Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذه المادة يقدم سلسلة من الطرق المتتالية للتعبير وتنقية السالمونيلا تيفيموريوم التربتوفان synthase شركات هذا البروتوكول نظام سريع لتنقية مجمع البروتين في يوم واحد. الأساليب المغطاة هي تولد الدم الموجه من الموقع ، والتعبير البروتيني في الإشريكية القولونية، والكروماتوغرافيا تقارب ، كروماتوغرافيا الترشيح هلام ، وتبلور.

Abstract

الدراسات الهيكلية مع التربتوفان synthase (TS) مجمع bienzyme (α2β2 TS) من السالمونيلا تيفيموريوم وقد أجريت لفهم أفضل لآلية الحفاز، والسلوك الألوستيرون، وتفاصيل التحول الأنزيمي من الركيزة إلى المنتج في الإنزيمات التي تعتمد على حزب العمال التقدمي. في هذا العمل، سمح نظام تعبير جديد لإنتاج وحدة β α المعزولة والمعزولة بتنقية كميات عالية من الوحدات الفرعية النقية α2β2StTS مجمع من الوحدات الفرعية المعزولة في غضون يومين. تم التنقية عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب تليها انشقاق علامة تقارب، وهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم، وحجم استبعاد الكروماتوغرافيا (SEC). لفهم دور المخلفات الرئيسية في إنزيم β الموقع بشكل أفضل ، تم إجراء تولد مباشر للموقع في دراسات هيكلية سابقة. تم إنشاء بروتوكول آخر لتنقية النوع البري والمتحول α2β2 مجمعاتسانتTS. بروتوكول بسيط وسريع وفعال باستخدام تجزئة كبريتات الأمونيوم وSEC سمح لتنقية α2β2StTS المعقدة في يوم واحد. كلا بروتوكولات تنقية وصفها في هذا العمل لها مزايا كبيرة بالمقارنة مع البروتوكولات السابقة لتنقية نفس المجمع باستخدام PEG 8000 والحيوانات المنوية لبلورة α2β2StTS المعقدة على طول بروتوكول تنقية. تبلور نوع البرية وبعض أشكال متحولة يحدث في ظل ظروف مختلفة قليلا، وإضعاف تنقية بعض المسوخ باستخدام PEG 8000 والحيوانات المنوية. لإعداد بلورات مناسبة للدراسات البلورية بالأشعة السينية بذلت عدة جهود لتحسين التبلور وجودة الكريستالوالتبريد. وينبغي أن تكون الطرق المعروضة هنا قابلة للتطبيق عموما لتنقية الوحدات الفرعية synthase التربتوفان ونوع البرية ومتحولة α2β2 StTSالمجمعات.

Introduction

مجمع التربتوفان synthase (TS) bienzyme (α2β2)هو إنزيم الألوستيرون، تحفيز الخطوتين الأخيرتين في التمثيل الحيوي للأحماض الأمينية L-تريبتوفان في البكتيريا والنباتات والفطريات1،2،3. بكتيريا السالمونيلا المعوية سيروفار تيفيموريوم (سانت)يسبب عدوى حادة في الجهاز الهضمي في البشر والحيوانات الأخرى. وبما أن البشر والحيوانات الأعلى ليس لديهم TS (EC 4.2.1.20) ، فإن تثبيط S. تم استكشاف typhimurium α2β2 TS مجمع (α2β2سانتTS) كهدف المخدرات المحتملة لعلاج cryptosporidiosis والسل4, التناسلية والعينية العدوى5, واستخدام مبيدات الأعشاب المحتملة فيالزراعة 6. α-subunit يحفز الانقسام الالدولية من الاندول-3-الجلسرين-فوسفات (IGP) إلى جليسيرالدهيدي-3-فوسفات (GAP) والانول, من خلال تشكيل الاندولينين tautomer وسيطة وبعد ذلك الكربون الكربون السندات الانقسام لإنتاج GAP والاتول3,6. يحتوي الموقع β الحفاز على جزيء مساعد بيريدوكسال 5′-فوسفات (PLP) مرتبط β-Lys87 عبر قاعدة Schiff ، والذي يعمل كبالوعة إلكترون في سياق ردود الفعل في الإنزيم β-subunit3,7. يحفز الموقع β استبدال الهيدروكسيل الجانبي L-Serine بالاندول لإعطاء L-Tryptophan وجزيء الماء في رد فعل يعتمد على PLP. سانت TS بمثابة نموذج طويل الأمد للتحقيق في توجيه الركيزة والاتصال التوستروني داخل المجمعات متعددة الانزيمات2،3. الاتصال الالستيري ثنائي الاتجاه بين α β-subunits من TS ضروري لمزامنة الخطوات الحفازة ومنع إطلاق الندول أثناء توليف L-تريبتوفان3. لتوسيع هذا الجهد، قمنا بإعداد العديد من المسوخ (β-Gln114Ala، β-Lys167Thr، و β-Ser377Ala) عن طريق طفرة نقطة واحدة لاستخدامها في مزيد من الاستكشافات للعلاقة بين هيكل الإنزيم وآلية ووظيفة في الموقع الحفاز من سانتTS β subunit.

بدأت مجموعة البحث إديث دبليو مايلز البحث التفصيلي حول الآلية الحفازة α2β2StTS. وقد ركزت الدراسات المبكرة مع الأصلي Escherichia القولونية α2β2 TS المعقدة على تنقية وتوصيف وحدة α الفرعيةالمعزولة 8،9، معزولة β وحدة فرعية10،11 وإعادة تشكيل مجمع α2β2 TS من الوحدات الفرعية المعزولة12. تم تنقية من قبل هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم، وغسيل الكلى عينة، DEAE-Sephadex الكروماتوغرافيا، غسيل الكلى، وجولة كروماتوغرافية ثانية على عمود DEAE-Sephadex12. في بروتوكول آخر ، تم تحسين تنقية نفس المجمع عن طريق تحميل lysate الخلية الموضحة على عمود DEAE-Sephadex تليها خطوة كروماتوغرافية على عمود سيفاروز 4B ، وهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم وغسيل الكلى13. كلا البروتوكولين تنقية تستمر لمدة 4-5 أيام. Escherichia القولونية α2β2 TS معقدة تبلورت ولكن بلورات لم تكن مناسبة للانعراج الأشعة السينية في ذلك الوقت.

