおよび子宮頸部DRGでさらに検査された。
    1. セクションを、その部分を、その中のヒストケミカルペンで囲みます。
    2. 3%正常ロバ血清を含むブロッキング溶液に30分間、0.1M PBで0.5%トリトンX-100をインキュベートします。
    3. サンプルをウサギの抗フルオロゴールド(1:1000)およびマウス抗CGRP抗体(1:1000)の溶液に、通常のロバ血清1%、トリトンX-100を一晩4°Cで含む0.1M PBに移します。
    4. 次の日に0.1M PBで3回洗浄してください。
    5. ロバ抗ウサギアレクサFluor 594(1:500)とロバ抗マウスアレクサフルオール488(1:500)の2次抗体を1%正常ロバ血清と0.5%トリトンX-100を室温で1.5時間含む0.1M PBの混合溶液でインキュベートする。
    6. 手順 1.2.6 および 1.2.8 の手順として、セクションにカバーリップを洗浄して適用します。
  4. 観察と記録
    1. デジタルカメラを搭載した蛍光顕微鏡で、TGおよびDRGのTGおよびDRGのニューロンをUV照明で撮影します。
    2. デジタルカメラを搭載した蛍光顕微鏡下で、TGおよびDRGのFGおよびCGRP標識ニューロンの画像をキャプチャします。
    3. 編集ソフトウェアを使用して、画像の明るさとコントラストを調整し、画像にラベルを追加します。

結果

頭蓋硬膜の神経血管構造
CGRPおよびファロイジンによる免疫蛍光および蛍光組織化学的染色の後、CGRP免疫反応性神経線維およびファロイジン標識された硬動脈および結合組織は、3Dパターンで全身に明示された(図2C、D、E、F)。厚くて薄いCGRP免疫反応神経線維は、両方とも、血管壁の周り、または血管間の硬膜動脈に?...

ディスカッション

本研究では、免疫蛍光、3D再構成、および神経トレーサーによる神経トレーサによる脳神経障害におけるCGRP免疫反応性神経線維の分布と起源を実証し、神経血管網の理解を深める組織学的および化学的証拠を提供した。

それが知られていたように、CGRPは片頭痛4、17の病因において重要な役割を果たしている。増加したCGRPは、3...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、中国国家キーR&Dプログラム(プロジェクトコード番号2019YFC1709103;No.2018YFC1707804)と中国国立自然科学財団(プロジェクトコード番号81774211;no.81774432;no.818015611)のプロジェクトによって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)Invitrogen by Thermo Fisher ScientificA21202Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrumentNarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympusVersion 1.1Software of fluorescent microscope
Confocal imaging systemOlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Protect from light
Fluorescent imaging systemOlympusBX53
Freezing microtomeThermoMicrom International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympusVersion 4.2Confocal image processing software system
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Mouse anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin 568Molecular ProbesA12380Protect from light
Photoshop and  IllustrationAdobeCS6Photo editing software
Rabbit anti- FluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738
Sprague DawleyNational Institutes for Food and Drug ControlSCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slidesThermo#4951PLUS-00125x75x1mm

参考文献

  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

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