في دراسة جديدة، تم تنقية أشكال نوع المؤتلف والبرية من S. تيفيموريوم α2β2 TS المعقدة وتبلور14،15. تم التعبير عن مركب αالمؤتلف 2β2StTS بشكل مفرط في سلالة الإشريكية القولونية CB149 التي تحمل ناقل التعبير pEBA-10. تم الإبلاغ عن التبلور الأولي وجمع بيانات حيود الأشعة السينية وتحليل α2β2مجمع سانتTS14. ومع ذلك، إبرة طويلة ورقيقة مثل α2β2بلوراتسانتTS ضعف الدراسات الهيكلية. في محاولة لجمع أفضل بيانات حيود الأشعة السينية، ووصف بروتوكول تنقية آخر لتنقية نوع البرية وأشكال متحولة من α2β2StTS مجمع15. تم إجراء تنقية مع هطول الأمطار الأولي باستخدام spermine و PEG 8000 في lysate الخلية الموضحة وإزالة عجل ضخمة كبيرة عن طريق الطرد المركزي. تم تخزين الكسر الفائق الذي يحتوي على كميات عالية من α2β2مجمع StTS لمدة 16-48 ساعة عند 4 درجات مئوية حتى عجلت بلورات صفراء. تم غسل البلورات و dialyzed على نطاق واسع ضد المخازن المؤقتة المختلفة. تم إعادة تبلور مجمع البروتين في العازلة التي تحتوي على كبريتات الأمونيوم و dialyzed15. على الرغم من أن تبلور البروتين يعتمد على البروتين وتركيزات متسرعة في الحل، فإنه من الصعب رصد والتنبؤ، وإعادة إنتاج تنقية لأشكال متحولة أخرى من α2β2StTS المعقدة في الحل. هذا البروتوكول له ميزة أنه لا يستخدم أي طرق كروماتوغرافية; ومع ذلك ، فإن المساوئ هي وقت التنقية الطويل اللازم لبلورة ، dialyze ، وإعادة التبلور ، وعادة ما تتطلب 5-7 أيام. للحصول على بلورات مناسبة لجمع بيانات الأشعة السينية، تم تقييم أكثر من 600 حالة تبلور باستخدام مزيج وتنوع تركيز البروتين ودرجة الحرارة والمهمات (PEG 4000 و6000 و8000)، والمواد المضافة (CaCl2، MnCl2، ZnCl2، الجثث ، الرسين ، الحيوانات المنوية ، أو spermidine)15. بلورات كان شكل بلوري أفضل ونمت بشكل أسرع في الظروف التي تحتوي على 12٪ PEG 8000 و 2 mM spermine. كان التبلور أكثر ملاءمة عند 25 درجة مئوية بدلا من 4 أو 30 أو 42 درجة مئوية ونما إلى أقصى أبعاد في غضون 3 أيام15. تم الإبلاغ عن عدة α2β2StTS الهياكل الكريستالية في ذلك الوقت (1996-1999)16،17،18،19،20،21 والعديد من الهياكل الأخرى قد نشرت حتى الآن.

هنا, الغرض الرئيسي هو تقديم بروتوكولات بديلة لتنقية synthase التربتوفان وتحسين تبلور البروتين. يظهر هذا العمل تحسينات كبيرة لتنقية النوع البري المعزول α الفرعي (αStTS) ، β الفرعي المعزول (βStTS) ، المعاد تشكيله α2β2مجمعStTS من الوحدات الفرعية المعزولة ، والنوع البري والأشكال المتحولة α2β2StTS complex. المزايا على البروتوكولات السابقة كبيرة منذ تم تخفيض وقت تنقية بشكل كبير وتبلور و cryoprotection تم الأمثل. وقد تبلورت أشكال متحولة من α2β2مجمع سانتTS المهندسة في هذا العمل بالقرب من نفس الشرط المستخدمة لشكل نوع البرية. ومع ذلك ، كان من الضروري تحسين التبلور الدقيق للحصول على بلورات واحدة كبيرة ذات جودة كافية لتحديد الهيكل بدقة ذرية قريبة. حتى الآن، هناك 134 هياكل الكريستال التربتوفان synthase المودعة في بنك بيانات البروتين (PDB)، والمحاسبة 101، 31 و 2 هياكل الكريستال، على التوالي، للبكتيريا، archaea و eukaryote. لطيف، 73 هياكل تنتمي إلى S. enterica سيروفار تيفيموريوم و 5 هياكل الكريستال من α2β2StTS المعقدة لديها حدود القرار أعلى من 1.50 Angstroms. ليس من المستغرب، تم إعداد 4 من أصل 5 في مجموعتنا البحثية (PDB IDs:5CGQ في 1.18 Å، 4HT3 في 1.30 Å، 4HPJ في 1.45 Å، 6DZ4 في 1.45 Å القرار). ومن المتوقع أن توفر الهياكل البلورية المكررة لشكل متحول من α2β2StTS المعقد رؤى جديدة في الآلية والأدوار التي تلعبها بقايا الأحماض الأمينية الأساسية المشاركة في توليف L-تريبتوفان.

Protocol

1. بروتوكول سريع لتنقية α β وحدة فرعية وإعادة دمجها α2β2مجمع سانتTS

  1. منع دخول الحمض النووي إلى متجه تعبير pETSUMO
    1. الحصول على جين اقتران ترجمة (trpA و trpB) ترميز α- و β-subunits من synthase التربتوفان من بكتيريا السالمونيلا enterica سيروفار تيفيموريوم المستنسخة في pEBA-10 التعبير ناقلات22. استخدم ناقل pEBA-10 كقالب DNA.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام التمهيديات المذكورة أدناه لتضخيم كل من الجينات من جينوم السالمونيلا المعوية سيروفار تيفيموريوم. تم اتباع جميع خطوات البيولوجيا الجزيئية كما هو موضح في الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبر23.
    2. استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم تسلسل البولينوكليوتيدات الكامل الطول α-subunit(αStTS) مع المبرمجين αStTS-FW-Bam و αسانتTS-Rev-Eco وتسلسل كامل الطول من β-subunit(βسانتTS) مع التمهيديات βسانتTS-FW-Bam βسانتTS-Rev-Hind. استخدام درجة حرارة ذوبان ما يقرب من 55 درجة مئوية وفترة تمديد البوليميراز من 2 دقيقة.
      1. استخدم بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (على سبيل المثال، فوسيون) وبروتوكول الشركة المصنعة لتضخيم تسلسل الحمض النووي. لتفاعل PCR 50 ميكرولتر إضافة 34 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز، 10 ميكرولتر من العازلة رد فعل 5x، 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي، 1 ميكرولتر من الحمض النووي قالب (200 نانوغرام)، 1.5 ميكروغرام من DMSO، 0.5 ميكروغرام من فوسيون DNA بوليمراسي.
      2. بالنسبة لبرنامج PCR، استخدم بداية ساخنة (180 ثانية عند 98 درجة مئوية) تليها 30 دورة تضخيم (30 ثانية عند 98 درجة مئوية، و30 ثانية عند 55 درجة مئوية و120 ثانية عند 72 درجة مئوية)، وتمديد نهائي (300 ثانية عند 72 درجة مئوية).
        ملاحظة: تتوافق التسلسلات المائل مع مواقع تقييد BamHI وEcoRI و BamHI و HindIII على التوالي. تم تعزيز كفاءة إنزيم الانقسام قريبة من termini من شظايا PCR بإضافة قواعد إضافية (تسلسل صغير).
        αسانتTS-FW-بام: 5′-cgcغغاتكATGGAACGCTACGAAA-3′
        αسانتTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βسانتTS-FW-بام: 5′-cgcغغاتسكATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βسانتTS-Rev-هند: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. تحميل PCR المنتج على هلام agarose 0.8٪ في 1x TAE العازلة (40 mM تريس، 20 mM حمض الخليك و 1 mM EDTA) في 6 V / سم، هلام استخراج الفرقة الحمض النووي من الفائدة، وهلام تنقية جزء PCR باستخدام طقم حبة السيليكا بعد تعليمات من الشركة المصنعة.
      1. هضم ما لا يقل عن 200 نانوغرام من كل جزء من الحمض النووي مع الإنزيمات تقييد المناسبة والظروف الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
      2. لإعداد 50 ميكرولتر تقييد رد فعل الهضم إضافة 34 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكليز، 10 ميكرولتر من الحمض النووي (200 نانوغرام)، 5 ميكرولتر من العازلة رد فعل 10x، 0.5 ميكروغرام من تقييد الانزيم 1، و 0.5 ميكرولتر من تقييد الانزيم 2.
      3. تحميل المنتج الهضم على هلام agarose 0.8٪ على TAE 1x في 6 V / سم، استخراج هلام، وهلام تنقية جزء هضم باستخدام عدة التجارية.
    4. subclone كل جزء على حدة في التعبير E. القولونية تعديل ناقلات pET سومو، هضم سابقا مع الإنزيمات المناسبة وهلام تنقيتها.
      ملاحظة: هذا المتجه هو إصدار معدل من السومو pET التجارية. وقد تم تحسين هذا المتجه لاستنساخ الإنزيم تقييد. تم إدراج موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) لنقل pET28b(BamHI و EcoRI و SacI و SalI و HindIII و NotI و XhoI) في موقع استنساخ PET SUMO. يحتوي هذا المتجه على علامة N-terminal 6x-Histidine في الإطار مع بروتين المعدل الصغير الشبيه ب Ubiquitin (SUMO) ومواقع الاستنساخ المتعددة.
    5. Ligate 100 نانوغرام من السومو pET المعدلة و 50 نانوغرام من جزء PCR مع T4 الحمض النووي ليغاني لمدة 2 ساعة في 25 درجة مئوية.
    6. تحويل البلازميد شيدت إلى خلايا المختصة من سلالة الإشريكية القولونية DH10Bα الخلايا. خلايا لوحة على لوحات أجار LB تحتوي على 35 ميكروغرام / مل كاناميسين. احتضان لوحة مقلوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    7. حدد مستعمرة واحدة من كل تحول، وإعداد الحمض النووي البلازميد فائقة النقاء، وإجراء تسلسل الحمض النووي للتحقق من أن αسانتTS أو β تم استنساخسانتTS في إطار مع علامة N-terminal His6-SUMO.
      ملاحظة: إعداد مخزونات الجلسرين من ثقافة الخلية (بدوره تعليق الخلية في تركيز نهائي 16٪ من الجلسرين العقيم) وتخزينها على المدى الطويل في -80 درجة مئوية.
    8. تحويل التعبير plasmid SUMO-αسانتTS أو سومو βسانتTS بشكل فردي إلى خلايا المختصة من E. القولونية التعبير سلالة روزيتا (DE3) pLysS مع نظام T7 القائم على المروج. لوحة الخلايا المؤتلفة على لوحات لوريا بيرتاني (LB) أجار تحتوي على 35 ميكروغرام / مل كاناميسين وكلورامينيكول. احتضان لوحة مقلوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    9. بعد تشكيل مستعمرة ناجحة، واختيار مستعمرة واحدة واحدة (دون أي مستعمرات الأقمار الصناعية) وتفريقه في 5 مل من LB المتوسطة مع كل من المضادات الحيوية. خلايا الثقافة بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: إعداد مخزونات الجلسرين من زراعة الخلايا، وتخزين على المدى الطويل في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور للتعبير البروتين المؤتلف.
  2. التعبير عن الوحدات الفرعية سوموαسانتTS وS SUMO-βStTS
    1. تلقيح الطازجة E. القولونية سلالة روزيتا (DE3) خلايا pLysS إيواء سومو-αسانتTS أو سومو-βسانتTS يبني أو كشط بعض من مخزون الجلسرين المجمدة في ثقافة 50 مل من LB تحتوي على 35 ميكروغرام / مل كاناميسين وكلورامفينيكول. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
    2. صباح اليوم التالي، تلقيح 5 مل من ثقافة الخلية بين عشية وضحاها في 2x 1000 مل الطازجة والعقيمة من LB تحتوي على 2٪ الجلسرين بالإضافة إلى كاناميسين وكلورامينيكول (2.8 L قارورة فرنباخ). تنمو ثقافة الخلية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: التعبير عن سومو-αسانتTS أو سومو-βسانتTS في مرق LB تسفر عن 125-150 ملغ من البروتين الموسومة للتر الواحد. النظر في توسيع نطاق البروتوكول صعودا أو وصولا الى تلبية مطالب محددة.
    3. حث تعبير البروتين المؤتلف عندما OD600 تصل إلى 0.6-0.8 بإضافة ايزوبروبيل β-D-1 ثيوغالاكتوبيرانوسايد (IPTG) بتركيز نهائي قدره 0.4 mM تليها الحضانة في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
    4. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات الخلية مع العازلة تحلل الباردة 1 (50 mM تريس-Cl، pH 8.0، تحتوي على 500 mM NaCl، 5٪ الجلسرين، 10 mM 2-mercaptoethanol، و 40 mM imidazole-Cl) إلى حجم نهائي من 60 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتنقية البروتين. لتخزين الخلايا، تقسيم تعليق الخلية إلى 2 × 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية المتاح والحفاظ على الكريات الخلية في -80 درجة مئوية حتى خطوة تنقية البروتين.
  3. تنقية α- و β وحدات فرعية من التربتوفان synthase
    ملاحظة: جميع الإجراءات التي يتعين القيام بها في 4 درجة مئوية ما لم ينص على خلاف ذلك. لتقليل وقت التنقية، متساوية الأضلاع ني-NTA agarose النيكل المشحونة أعمدة التقارب وحجم عمود الاستبعاد في العازلة قبل تنقية البروتين أو أثناء التعبير البروتين المؤتلف.
    1. تعطيل بيليه الخلية عن طريق سونيكيشن باستخدام sonifier الرقمية مع 1/2 "القرن التحقيق (أو معدات مماثلة). أداء 20 دورات في 80٪ دورة واجب السعة على حمام الماء المثلج باستخدام نبض 10 ق و 20 ق بقية أو حتى انقطاع كامل للخلية.
    2. الطرد المركزي الخلية lysate في 30،000 × ز لمدة 30 دقيقة. أسبيرات فائقة، وضمان بيليه لا طرد من أنبوب. تصفية supernatant مع وحدة تصفية 0.45 ميكرومتر على الجليد وتدفقه من خلال 15 مل ني-NTA agarose النيكل المشحونة عمود تقارب قبل equilibrated في تحلل العازلة 1.
      ملاحظة: سيتم استخدام كل عمود ني-NTA agarose لتنقية إما سومو-αسانتTS أو سومو-βسانتTS البروتين المؤتلف. يمكن إجراء تنقية في عمود 2x 5 مل Ni-NiTA المرفق بنظام كروماتوغرافيا سائل بروتين سريع. تنقية بروتين واحد في وقت واحد.
    3. غسل ني-NTA agarose العمود في 100 مل من تحلل العازلة 1.
    4. المضي قدما مع 80 مل من خطوة واحدة elution مع العازلة E1 (25 mM تريس- Cl العازلة، pH 7.8، تحتوي على 200 م م NaCl، 5٪ الجلسرين، و 400 mM imidazole-Cl).
      ملاحظة: يتسامح SUMO-protease مع ما يصل إلى 300 مللي متر إيميدازول ويتسامح غشاء أجهزة التصفية الطرد المركزي مع ما يصل إلى 100 مللي متر إيميدازول. نوصي بإجراء هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم لإزالة كميات عالية من imidazole وتقليل وقت تنقية بدلا من ذلك تمييع عينة البروتين وإهدار الوقت مع تركيز البروتين.
    5. تقييم الحجم الأولي للكسر الفائق. أضف كميات صغيرة من كبريتات الأمونيوم ببطء في كل مرة، حتى يتم الوصول إلى تشبع بنسبة 60٪ (39.48 غرام / 100 مل) عند 25 درجة مئوية. يحرك الحل برفق لمدة 30 دقيقة وتجنب الفقاعات. جهاز طرد مركزي عند 10,000 x g لمدة 15 دقيقة.
    6. أسبيرات وتجاهل كسر فائق بعناية. Resuspend كسر بيليه في 20 مل من عينة العازلة (20 mM تريس-Cl, pH 8.0, 300 م م NaCl و 5٪ الجلسرين).
    7. لانشقاق له-سومو-العلامة مع سومو-بروتياز، إضافة جزء المؤتلف من بروتياز Ubl محددة 1 من Saccharomyces cerevisiae في نسبة 1:1000 واحتضان الخليط لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية.
    8. طرد مركزي منتج الهضم في 10،000 × ز في 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإزالة المجاميع البروتين قبل تحميل العينة من خلال عمود الكروماتوغرافيا تقارب.
    9. إزالة آثار علامة His6-SUMO تمرير عينة 20 مل resuspended على عمود 15 مل ني-NTA agarose، سابقا متوازنة في تحلل العازلة 1.
    10. جمع نموذج التمريري التي تحتوي على αStTS غير الموسومة أو βStTS.
    11. اغسل عمود Ni-NTA في 20 مل من العازلة 1 لجمع بقايا α StTS أو β stTSغير الموسومة.
    12. ركز كل وحدة فرعية بشكل منفصل مع وحدة فلتر طرد مركزي مقطوعة سعة 15 مل 10 كيلودا عن طريق الدوران عند 3000 × غرام عند 4 درجات مئوية. نقل البروتين المركز إلى أنبوب 2.0 مل طازجة والمطاردات الدقيقة (10،000 × ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية) لإزالة المجاميع. تحديد تركيز البروتين24، وإعداد 1 مل aliquots في 20-25 ململغ -1، التسمية ، فلاش تجميد في النيتروجين السائل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين عينات البروتين المنقى مسبقا على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتنقية البروتين على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC).
    13. تناول اليكوت البروتيني (20 ملغ) والطرد المركزي الدقيق عند 10,000 × غرام لمدة 10 دقائق لإزالة المجاميع قبل لجنة الأوراق المالية والبورصة.
    14. عينة تحميل على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (على سبيل المثال، HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) تعلق على كروماتوغرافيا السائل البروتين سريع بمعدل تدفق 0.5 مل دقيقة-1، سابقا متساوية في العازلة SEC (10 mM تريس-Cl، درجة الحموضة 7.8، 100 mM NaCl، 5٪ غليسيرول، 0.1 m m pyridoxal الفوسفات).
      ملاحظة: لتنقية كميات أعلى من معزولة αسانتTS أو βStTS وحدة فرعية وتقليل عدد جولات لجنة الأوراق المالية والبورصة، تحميل عينة 5 مل في 20-25 مل مل-1 على حجم استبعاد العمود الكروماتوغرافيا بمعدل تدفق 1.5 مل دقيقة-1.
    15. تقييم نوعية αسانتTS أو βسانتTS في كسر الذروة باستخدام 12٪ أو 15٪ الصوديوم دودسيل كبريتات هلام الكهربائي (SDS-PAGE)، على التوالي، ملطخة كوماسي بقعة زرقاء رائعة25.
    16. تركيز البروتين مع الطازجة 15 مل 10 كدا قطع وحدات تصفية الطرد المركزي, تحديد تركيز البروتين24, إعداد 0.5 مل aliquots في 20-25 مل مل-1, التسمية, فلاش تجميد في النيتروجين السائل, وتخزينها في -80 °C.
  4. تنقية مجمع α2β2StTS من الوحدات الفرعية α β
    ملاحظة: توازن حجم استبعاد العمود اللوني (Sephadex S-200 HR أو Superdex 200 pg) في العازلة SEC (10 mM تريس-Cl, درجة الحموضة 7.8, 100 mM NaCl, 5٪ الجلسرين, 0.1 mM بيريدوكسال فوسفات).
    1. لتنقية البرية من نوع α2β2StTS مجمع من α والوحدات الفرعية β، إذابة عينات التركيز من αسانتTS ووحدات فرعية سانت TS β في 4 درجة مئوية.
    2. الجمع بين aliquots (1.2 αسانتTS: 1.0 βنسبةالضرس سانت TS) واحتضانها في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: الزائدة من αStTS ضرورية لضمان أن معظم βسانتTS سيتم دمجها في α2β2StTS المعقدة.
    3. إزالة مجاميع البروتين عن طريق الطرد المركزي الدقيق (10000 × غرام، 10 دقائق، 4 درجات مئوية).
    4. تحميل supernatant توضيح على حجم استثناء العمود.
    5. تقييم نوعية αسانتTS أو βسانتTS في كسر الذروة باستخدام 12٪ أو 15٪ الصوديوم دودسيل كبريتات هلام الكهربائي (SDS-PAGE)، على التوالي، ملطخة كوماسي بقعة زرقاء رائعة25.
    6. تحديد تركيز البروتين24، وإعداد 250-1000 μL aliquots في 15-20 ململ -1، فلاش تجميد النيتروجين السائل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. تنقية نوع البرية أو شكل متحولة من α2β2StTS المعقدة

  1. تولد موجه من الموقع لإعداد متحولة βسانتTS
    1. استخدام بناء pEBA-10 التعبير المتجه22 كقالب الحمض النووي خلال خطوتين من تفاعل البوليميراز المتسلسل لإدخال نقطة محددة الطفرات في تسلسل البولينوكليوتيدات TS-سلسلة β.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول لإدخال طفرة نقطة واحدة في α أو β من السالمونيلا تيفيموريوم تريبتوفان synthase. لمزيد من, يجب أن تكون مصممة بشكل مناسب التمهيديات أوليغونوكليوتيد جديدة تحتوي على طفرة مرغوب فيه. في هذا العمل، يتم سرد الطفرات βQ114A، βK167T، βS377A.
    2. أداء ردود فعل PCR باستخدام أزواج من النويدات التمهيدية TS-FW-NcoI/Q114A-Rev، TS-FW-NcoI/K167T-Rev، و TS-FW-NcoI/S377A-Rev لتوليد شظايا A1 و B1 و C1 على التوالي.
      ملاحظة: أوليغونوكليوتيد TS-NcoI-FW و TS-SacI-Rev، على التوالي، صلصلات في المنبع والمصب من تسلسل البولينوكليوتيدات سانتTS المستنسخة في ناقلات pEBA-10.
      1. استخدم بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (على سبيل المثال، فوسيون) وبروتوكول الشركة المصنعة لتضخيم تسلسل الحمض النووي. لتفاعل PCR 50 ميكرولتر، أضف 34 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكليز، 10 ميكرولتر من العازلة رد فعل 5x، 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي، 1 ميكرولتر من الحمض النووي قالب (200 نانوغرام)، 1.5 ميكروغرام من DMSO، 0.5 ميكروغرام من بوليمرات الحمض النووي.
      2. بالنسبة لبرنامج PCR، استخدم بداية ساخنة (180 ثانية عند 98 درجة مئوية) تليها 30 دورة تضخيم (30 ثانية عند 98 درجة مئوية، و30 ثانية عند 55 درجة مئوية و120 ثانية عند 72 درجة مئوية)، وتمديد نهائي (300 ثانية عند 72 درجة مئوية).
        ملاحظة: تم اتباع جميع خطوات البيولوجيا الجزيئية كما هو موضح في الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبر23. في حين أن تسلسل صغير يتوافق مع موقع تقييد، تسلسل جريئة وم المائل يتوافق مع طفرة.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'C AGA GGC GAC مجلس التعاون الخليجي GTG CGC GGC مجلس التعاون الخليجي GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'C TTT ATC TCC GCG مجلس التعاون الخليجي AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. أداء ردود فعل PCR باستخدام أزواج من النويدات التمهيدية TS-Rev-SacI/Q114A-FF، TS-Rev-SacI/K167T-FF، و TS-Rev-SacI/S377A-FF لتوليد شظايا A2 و B2 و C2 على التوالي.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC مجلس التعاون الخليجي GGT GCG CAC GGC GTC دول مجلس التعاون الخليجي TCT G-3 '
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT مجلس التعاون الخليجي TGT AAC GAG-3 '
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الأجزاء الجزئية بشكل فردي. استخدام درجة حرارة ذوبان 55 درجة مئوية وفترة تمديد البوليميراز من 2 دقيقة.
    5. لتنفيذ الجولة الثانية من ردود الفعل PCR، تحميل المنتج PCR أعلاه على هلام agarose 0.8٪ على TAE 1x في 6 V / سم وخلاصة هلام وهلام تنقية شظايا الفائدة.
      1. مزيج شظايا A1/A2، B1/B2، و C1/C2 بشكل منفصل في كميات متساوية، والحرارة denature الخليط لمدة 10 دقيقة في 96 درجة مئوية، والعلوي في 25 درجة مئوية. تمديد خيوط المؤتلف مع بوليمرات عالية الدقة وديوكسيريبونوكليوتيدات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    6. لتوليد عدد كبير من نسخة كاملة من جزء الحمض النووي متحولة طول، إضافة أوليغو التمهيديات TS-FW-NcoI و TS-Rev-SacI لإجراء PCR الثاني.
    7. تحميل PCR المنتج على 0.8٪ agarose في 1x TAE العازلة في 6 V / سم، هلام استخراج الفرقة الحمض النووي من الفائدة، هلام تنقية جزء PCR، والمضي قدما في الهضم تقييد المناسبة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية بعد العازلة المناسبة والشروط التي أوصت بها الشركة المصنعة.
      1. هضم ما لا يقل عن 200 نانوغرام من كل جزء من الحمض النووي مع الإنزيمات تقييد المناسبة والظروف الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية. لإعداد 50 ميكرولتر تقييد رد فعل الهضم إضافة 34 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكليز، 10 ميكرولتر من الحمض النووي (200 نانوغرام)، 5 ميكرولتر من العازلة رد فعل 10x، 0.5 ميكروغرام من تقييد الانزيم 1، و 0.5 ميكرولتر من تقييد الانزيم 2. تحميل منتجات الهضم على 0.8٪ agarose في العازلة TAE 1x في 6 V / سم وتنقية جزء PCR هضمها.
    8. خلاصة 200 نانوغرام من بناء pEBA-10 مع تقييد الانزيمات NcoI وساكI بعد توصية الشركة المصنعة. تحميل المنتج الهضم على هلام agarose 0.8٪ في العازلة TAE 1x في 6 V /cm، استئصال مراسل الفرقة إلى ناقلات، وهلام تنقية ناقلات هضمها.
    9. Ligate 100 نانوغرام من ناقلات مع 50 نانوغرام من جزء PCR، هضمها سابقا وتنقيتها، مع T4 الحمض النووي ليغانيس لمدة 2 ساعة في 25 درجة مئوية. تحويل البلازميد شيدت إلى خلايا المختصة E. القولونية سلالة خلايا DH10B. لوحات الخلايا على لوحات أجار LB تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين. احتضان لوحة مقلوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    10. اختيار مستعمرة واحدة (دون أي مستعمرات الأقمار الصناعية) من كل تحويل الخلية وتفريقه في 5 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على أمبيسلين. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية. إعداد 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد فائقة النقي من كل بناء هندسي. إعداد مخزونات الجلسرين من ثقافة الخلية (بدوره تعليق الخلية في تركيز نهائي 16٪ من الجلسرين العقيم) وتخزين على المدى الطويل في -80 درجة مئوية.
    11. إجراء تسلسل الحمض النووي لتأكيد تسلسل كامل الطول ترميز α β وحدات فرعية من synthase التربتوفان. تأكد من كل طفرة فردية واحدة وتجاهل أي بناء البلازميد التي تحتوي على طفرة عشوائية غير مرغوب فيها. وترد أدناه التمهيديات أوليغونوكليوتيد المستخدمة في هذه الدراسة.
      TS-1F: 5'-أتاكاكاكتكتكاك-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3'
      ملاحظة: أوليغونوكليوتيد التمهيدي TS-1F، TS-1R، TS-2F، و TS-3F آنال على تسلسل البولينوكليوتيد من β الفرعية (رمز الانضمام GenBank: CP051286.1). التمهيديات TS-4F و TS-5F على تسلسل البولينوكليوتيد من α الفرعية (رمز الانضمام GenBank: CP053865.1).
    12. استخدام 200 نانوغرام من كل بناء البلازميد (pEBA-10-βQ114A، pEBA-10-βK167T، وpEBA-10-βS377A) لتحويل الخلايا المختصة من E. القولونية التعبير سلالة CB149، تفتقر إلى operon TRP 26. بعد تشكيل مستعمرة ناجحة، واختيار مستعمرة واحدة وتنمو الخلايا في 5 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين. الثقافة في الحاضنة البكتيرية عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إعداد مخزونات الجلسرين من ثقافة الخلية, تخزين على المدى الطويل في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور للتعبير البروتين المؤتلف.
      ملاحظة: قد تؤدي طفرة واحدة بنقطة واحدة في α أو β من السالمونيلا تيفيموريوم تريبتوفان سينثواز إلى إضعاف وظيفة الإنزيم أو انخفاض توليف L-Tryptophan في سلالة الإشريكية القولونية CB149. يرجى النظر في استخدام إما E. coli سلالة BL21 (DE) pLys-S أو روزيتا (DE3) pLys-S إذا لم يتم الكشف عن أي تعبير أو كميات أقل من المؤتلف α2β2مجمع سانتTS في هلام SDS-PAGE.
  2. التعبير عن نوع البرية وشكل متحولة من α2β2مجمع سانتTS في القولونية
    1. تنمو E. سلالة التعبير القولونية إيواء بناء مرغوب فيه في 50 مل الطازجة والعقيمة من LB المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 5 مل من ثقافة الخلية بين عشية وضحاها في 2x 1000 مل الطازجة والعقيمة من LB تحتوي على 2٪ الجلسرين بالإضافة إلى أمبيسلين (2.8 L قارورة فرنباخ). تنمو ثقافة الخلية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
    3. حث تعبير البروتين المؤتلف عندما يصل OD600 إلى 0.6-0.8 بإضافة IPTG بتركيز نهائي قدره 0.4 mM يليه حضانة عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
    4. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4000 x ز في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات الخلية مع العازلة تحلل الباردة 2 (50 mM تريس-Cl، PH 7.80، تحتوي على 100 MM NaCl، 5 م dithiothreitol، 1 MM EDTA، و 1 MM PMSF) إلى حجم نهائي من العازلة 50 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتنقية البروتين. لتخزين الخلايا، تقسيم تعليق الخلية إلى 2 × 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية المتاح والحفاظ على الكريات الخلية في -80 درجة مئوية حتى خطوة تنقية البروتين. التعبير عن شكل نوع متحولة والبرية من α2β2StTS المعقدة في مرق LB غلة 125-150 ملغ من البروتين لكل لتر. فكر في توسيع البروتوكول صعودا أو لأسفل لتلبية مطالب محددة.
  3. تنقية نوع البرية أو شكل متحولة من α2β2مجمع سانتTS
    ملاحظة: يهدف البروتوكول التالي إلى تنقية نوع البرية المؤتلف غير الموسومة أو شكل متحولة من α2β2StTS المعقدة في غضون 1 يوم، اعتمادا على مجموعة من المهارات والجهود. لتقليل وقت التنقية، عمود استبعاد حجم التوازن في العازلة قبل تنقية البروتين / التعبير. تنقية نوع البرية أو متحولة α2β2Stيتم تنفيذ مجمع TS عن طريق تنقية من خطوتين تشمل تجزئة كبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. هذا البروتوكول ينتج 60-100 ملغ من مجمع نقي من 1 لتر من LB المتوسطة.
    1. تعطيل بيليه الخلية عن طريق سونيكيشن باستخدام sonifier الرقمية مع 1/2 "القرن التحقيق (أو معدات مماثلة). أداء 20 دورات في 80٪ دورة واجب السعة على حمام الماء المثلج باستخدام نبض 10 ق و 20 ق بقية أو حتى انقطاع كامل للخلية.
    2. طرد مركزي الخلية lysate في 30،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية. أسبيرات فائقة، وضمان بيليه لا طرد من أنبوب. تصفية كسر supernatant أوضح مع مرشح 0.45 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة.
    3. تقييم الحجم الأولي للكسر الفائق الموضح. أضف ببطء كميات صغيرة من كبريتات الأمونيوم في كل مرة ، حتى يتم الوصول إلى تشبع بنسبة 20٪ (11.51 غرام / 100 مل). نفذ عملية تجزء كبريتات الأمونيوم عند 25 درجة مئوية. يحرك الحل برفق لمدة 10 دقائق ويتجنب الفقاعات.
    4. جهاز طرد مركزي عند 30,000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. نقل 20٪ كسر فائقة في قارورة نظيفة. إعادة إنفاق بلطف 20٪ بيليه كسر في 20 مل من عينة العازلة 2 (50 mM تريس-Cl, pH 7.80, تحتوي على 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, و 2 mM dithiothreitol) وإعداد عينة لتشغيل هلام SDS-PAGE. تجاهل 20٪ بيليه كسر.
    5. تقييم الحجم الأولي للكسر الفائق 20٪. إضافة كبريتات الأمونيوم إلى 30٪ يتم التوصل إلى التشبع (5.94 غرام / 100 مل)، حل اثارة، وتجنب فقاعات، والطرد المركزي كما كان من قبل. نقل 30٪ كسر فائقة في قارورة نظيفة. بلطف resuspend 30٪ بيليه كسر في 20 مل من عينة العازلة 2 وإعداد عينة لتشغيل هلام SDS-PAGE. تجاهل كسر بيليه 30٪.
    6. تقييم الحجم الأولي للكسر الفائق 30٪. إضافة كبريتات الأمونيوم في 40٪ يتم التوصل إلى التشبع (6.14 غرام / 100 مل), حل اثارة, تجنب فقاعات, والطرد المركزي كما كان من قبل. نقل 40٪ كسر فائقة في قارورة نظيفة. بلطف resuspend 40٪ بيليه كسر في 10 مل من عينة العازلة 2 وإعداد عينة لتشغيل هلام SDS-PAGE. تجاهل الكسر الفائق 40٪.
      ملاحظة: تقييم نوعية αβStTS المعقدة باستخدام عينات من 30٪ و 40٪ الكسور العملاقة والكريات في هلام SDS-PAGE 12٪. إذا كنت تحقق من أن أي مركب متحولة أخرى αβسانتTS هو في كسر 40٪ فائقة، والمضي قدما مع تشبع 60٪ من كبريتات الأمونيوم (13.0 غرام / 100 مل). يمكن تخزين البروتينات النقية مسبقا من α المنقى مسبقا2β2 StTS complex على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتنقية البروتين على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC).
    7. جهاز طرد دقيق عينة البروتين في 10،000 × ز، 20 دقيقة ، 4 °C وتحميل كسر فائق على HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 عمود الموارد البشرية تعلق على كروماتوغرافيا بروتين السائل بسرعة بمعدل تدفق 0.5 مل دقيقة-1, سابقا متساوية في العازلة SEC (10 mM تريس-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, 5٪ glycerol, 0.1 مليون فوسفات بيريدوكسال).
      ملاحظة: لتنقية كميات كبيرة من المجمع، قم بتحميل عينة 5 مل عند 20-25 ملل-1 على عمود HiLoad 26/600 Superdex 200 pg بمعدل تدفق 1.5 مل دقيقة-1.
    8. تقييم العينات التي تم جمعها على طول تجزئة كبريتات الأمونيوم وكسور الذروة من عمود SEC على هلام SDS-PAGE 12٪ ملطخ ببقعة زرقاء رائعة من Coomassie25.
    9. ركز النوع البري أو المتحول α2β2StTS complex مع وحدة فلتر طرد مركزي مقطوعة سعة 15 مل 100 كيلودا عن طريق الدوران عند 3000 × ز عند 4 درجات مئوية. نقل البروتين المركز إلى أنبوب 2.0 مل طازجة والمطاردات الدقيقة (10،000 × ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية) لإزالة المجاميع.
    10. تحديد تركيز البروتين24، وإعداد 0.5 مل aliquots في 20-25 ململغ -1، التسمية ، فلاش تجميد النيتروجين السائل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. الأمثل تبلور لنوع البرية وشكل متحولة من α2β2StTS المعقدة

ملاحظة: حالة التبلور الأولية α2β2مجمع سانتTS تم الإبلاغ عنها سابقا في ظروف تحتوي على 12٪ PEG 8000 و 2 mM spermine22.

  1. إعداد حلول المخزون قبل اختبارات التبلور لتحقيق استنساخ أفضل للتبلور. لإجراء دراسات هيكلية مع TS، بلورة البروتين مع Na+ أو Cs+ أيون في موقع التنسيق المعدني لمجمع bienzyme.
    1. إعداد محلول مخزون 5 مل من 200 mM spermine في الماء والحفاظ على 500 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية.
    2. إعداد 50 مل من محلول المخزون 30٪ (ث / v) PEG 8000 في الماء والحفاظ على 25 مل aliquots في 50 مل القابل للتصرف قارورة مخروطية الطرد المركزي في 25 درجة مئوية.
    3. إعداد محلول مخزون 25 مل من 1 M CsCl في الماء والحفاظ على 25 درجة مئوية.
    4. إعداد 25 مل من محلول المخزون 1 M NaCl في الماء والحفاظ على 25 درجة مئوية.
    5. إعداد 3x 50 مل حل الأسهم من 1 M bicine و titrate مع CsOH أو NaOH للحصول على حلول المخزنة مؤقتا في pH 7.6 و 7.8 و 8.0. حافظ على 25 مل من الأسعار عند 4 درجات مئوية.
  2. إذابة عينة من α2β2مجمع سانتTS (20-25 مل مل-1)على حمام جليدي.
  3. عينة من أجهزة الطرد المجهري عند 10,000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة مجاميع البروتين.
  4. نقل جزء supernatant مسح في أنبوب الطرد الدقيق نظيفة.
  5. تركيز البروتين المقدر24 وتمييع البروتين aliquots (150-200 ميكرولتر) في 15 مل مل-1 مع 50 m m bicine-CsOH أو -NaOH، درجة الحموضة 7.8 التي تحتوي على 50 mM CsCl أو NaCl. حافظ على عينة البروتين عند 25 درجة مئوية.
  6. قم بإعداد حلول الخزان 500 ميكرولتر لألواح الإسقاط الجالسة 3x 24 جيدا في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 1.5 مل. يحتوي المحلول الخزاني على 50 mM bicine-CsOH أو -NaOH و50 mM CsCl أو NaCl و PEG 8000. تختلف تركيز PEG 8000 (6-11٪) على أعمدة لوحة وتركيز الحيوانات المنوية (2-8 MM) على صفوف لوحة. تغيير رقم الحموضة المؤقت (رقم الحموضة 7.6 و 7.8 و 8.0) لكل مجموعة.
  7. كاب الأنابيب ودوامة بقوة على الأقل 10 ثانية. أنابيب الطرد المركزي في 10،000 × غرام لمدة 10 دقيقة في 25 درجة مئوية لإزالةالفقاعات. الاستغناء عن محلول التخزين المؤقت 500 ميكرولتر في كل خزان المسمى.
  8. استخدام P-10 micropipette والاستغناء عن 5 ميكرولتر من محلول البروتين في 15 مل ملغ-1 لكل قطرة يجلس جيدا. تجنب الفقاعات. إضافة 5 ميكرولتر من كل حل خزان مراسل لانخفاض البروتين. تجنب الفقاعات أثناء الاختلاط ولا ماصة صعودا وهبوطا لتجانس الخليط.
  9. الشريط لوحة مع شريط لاصق شفاف وتخزين لوحة في 25 درجة مئوية. تظهر البلورات في 2-5 أيام وتنمو إلى أبعادها الكاملة في غضون أسبوعين.

4. الأشعة السينية جمع البيانات الحيود α2β2StTS حل هيكل معقد

ملاحظة: قبل جمع بيانات حيود الأشعة السينية، قم بإعداد محلول البروتين المبرد لكل بلورة مقدما. استخدام محلول خزان محدد لإعداد 3 aliquots تحتوي على تركيزات متزايدة مند imethyl كبريت اكسيد في الحل (10، 20، و 30٪ v/v) وليجاند محددة (ق). تم العثور على ثنائي ميثيل سلفوإكسيد ليكون أفضل من مادة التبريد الجلسرين، غليكول الإيثيلين، و PEG 200-300.

  1. حصاد بلورة واحدة كبيرة باستخدام cryoloop تحت المجهر مجسمة.
  2. ماصة 2 ميكرولتر من كل محلول cryoprotectant تحتوي على محلول هطول الأمطار بالإضافة إلى تركيزات أعلى مند imethyl كبريت اكسيد وليجاند (ق) على شريحة غطاء جديد.
  3. بشكل متتابع، نقع crystal في كل قطرة والسماح للتوازن الكريستال لمدة 30 ق في حل cryoprotectant.
  4. فلاش تبريد الكريستال cryoprotected باستخدام تيار النيتروجين الغازي في -173 درجة مئوية (100 K) أو تزج في النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل في الصولجانات.
    ملاحظة: ملء ديوار رغوة مع النيتروجين السائل، قبل تبريد عفريت الكريستال، وتخزين بلورات في التخزين المبردة ديوار، وبلورات السفينة إلى السنكروترون باستخدام الشاحن الجاف.
  5. تابع عملية جمع بيانات حيود الأشعة السينية عند -173 درجةمئوية. سجل بيانات حيود الأشعة السينية باستخدام وقت التعرض 0.5-4.0 s والتذبذبات 0.5 درجة. تدوير الكريستال 180-360 درجة.
  6. معالجة صور حيود الأشعة السينية باستخدام iMosflm27 لإنشاء ملف انعكاس في مجموعة المساحة المناسبة. وعموما، تنتمي بلورات α2β2StTS إلى المجموعة الفضائية C 121 (C2).
  7. مقياس معا ملاحظات متعددة من التأملات مع سكالا28، نفذت في حزمة CCP429.
  8. حل هيكل عالية الدقة α2β2StTS المعقدة عن طريق الاستبدال الجزيئي باستخدام MolRep30 ونموذج البحث المناسب. فحص النموذج وخريطة كثافة الإلكترون في كوت31 بعد حل بنية ناجحة.
    ملاحظة: هناك العديد من الهياكل بلورات TS المودعة في بنك بيانات البروتين مع ليغاند مختلفة (ق). للحصول على خطوة بديلة جزيئية أفضل وتقليل الوقت المناسب للهيكل البلوري الأحدث ، استخدم أفضل نموذج بحث يحتوي على ligand (ق) من الاهتمام. المضي قدما في صقل هيكل الكريستال في CCP429،30 أو فينيكس31.
  9. إجراء تعديلات يدوية على النموذج باستخدام كوت32، تليها تلقائيا الصقل مع Refmac29،33 أو phenix.refine31،34. بناء وصقل النموذج النهائي من خلال تشغيل جولات متكررة من بناء نموذج في كوت32 والصقل الآلي.
  10. المضي قدما في تنسيق وهيكل العوامل ترسب في موقع بنك بيانات البروتين على شبكة الإنترنت.

النتائج

تنقية α- و β-subunits من synthase التربتوفان
α-subunit(αStTS) و β-subunit (βسانتTS) من السالمونيلا تيفيموريوم التربتوفان synthase كانت subcloned في ناقلات سومو pET المعدلة. الشكل 1A يظهر ممثل SDS-PAGE نتائج اثنين من العصابات القوي...

Discussion

لقد نجحنا في هندسة شكل متحول α2β2 βQ114A ، α2β2 βK167T ، وα 2β2 βS377A StTS لدراسات الارتباط بين الهيكل والوظيفة. في البداية ، حاولنا تنقية المسوخ باستخدام بروتوكول تنقية سابق22، والذي يتطلب α2β2 StTSتبلور معقد مع PEG 8000 والحيوانات المن?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه ولا يعلنان عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للصحة في الولايات المتحدة (GM097569).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL 10 kDa filterMilliporeSigmaUFC901024centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filterMilliporeSigmaUFC910024centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vialsCorningCLS430489Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-141microcentrifuge tubes
24-well Cryschem PlateHampton ResearchHR3-15824-well sitting drop plates
2-mercaptoethanolFisher ScientificO3446I-100Chemical
50 mL centrifuge conical tubesThermo Scientific12-565-270centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET BasicFisher Scientific13-636-AB15pH meter
AgaroseFisher ScientificBP1356-100Agarose gel
ammonium sulfateFisher ScientificA702-500Chemical
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5Antibiotic
Bacterial incubatorFisher ScientificS35836incubator.
BamHINew England BiolabsR0136SRestriction enzyme
bicineFisher ScientificBP2646100Chemical
Branson 450 Digital SonifierBrasonB450Cell disruptor
Cesium chlorideFisher ScientificBP210-100Chemical
Cesium hydroxideAcros OrganicsAC213601000Chemical
ChloramphenicolFisher ScientificBP904-100Antibiotic
dimethyl sulfoxideFisher ScientificD1391Chemical
dithiothreitolFisher ScientificBP172-5Chemical
DNA PolymeraseThermo ScientificF530SHF polymerase
dNTP SetInvitrogen10-297-018dNTPs set
EcoRINew England BiolabsR0101SRestriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acidFisher ScientificS311-100Chemical
Excella E25R Orbital ShakerEppendorf New BrunswickM1353-0004Orbital incubator
GE AKTA Prime PlusGE Healthcare8149-30-0004FPLC
Gel Extraction KitInvitrogenK210012DNA purification kit
GlycerolFisher ScientificG33-500Chemical
HindIIINew England BiolabsR0104SRestriction enzyme
His-Trap columnsGE HealthcareGE17-5255-015 mL Histrap column
imidazoleFisher ScientificO3196-500Chemical
IPTGThermo Fisher ScientificR0392Inducer
KanamycinFisher ScientificBP906-5Antibiotic
Kelvinator Series-100KelvinatordiscontinuedUltra low freezer
LB brothFisher ScientificBP1426-500Liquid broth
Luria Bertani agarFisher ScientificBP1425-2Solid broth
NaClFisher ScientificS271-500Chemical
NcoINew England BiolabsR0193SRestriction enzyme
Ni-NTA affinity beadsThermo Fisher ScientificR90115Ni-NTA agarose beads
PEG 8000Fisher ScientificBP233-100Chemical
phenylmethylsulfonyl fluorideFisher Scientific44-865-0Chemical
pyridoxal phosphateAcros OrganicsAC228170010Chemical
S-200 HRCytiva45-000-196Size exclusion column
SacINew England BiolabsR0156SRestriction enzyme
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100Chemical
Sorvall RC-5B centrifugeSorvall8327-30-1004Floor cetrifuge
SpermineAcros OrganicsAC132750010Chemical
Superdex 200 prep gradeCytiva45-002-491Size exclusion column
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202SDNA liagse
TrisFisher ScientificBP152-500Chemical
Ubl-specific protease 1Thermo Scientific12588018SUMO Protease

References

  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
  3. Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
  4. Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
  5. Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
  6. Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
  7. Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
  8. Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
  9. Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
  10. Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
  11. Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
  12. Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
  13. Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
  14. Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
  15. Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
  16. Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
  17. Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
  18. Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
  19. Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
  20. Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
  21. Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
  22. Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
  24. Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
  27. Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, 271-281 (2011).
  28. Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 72-82 (2006).
  29. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  30. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 213-221 (2010).
  32. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 486-501 (2010).
  33. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, 240-255 (1997).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, 352-367 (2012).
  35. Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
  36. Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved