JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, Salmonella tiphimurium triptofan sintazının ekspresyonu ve saflaştırılması için bir dizi ardışık yöntem sunar, bu protokol protein kompleksini bir günde arındırmak için hızlı bir sistemdir. Kapsanan yöntemler escherichia coliprotein ekspresyözü, benzeşim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi ve kristalizasyondur.

Özet

Salmonella tiphimurium'dan triptofan sintaz (TS) bienzim kompleksi (α2β2 TS) ile yapılan yapısal çalışmalar, katalitik mekanizmasını, allosterik davranışını ve PLP'ye bağımlı enzimlerde substratın ürüne enzimatik dönüşümünün ayrıntılarını daha iyi anlamak için gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, yalıtılmış α ve yalıtılmış β alt birliğini üretmek için yeni bir ifade sistemi, yüksek miktarda saf alt birim ve α2β2StTS kompleksinin izole alt birli dış birimlerden 2 gün içinde arındırılmasına izin etti. Saflaştırma, benzeşim kromatografisi ve ardından benzeşim etiketinin bölünmesi, amonyum sülfat çökeltme ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile gerçekleştirildi. Enzim β-sitedeki anahtar kalıntılarının rolünü daha iyi anlamak için, önceki yapısal çalışmalarda bölgeye doğrudan mutajensis yapıldı. Vahşi tip ve mutant α2β2StTS kompleksini arındırmak için başka bir protokol oluşturuldu. Amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve SEC kullanılarak basit, hızlı ve verimli bir protokol, α2β2StTS kompleksinin tek bir günde arındırılmasına izin sağladı. Bu çalışmada açıklanan her iki saflaştırma protokolü, saflaştırma protokolü boyunca α2β2StTS kompleksini kristalize etmek için PEG 8000 ve spermin kullanarak aynı kompleksi arındırmak için önceki protokollerle karşılaştırıldığında önemli avantajlara sahiptir. Vahşi tip ve bazı mutant formlarının kristalleşmesi, peg 8000 ve spermin kullanarak bazı mutantların saflaşmasını bozan biraz farklı koşullar altında gerçekleşir. X-ışını kristalografik çalışmalarına uygun kristalleri hazırlamak için kristalizasyon, kristal kalitesi ve kriyoproteksiyonu optimize etmek için çeşitli çabalar sarfedildi. Burada sunulan yöntemler genellikle triptofan sintaz alt biraları ve vahşi tip ve mutant α2β2StTS komplekslerinin saflaştırılması için uygulanmalıdır.

Giriş

Triptofan sintaz (TS) bienza kompleksi (α2β2),bakteri, bitki ve mantarlarda L-Triptofan amino asidinin biyosentezinde son iki adımı katalizleyen allosterik birenzimdir. Salmonella enterica serovar typhimurium (St) bakterisi insanlarda ve diğer hayvanlarda ciddi bir gastrointestinal enfeksiyona neden olur. İnsanlarda ve daha yüksek hayvanlarda TS (EC 4.2.1.20) olmadığından, S'nin inhibisyonu. tifüs α2β2 TS kompleksi (α2β2StTS) kriptosporidiosis ve tüberküloz tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olarak araştırılmıştır4, genital ve oküler enfeksiyonlar5ve tarımda potansiyel herbisit kullanımı için6. α-alt birimi, GAP ve indole3,6'yıüretmek için bir indolenine tautomer ara ve daha sonra karbon-karbon bağı bölünmesinin oluşumu yoluyla, gliseraldehit-3-fosfat (GAP) ve indole'ye kadar olan aldolitik bölünmeyi kataliz eder. β katalitik alan, β-Lys87'ye bir Schiff tabanı aracılığıyla bağlı bir piridoksial 5′-fosfat (PLP) kofaktör molekülü içerir, bu da enzim β-alt biradaki reaksiyonlar sırasında bir elektron lavabosu olarak işlev β3,7. β alanı, L-Serine yan zincir hidroksilinin L-Triptofan ve PLP'ye bağımlı reaksiyonda bir su molekülü vermek için hintkenede değiştirilmesini katalİze eder. St TS, çok enzimli kompleksler içinde substrat kanal ve allosterik iletişimin araştırılması için uzun süredir devam eden bir model olarak hizmet vermektedir2,3. L-Triptofan sentezi sırasında katalitik adımları senkronize etmek ve indole salınımını önlemek için TS'nin α ve β alt biraları arasındaki çift yönlü allosterik iletişim3. Bu çabayı genişletmek için, StTS β-subunit'in katalitik bölgesinde enzim yapısı, mekanizması ve fonksiyonu arasındaki ilişkinin daha fazla araştırılmasında kullanılmak üzere tek nokta mutasyonu ile birkaç mutant (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr ve β-Ser377Ala) hazırladık.

Edith W. Miles araştırma grubu tarafındanα 2β2StTS'nin katalitik mekanizması hakkında detaylı araştırma başlatılmıştır. Yerli Escherichia coli α2β2 TS kompleksi ile yapılan ilkçalışmalar,yalıtılmış α-alt bira 8 ,9, izole β-alt bira 10,11ve α 2 β 2TS kompleksinin yalıtılmış alt birelerden arındırılmasına ve karakterizasyonuna odaklanmıştır12. Saflaştırma, amonyum sülfat çökeltme, örnek diyaliz, DEAE-Sephadex kromatografisi, diyaliz ve DEAE-Sephadex sütun12üzerinde ikinci bir kromatografik yuvarlak ile gerçekleştirildi. Başka bir protokolde, aynı kompleksin saflaştırılması, netleştirilmiş hücre lisatının bir DEAE-Sephadex sütununa yüklenmesi ve ardından Sepharose 4B sütununa kromatografik bir adım, amonyum sülfat çökeltme ve diyaliz13. Her iki saflaştırma protokolü de 4-5 gün sürer. Escherichia coli α2β2 TS kompleksi kristalize edildi, ancak kristaller o zaman X-ışını kırınımı için uygun değildi.

Yeni bir çalışmada, S. typhimurium α 2 β2TS kompleksinin rekombinant ve vahşi tip formları saflaştırıldı ve kristalize edildi14,15. Rekombinant α2β2StTS kompleksi, pEBA-10 ifade vektörü taşıyan E. coli strain CB149'da aşırı ifade edildi. α2β 2StTS kompleksinin ilk kristalizasyonu veX-ışınıkırınım verisi toplanması ve analizi14bildirilmiştir. Bununla birlikte, α2β2StTS kristalleri gibi uzun ve ince iğne yapısal çalışmaları bozmuşlardır. Daha iyi X-ışını kırınım verileri toplamak amacıyla, α 2 β 2StTS kompleksi15'invahşi tipini ve mutant formlarını arındırmak için başka bir saflaştırma protokolü tanımlanmıştır. Temizleme, netleştirilmiş hücre lisatına spermin ve PEG 8.000 kullanılarak ilk çökeltme ile gerçekleştirildi ve santrifüjleme ile büyük bir hacimli çökelti çıkarıldı. Yüksek miktarda α içeren süpernatant fraksiyon2β2StTS kompleksi, sarı kristaller çökene kadar 4 °C'de 16-48 saat boyunca depolandı. Kristaller yıkandı ve farklı tamponlara karşı yoğun bir şekilde çaprazlandı. Protein kompleksi amonyum sülfat içeren tamponda rekristalite edildi ve15. Protein kristalizasyonu çözeltideki protein ve çökelti konsantrasyonlarına bağlı olsa da, çözeltideki diğer mutant formları için saflaştırmayı izlemek, tahmin etmek ve çoğaltmak α2β2StTS kompleksinin çözeltisinde. Bu protokol, herhangi bir kromatografik yöntem kullanmaması avantajına sahiptir; bununla birlikte, dezavantajları, tipik olarak 5-7 gün gerektiren kristalize etmek, dialyze etmek ve recrystallize etmek için gerekli olan uzun saflaştırma süresidir. X-ışını veri toplama için uygun kristaller elde etmek, 600'den fazla kristalizasyon koşulu protein konsantrasyonu, sıcaklık, çökeltiler (PEG 4.000, 6.000 ve 8.000) ve katkı maddeleri (CaCl 2 , MnCl2, ZnCl2, kadavra, putrescine, spermin veya spermidin) kombinasyonu ve varyasyonu kullanılarak değerlendirildi15. Kristaller daha iyi bir kristal formuna sahipti ve% 12 PEG 8.000 ve 2 mM spermin içeren koşullarda daha hızlı büyüdü. Kristalizasyon 4, 30 veya 42 ° C yerine 25 ° C'de daha elverişliydi ve 3 gün içinde maksimum boyutlara büyüdü15. O dönemde(1996-β1999) 16 , 17 , 18 , 19,20,21ve daha birçok yapının yayınlandıkları α bildirilmiştir.

Burada temel amaç triptofan sintazını arındırmak ve protein kristalizasyonunu optimize etmek için alternatif protokoller sunmaktır. Mevcut çalışma, yalıtılmış β-alt birliğini (β St TS), 2 β 2StTS kompleksini yalıtılmış alt birelerden yeniden oluşturan αalt birliğini (α αStTS), α2β2StTS kompleksinin vahşi tip ve mutant formlarını arındırmak için önemli iyileştirmelergöstermektedir. Arınma süresi önemli ölçüde azaltıldığı ve kristalizasyon ve kriyoproteksiyon optimize edildiğinden, geçmiş protokollere göre avantajlar önemli ölçüdedir. Bu çalışmada tasarlanan α2β2StTS kompleksinin mutant formları, vahşi tip formu için kullanılan durumun yakınında kristalleşmiştir. Bununla birlikte, atomik çözünürlüğe yakın yapı belirleme için yeterli kalitede büyük tek kristaller elde etmek için ince kristalizasyon optimizasyonu gerekliydi. Bugüne kadar Protein Veri Bankası'nda (PDB) bakteri, arkea ve ökaryot için sırasıyla 101, 31 ve 2 kristal yapıyı oluşturan 134 triptofan sintaz kristal yapısı bulunmaktadır. Güzel bir şekilde, 73 yapı S. enterica serovar typhimurium'a aittir ve α 2 β2StTS kompleksinin5kristal yapısı 1.50 Angstrom'dan daha yüksek çözünürlük sınırlarına sahiptir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırma grubumuzda 5'te 4'ü hazırlandı (PDB IDs:5CGQ 1.18 Å'da, 4HT3 1.30 Å'da, 4HPJ 1.45 Å'da, 6DZ4 1.45 şçözünürlükte). α2β2StTS kompleksinin mutant formunun rafine kristal yapılarının, L-Triptofan sentezinde yer alan esansiyel amino asit kalıntılarının oynadığı mekanizma ve roller hakkında yeni içgörüler sağlaması beklenmektedir.

Protokol

1. α ve β alt birliğini ve yeniden birlenenα 2β2StTS kompleksini arındırmak için hızlı protokol

  1. pETSUMO ifade vektörüne DNA alt kavunu
    1. pEBA-10 ekspresyon vektörü22'deklonlanmış Salmonella enterica serovar typhimurium bakterisinden triptofan sintazının αkodlayan çevirisel kavrama genini (trpA ve trpB) ve β-alt biralarını elde edin. DNA şablonu olarak pEBA-10 vektörü kullanın.
      NOT: Alternatif olarak, aşağıda listelenen astarlar Salmonella enterica serovar tiphimurium genomundan her iki geni de yükseltmek için kullanılabilir. Moleküler Klonlama: Laboratuvar Kılavuzu23'teaçıklandığı gibi tüm moleküler biyoloji adımları izlendi.
    2. StTS-FW-Bam veα astarlarla α-subunit 'in (αStTS) tamuzunlukta polinükleotid dizisini tek tek yükseltmek içinpolimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanın St TS-Rev-Eco veStTS-FW-Bam ve βStTS-Rev-Hind β astarları ile β -subunit (βStTS) tam uzunlukta dizilimi α. Yaklaşık 55 °C'lik bir erime sıcaklığı ve 2 dakikalık bir polimeraz uzatma süresi kullanın.
      1. DNA dizilerini güçlendirmek için yüksek kaliteli DNA polimerazını (örneğin Phusion) ve üreticinin protokolünü kullanın. 50 μL PCR reaksiyonu için 34 μL çekirdeksiz su ekleyin, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 μM ileri astar, 1 μL 10 μM ters astar, 1 μL Şablon DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL Phusion DNA polimeraz.
      2. PCR programı için sıcak bir başlangıç (98 °C'de 180 saniye) ve ardından 30 amplifikasyon döngüsü (98 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 120 saniye) ve son uzatma (72 °C'de 300 saniye) kullanın.
        NOT: Italik diziler sırasıyla BamHI, EcoRI, BamHI ve HindIII kısıtlama sitelerine karşılık gelir. PCR parçalarının terminine yakın enzim bölünme verimliliği ekstra bazlar (küçük harf dizileri) eklenerek geliştirilmiştir.
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCCCTC-3′
    3. PCR ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA) %0,8 agarose jel üzerine yükleyin, jel ilgi çekici DNA bandını çıkarın ve jel, üreticiden gelen talimatları izleyerek bir silika boncuk kiti kullanarak PCR parçasını arındırır.
      1. Her DNA parçasının en az 200 ng'sini, üretici tarafından 37 °C'de 2 saat boyunca önerilen uygun kısıtlama enzimleri ve koşulları ile sindirin.
      2. 50 μL kısıtlama sindirim reaksiyonu kurmak için 34 μL çekirdeksiz su, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,5 μL kısıtlama enzimi 1 ve 0,5 μL kısıtlama enzimi 2 ekleyin.
      3. Sindirim ürününü 6 V/cm'de 1x TAE'ye% 0,8 agarose jel üzerine yükleyin, jel özü ve jel, sindirilen parçayı ticari bir kit kullanarak arındırın.
    4. Her parçayı ayrı ayrı E. coli ekspresyonuna altklam, daha önce uygun enzimler ve jel saflaştırılmış ile sindirilen vektör pET SUMO'su modifiye etti.
      NOT: Bu vektör ticari pET SUMO'nun değiştirilmiş bir sürümüdür. Bu vektör kısıtlama enzim klonlama için optimize edilmiştir. pET28b vektörün çoklu klonlama bölgesi (MCS)(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI ve XhoI) pET SUMO klonlama bölgesine eklenmiştir. Bu vektör, Small Ubiquitin benzeri Değiştirici proteini (SUMO) ve birden fazla klonlama bölgesi ile çerçevede bir N-terminal 6x-Histidin etiketi içerir.
    5. 25 °C'de 2 saat boyunca T4 DNA ligaz ile 100 ng modifiye pET SUMO ve 50 ng PCR parçası ligate.
    6. İnşa edilen plazmidi E. coli strain DH10B α hücrelerinin yetkinhücrelerine dönüştürün. LB agar plakalarında 35 μg/mL kanamycin içeren plaka hücreleri. Plakayı 37 °C'de bir gecede inkübte edin.
    7. Her dönüşümden tek bir koloni seçin, ultra saf plazmid DNA hazırlayın ve αStTS veya βStTS'nin N-terminal His6-SUMO etiketiyle çerçeve halinde klonlandığını doğrulamak için DNA dizilemesi gerçekleştirin.
      NOT: Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın (hücre süspansiyonu% 16 nihai steril gliserol konsantrasyonunda çevirin) ve -80 ° C'de uzun süre saklayın.
    8. Plazmid SUMO-αStTS veya SUMO-βStTS ekspresyonunu ayrı ayrı T7 promotör tabanlı bir sistemle E. coli expression strain Rosetta (DE3) pLysS'in yetkin hücrelerine dönüştürün. 35 μg/mL kanamycin ve kloramfenikol içeren Luria Bertani (LB) agar plakalarındaki rekombinant hücreleri plakalayın. Plakayı 37 °C'de bir gecede inkübte edin.
    9. Başarılı koloni oluşumundan sonra, tek bir koloni seçin (herhangi bir uydu kolonisi olmadan) ve her iki antibiyotikle 5 mL LB ortamına dağıtın. Kültür hücreleri gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak.
      NOT: Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın, -80 °C'de uzun süreli depolayın veya hemen rekombinant protein ekspresyoyu için kullanın.
  2. SUMO-αStTS ve SUMO-βStTS alt birliklerinin ifadesi
    1. SUMO- α St TS veya SUMO-βStTS'yi barındıran taze E. coli suşu Rosetta(DE3) pLysS hücrelerini aşılayın, donmuş gliserol stoğunun bir kısmını 35 μg/ mL kanamycin ve kloramfenikol içeren 50 mL LB kültürüne inşa eder veya kazır. 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak hücreleri bir gecede büyütün.
    2. Ertesi sabah, %2 gliserol artı kanamycin ve kloramfenikol (2,8 L Fernbach matarası) içeren taze ve steril 2x 1000 mL LB'de gece hücre kültürünün 5 mL'sini aşıla. 37 °C'de 200 rpm'de titreme ile hücre kültürünü büyütün.
      NOT: LB suyunda SUMO-αStTS veya SUMO-βStTS ifadesi litre başına 125-150 mg etiketli protein verir. Belirli talepleri yerine getirmek için iletişim kuralını yukarı veya aşağı ölçeklendirmeyi düşünün.
    3. OD600, 0.4 mM'lik son konsantrasyonda izopropil β-D-1 tiyogalactopyranoside (IPTG) ilavesiyle 0.6-0.8'e ulaştığında rekombinant protein ekspresyonunu teşvik edin ve ardından 200 rpm'de sallanarak bir gecede 30 °C'de inkübasyon.
    4. Hücreleri 20 dakika boyunca 4 °C'de 4.000 x g'da santrifüjleme yaparak hasat edin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini soğuk lizis tamponu 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, % 5 gliserol, 10 mM 2-mercaptoethanol ve 40 mM imidazol-Cl) içeren 60 mL'lik son hacme kadar yeniden askıya alın.
      NOT: Hücreler -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya protein saflaştırma için hemen kullanılabilir. Hücreleri saklamak için hücre süspansiyonu 2 x 50 mL tek kullanımlık santrifüj konik tüplere bölün ve hücre peletlerini protein saflaştırma adımına kadar -80 °C'de tutun.
  3. Arınma α- ve triptofan sinthase β alt biraları
    NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm prosedürler 4 °C'de yapılmalıdır. Saflaştırma süresini azaltmak için, protein saflaştırmadan önce veya rekombinant protein ekspresyonu sırasında ni-NTA agarose nikel yüklü benzeşim sütunlarını ve boyut dışlama sütununu tamponda dengeler.
    1. 1/2" Boynuz probu (veya benzer bir ekipman) ile dijital bir sonifier kullanarak sonication ile hücre peletlerini bozın. 10 s darbe ve 20 s dinlenme kullanarak veya tam hücre bozulmasına kadar buzlu su banyosunda% 80 genlik görev döngüsünde 20 döngü gerçekleştirin.
    2. Hücre lisatını 30 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüj edin. Peletin tüpten yerinden sapmamasını sağlayarak süpernatantı aspire edin. Süpernatantı buz üzerinde 0,45 μm filtre ünitesi ile filtreleyin ve liziz tamponu 1'de önceden dengelenmiş 15 mL Ni-NTA agarose nikel yüklü benzeşim sütunundan geçirin.
      NOT: Her Ni-NTA agarose sütunu SUMO- αStTS veya SUMO-βStTS rekombinant proteini saflaştırmak için kullanılacaktır. Saflaştırma, hızlı proteinli sıvı kromatografi sistemine bağlı 2x 5 mL Ni-NiTA kolonunda yapılabilir. Her seferinde bir proteini arındırır.
    3. Ni-NTA agarose sütununu 100 mL lizis tamponu 1'de yıkayın.
    4. E1 tamponu (25 mM Tris-Cl tampon, pH 7.8, 200 mM NaCl, %5 gliserol ve 400 mM imidazol-Cl) içeren 80 mL tek adımlı bir elution ile devam edin.
      NOT: SUMO-proteaz 300 mM imidazol tolere eder ve santrifüj filtre cihazlarının zarı 100 mM imidazol tolere eder. Yüksek miktarda iimidazol çıkarmak ve saflaştırma süresini azaltmak için amonyum sülfat yağışı yapmanızı öneririz, bunun yerine protein örneğini seyreltin ve protein konsantrasyonu ile zaman kaybedin.
    5. Süpernatant kesirinin başlangıç hacmini değerlendirin. 25 °C'de %60 doygunluğa (39,48 g/ 100 mL) ulaşılana kadar bir seferde yavaşça az miktarda amonyum sülfat ekleyin. Çözeltiyi 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının. 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj.
    6. Üst kısmı dikkatlice epire edin ve atın. Pelet fraksiyonunu 20 mL numune tamponunda (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300 mM NaCl ve% 5 gliserol) yeniden biriktirin.
    7. SUMO-proteazlı His-SUMO etiketli dekolte için Saccharomyces cerevisiae'den Ubl'ye özgü proteaz 1'in rekombinant parçasını 1:1000 oranında ekleyin ve karışımı 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
    8. Numuneyi bir benzeşim kromatografi kolonundan yüklemeden önce protein agregalarını çıkarmak için sindirim ürününü 25 °C'de 10.000 x g'da santrifüjlayın.
    9. Daha önce lizis tamponu 1'de dengelenmiş 15 mL Ni-NTA agarose sütununda 20 mL resüspended örneği geçiren His6-SUMO etiketinin izlerini kaldırın.
    10. Etiketlenmemişα St TS veya βStTS içeren geçiş örneğini toplayın.
    11. St TS veyaβ StTS etiketlenmemiş artıkları toplamak için Ni-NTA sütununu 20 mL tampon1'α yıkayın.
    12. 4 °C'de 3.000 x g'da dönerek her alt birimi 15 mL 10 kDa kesme santrifüj filtre ünitesi ile ayrı ayrı konsantre edin. Konsantre proteini agregaları çıkarmak için taze bir 2,0 mL tüpe ve mikrosantrifüje (10.000 x g, 10 dk, 4 °C) aktarın. Protein konsantrasyonu24'übelirleyin, 20-25 mg mL-1'de 1mL aliquots hazırlayın, etiket, sıvı nitrojende flaş dondurma ve -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Önceden saflaştırılmış protein örnekleri -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya bir boyut dışlama kromatografi kolonunda (SEC) protein saflaştırma için hemen kullanılabilir.
    13. Sec'den önceki agregaları çıkarmak için 10 dakika boyunca 10.000 x g'da bir protein aliquot (20 mg) ve mikrosantrifüj alın.
    14. Örnek, daha önce SEC tamponunda (10 mM Tris-Cl, 10 mM Tris-Cl) daha önce dengelenmiş 0,5 mL min-1akış hızında hızlı protein sıvı kromatografisine bağlı bir boyut dışlama kromatografi sütununa (örneğin, HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) yükleyin. pH 7.8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0.1 mM piridoksial fosfat).
      NOT:StTS veya βStTS alt birliğini daha yüksek miktarlarda yalıtılmış α arındırmak ve SEC turlarının sayısını azaltmak için, 20-25 mg mL-1'de 5 mL'lik bir örneği 1,5 mL min-1akış hızında bir boyut dışlama kromatografi sütununa yükleyin.
    15. Sırasıyla, Coomassie parlak mavi lekesi ile boyanmış% 12 veya% 15 sodyum dodecyl sülfat-jel elektroforez (SDS-PAGE) kullanarak tepe fraksiyonunda StTSveya βStTS α kalitesini değerlendirin25.
    16. Proteini taze 15 mL 10 kDa kesme santrifüj filtre üniteleri ile konsantre edin, protein konsantrasyonu24'übelirleyin, 20-25 mg mL-1'de 0,5mL aliquots hazırlayın, etiket, sıvı nitrojende flash-freeze yapın ve -80 ° C'de saklayın.
  4. α2β2StTS kompleksinin α ve β alt birilerden arındırılması
    NOT: SEC tamponunda (Sephadex S-200 HR veya Superdex 200 pg) boyut dışlama kromatografi sütununu (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0.1 mM piridoksial fosfat) dengele.
    1. Vahşi tip α2β2StTS kompleksini α ve β alt birilerden arındırmak için, α St TS ve βStTS altbiritelerinin konsantre örneklerini 4 °C'de çözün.
    2. Aliquots (1.2 αStTS: 1.0 βStTS molar oranı) ve 1 saat boyunca 4 °C'de inkübe edilmiş birleştirin.
      NOT: Β St TS'nin çoğunun α2β 2StTS kompleksine dahil edileceğini sağlamak içinαStTSfazlalığı gereklidir.
    3. Protein agregalarını mikrosantrifüjleme ile çıkarın (10.000 x g, 10 dk, 4 °C).
    4. Netleştirilmiş süpernatantı boyut dışlama sütununa yükleyin.
    5. Sırasıyla, Coomassie parlak mavi lekesi ile boyanmış% 12 veya% 15 sodyum dodecyl sülfat-jel elektroforez (SDS-PAGE) kullanarak tepe fraksiyonunda StTSveya βStTS α kalitesini değerlendirin25.
    6. Protein konsantrasyonu24'übelirleyin, 15-20 mg mL -1'de 250-1000μLaliquots hazırlayın, sıvı nitrojende flaş dondurun ve -80 °C'de saklayın.

2. α2β2StTS kompleksinin vahşi tipinin veya mutant formunun saflaştırılması

  1. StTS'β mutant hazırlamak için mektağa yönelik mutajensis
    1. βzincirli TS polinükleotid dizisinde belirli nokta mutasyonlarını tanıtmak için iki adımlı polimeraz zincir reaksiyonu sırasında DNA şablonu olarak yapı pEBA-10 ekspresyon vektörü22'yi kullanın.
      NOT: Bu protokol, Salmonella tiphimurium triptofan sintazından α veya β-alt bireyde tek nokta mutasyonu tanıtmak için kullanılabilir. Ek olarak, istenen mutasyonu içeren yeni oligonükleotid astarlar uygun şekilde tasarlanmalıdır. Bu çalışmada Q114A, βK167T, βS377A βmutasyonlar listelenmiştir.
    2. Sırasıyla A1, B1 ve C1 parçaları oluşturmak için TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev ve TS-FW-NcoI/S377A-Rev çiftlerini kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
      NOT: Sırasıyla Oligonükleotid TS-NcoI-FW ve TS-SacI-Rev, pEBA-10 vektöründe klonlanmış αβ StTS polinükleotid dizisinin yukarı ve aşağı akışlarını tavlar.
      1. DNA dizilerini güçlendirmek için yüksek kaliteli DNA polimerazını (örneğin Phusion) ve üreticinin protokolünü kullanın. 50 μL PCR reaksiyonu için 34 μL çekirdeksiz su ekleyin, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 μM ileri astar, 1 μL 10 μM ters astar, 1 μL Şablon DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL DNA polimeraz.
      2. PCR programı için sıcak bir başlangıç (98 °C'de 180 saniye) ve ardından 30 amplifikasyon döngüsü (98 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 120 saniye) ve son uzatma (72°C'de 300 saniye) kullanın.
        NOT: Moleküler Klonlama: Laboratuvar Kılavuzu23'teaçıklandığı gibi tüm moleküler biyoloji adımları izlendi. Küçük harf dizisi bir kısıtlama bölgesine karşılık gelirken, kalın ve italik bir dizi bir mutasyona karşılık gelir.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Sırasıyla A2, B2 ve C2 parçaları oluşturmak için TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF ve TS-Rev-SacI/S377A-FF çiftlerini kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Kısmi parçaları ayrı ayrı yükseltmek için polimeraz zincir reaksiyonu kullanın. 55 °C erime sıcaklığı ve 2 dk polimeraz uzatma süresi kullanın.
    5. PCR reaksiyonlarının ikinci turunu gerçekleştirmek için, PCR ürününü 6 V / cm'de 1x TAE'ye% 0.8 agarose jel üzerine yükleyin ve jel özü ve jel ilgi parçalarını arındırır.
      1. A1/A2, B1/B2 ve C1/C2 parçalarını ayrı ayrı equimolar miktarlarda karıştırın, karışımı 96 °C'de 10 dakika ısı denatüresi ve 25 °C'de tavlama. Rekombinant iplikçikleri üreticinin protokolüne göre yüksek kaliteli bir polimeraz ve deoksiribonükleotidlerle genişletin.
    6. Tam uzunlukta mutant DNA parçasının yüksek kopya sayısını oluşturmak için, ikinci bir PCR gerçekleştirmek için Oligo primer TS-FW-NcoI ve TS-Rev-SacI ekleyin.
    7. PCR ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda% 0,8 agarose yükleyin, jel ilgi çekici DNA bandını çıkarın, jel PCR parçasını arındırın ve üretici tarafından önerilen uygun tampon ve koşulları takiben 37 ° C'de 2 saat boyunca uygun kısıtlama sindirimine devam edin.
      1. Her DNA parçasının en az 200 ng'sini, üretici tarafından 37 °C'de 2 saat boyunca önerilen uygun kısıtlama enzimleri ve koşulları ile sindirin. 50 μL kısıtlama sindirim reaksiyonu kurmak için 34 μL çekirdeksiz su, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,5 μL kısıtlama enzimi 1 ve 0,5 μL kısıtlama enzimi 2 ekleyin. Sindirim ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda %0,8 agarose üzerine yükleyin ve sindirilen PCR parçasını arındırın.
    8. Üreticinin tavsiyesine uyarak NcoI ve SacI kısıtlama enzimleri ile 200 ng pEBA-10 yapıyı sindirin. Sindirim ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda% 0,8 agarose jel üzerine yükleyin, bant muhabirini vektöre boşaltın ve jel sindirilen vektörü arındırın.
    9. 100 ng vektörü, daha önce sindirilmiş ve saflaştırılmış 50 ng PCR parçası ile 25 °C'de 2 saat boyunca T4 DNA ligaz ile ligate edin. İnşa edilen plazmidi yetkin hücrelere dönüştürün E. coli strain DH10B hücreleri. LB agar plakalarında 50 μg/mL ampisilin içeren plakahücreleri. Plakayı 37 °C'de bir gecede inkübte edin.
    10. Her hücre dönüşümünden tek bir koloni (herhangi bir uydu kolonisi olmadan) seçin ve ampisilin içeren 5 mL LB ortamına dağıtın. 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak hücreleri bir gecede büyütün. Tasarlanan her yapıdan 10 μg ultra saf plazmid DNA hazırlayın. Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın (hücre süspansiyonuna% 16 nihai steril gliserol konsantrasyonunda dönün) ve -80 ° C'de uzun süreli depolayın.
    11. Triptofan sintazının α ve β alt birimlerini kodlayan tam uzunlukta sırayı doğrulamak için DNA dizilimini gerçekleştirin. Her bir tek mutasyonu onaylayın ve istenmeyen rastgele mutasyon içeren plazmid yapıyı atın. Bu çalışmada kullanılan oligonükleotid primerler aşağıda listelenmiştir.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCATCATTG-3'
      NOT: Oligonükleotid astarları TS-1F, TS-1R, TS-2F ve TS-3F tavla, β alt birimin polinükleotid dizilimi üzerindedir (GenBank katılım kodu: CP051286.1). Astarlar TS-4F ve TS-5F tavla, α alt birimin polinükleotid dizilimi üzerindedir (GenBank katılım kodu: CP053865.1).
    12. Trp operon 26'dan yoksun E. coli expression strain CB149'un yetkin hücrelerini dönüştürmek için her plazmid yapının 200 ng'sini (pEBA-10- β Q114A, pEBA-10- β K167T ve pEBA-10-βS377A) kullanın. Başarılı koloni oluşumundan sonra, tek bir koloni seçin ve hücreleri 50 μg / mL ampisilin içeren 5 mL LB ortamında büyütün. Bir gecede 37 °C'de bakteri inkübatöründe kültür. Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın, -80 °C'de uzun süreli depolayın veya rekombinant protein ekspresyoyu için hemen kullanın.
      NOT: Salmonella tiphimurium triptofan sintazından α veya β-alt bireyde tek bir nokta mutasyonu enzim fonksiyonunu bozabilir veya E. coli strain CB149'da L-Triptofan sentezini azaltabilir. Bir SDS-PAGE jelinde 2 β 2StTS kompleksinde herhangi bir ifade veya daha düşük miktarda rekombinant tespit α E. coli strainBL21(DE)pLys-Sveya Rosetta (DE3)pLys-S kullanmayı düşünün.
  2. E. coli'deki α2β2StTS kompleksinin vahşi tip ve mutant formunun ekspresy ekspresyolası
    1. 50 μg/mL ampisilin içeren taze ve steril 50 mL LB ortamında istenen yapıyı barındıran E. coli ifade suşunu büyütün. 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak hücreleri bir gecede büyütün.
    2. %2 gliserol artı ampisilin (2,8 L Fernbach matarası) içeren taze ve steril 2x 1000 mL LB'ye 5 mL gece hücre kültürü ekleyin. 37 °C'de 200 rpm'de titreme ile hücre kültürünü büyütün.
    3. OD600 0.6-0.8'e ulaştığında, 0.4 mM'lik son konsantrasyonda IPTG'nin eklenmesiyle rekombinant protein ekspresyonunu teşvik edin ve ardından 200 rpm'de sallanarak bir gecede 30 °C'de inkübasyon.
    4. Hücreleri 20 dakika boyunca 4 °C'de 4.000 x g'da santrifüjleyarak hasat edin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini soğuk lizis tamponu 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, 100 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA ve 1 mM PMSF) içeren 50 mL tampon ile yeniden askıya alın.
      NOT: Hücreler -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya protein saflaştırma için hemen kullanılabilir. Hücreleri saklamak için hücre süspansiyonu 2 x 50 mL tek kullanımlık santrifüj konik tüplere bölün ve hücre peletlerini protein saflaştırma adımına kadar -80 °C'de tutun. LB suyunda α2β2StTS kompleksinin mutant ve vahşi tip formunun ifadesi litre başına 125-150 mg protein verir. Belirli talepleri karşılamak için iletişim kuralını yukarı veya aşağı ölçeklendirmeyi düşünün.
  3. α2β2StTS kompleksinin vahşi tipinin veya mutant formunun saflaştırılması
    NOT: Aşağıdaki protokol, etiketlenmemiş rekombinant vahşi tipini veya mutant formunu rekombinant α arındırmak için tasarlanmıştır.2β2StBeceri set ve çabalara bağlı olarak 1 gün içinde TS kompleksi. Saflaştırma süresini azaltmak için, tampon önceki protein saflaştırma/ekspresyonunda boyut dışlama sütununu dengeler. Vahşi tip veya mutant α arındırılması2β2StTS kompleksi, amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve boyut dışlama kromatografisinden oluşan iki aşamalı bir saflaştırma ile gerçekleştirilir. Bu protokol, 1 L LB ortamından 60-100 mg saf kompleks sağlar.
    1. 1/2" Boynuz probu (veya benzer bir ekipman) ile dijital bir sonifier kullanarak sonication ile hücre peletlerini bozın. 10 s darbe ve 20 s dinlenme kullanarak veya tam hücre bozulmasına kadar buzlu su banyosunda% 80 genlik görev döngüsünde 20 döngü gerçekleştirin.
    2. Hücre lirfatını 25 °C'de 30 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüj edin. Peletin tüpten yerinden sapmamasını sağlayarak süpernatantı aspire edin. Netleştirilmiş süpernatant fraksiyonu oda sıcaklığında 0,45 μm filtre ile filtreleyin.
    3. Netleştirilmiş süpernatant fraksiyonunun başlangıç hacmini değerlendirin. % 20 doygunluğa ulaşana kadar (11,51 g / 100 mL) bir seferde küçük miktarlarda amonyum sülfat ekleyin. 25 °C'de amonyum sülfat fraksiyonasyonunu gerçekleştirin. Çözeltiyi 10 dakika hafifçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının.
    4. 25 °C'de 10 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüj. % 20'lik süpernatant fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 20 mL numune tamponu 2'de (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA ve 2 mM dithiothreitol içeren) %20 pelet fraksiyonunu nazikçe yeniden kullanın ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir örnek hazırlayın. % 20 pelet fraksiyonunu atın.
    5. %20'lik süpernatant fraksiyonun başlangıç hacmini değerlendirin. % 30 doygunluğa (5,94 g / 100 mL) amonyum sülfat ekleyin, çözeltiyi karıştırın, kabarcıklardan kaçının ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. % 30'luk süpernatant fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 20 mL numune tamponu 2'de %30 pelet fraksiyonunu nazikçe yeniden kullanın ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir örnek hazırlayın. % 30 pelet fraksiyonunu atın.
    6. %30'luk süpernatant fraksiyonun başlangıç hacmini değerlendirin. % 40 doygunluğa (6.14 g / 100 mL) ulaşılır, çözeltiyi karıştırın, kabarcıklardan kaçının ve daha önce olduğu gibi santrifüj ekleyin. % 40'lık süpernatant fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 10 mL numune tamponu 2'de %40 pelet fraksiyonunu hafifçe yeniden kullanın ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir örnek hazırlayın. %40'ından fazla olan kesirini atın.
      NOT: %12 SDS-PAGE jel25'te %30 ve %40'lık süpernatant ve pelet fraksiyonlarının örneklerini kullanarak αβStTS kompleksinin kalitesini değerlendirin. Başka bir mutant αβStTS kompleksinin% 40 süpernatant fraksiyonunda olduğunu doğrularsanız, % 60 amonyum sülfat doygunluğu ile devam edin (13.0 g / 100 mL). Önceden saflaştırılmış α2β2 StTS kompleksinin önceden saflaştırılmış protein aliquotları -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya hemen bir boyut dışlama kromatografi kolonunda (SEC) protein saflaştırma için kullanılabilir.
    7. Protein örneğini 10.000 x g,20 dk'da mikrosantrifüjleyin, 4 °C ve süpernatant fraksiyonu, daha önce SEC tamponunda dengelenmiş 0,5 mL min -1 akış hızında hızlı protein sıvı kromatografisine bağlı bir HiPrep16/60Sephacryl S-200 HR sütununa yükleyin (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0,1 mM piridoksial fosfat).
      NOT: Büyük miktarlarda kompleksi arındırmak için, 26/600 Superdex 200 pg'lik bir HiLoad sütununa 20-25 mgmL-1'de 5 mL'lik bir numuneyi 1,5 mL min-1akış hızında yükleyin.
    8. Coomassie parlak mavi lekesi ile boyanmış% 12 SDS-PAGE jel üzerinde SEC sütunundan amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve tepe fraksiyonları boyunca toplanan örnekleri değerlendirin25.
    9. Vahşi tip veya mutant α2β 2StTS kompleksini4°C'de 3.000 x g'da dönerek 15 mL 100 kDa kesme santrifüj filtre ünitesi ile konsantre edin. Konsantre proteini agregaları çıkarmak için taze bir 2,0 mL tüpe ve mikrosantrifüje (10.000 x g, 10 dk, 4 °C) aktarın.
    10. Protein konsantrasyonu24'übelirleyin, 20-25 mg mL-1'de 0,5mL aliquots hazırlayın, etiket, sıvı nitrojende flaş dondurma ve -80 ° C'de saklayın.

3. α2β2StTS kompleksinin vahşi tipi ve mutant formu için optimize edilmiş kristalizasyon

NOT: α2β2StTS kompleksi için ilk kristalizasyon durumu daha önce% 12 PEG 8.000 ve 2 mM spermin22içeren koşullarda bildirilmiştir.

  1. Daha iyi bir kristalizasyon tekrarlanabilirliği elde etmek için kristalizasyon testlerinden önce stok çözümleri hazırlayın. TS ile yapısal çalışmalar yapmak için bienzim kompleksinin metal koordinasyon sahasında Na+ veya Cs+ iyon ile proteini kristalize edin.
    1. Suda 200 mM spermin 5 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 500 μL aliquots'u -20 °C'de tutun.
    2. Suda %30 (w/v) PEG 8000'lik 50 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 25 mL'lik tek kullanımlık santrifüj konik şişelerde 25 mL aliquots'u 25 °C'de tutun.
    3. Suda 1 M CsCl'lik 25 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 25 °C'de tutun.
    4. Suda 1 M NaCl 25 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 25 °C'de tutun.
    5. pH 7.6, 7.8 ve 8.0'da tamponlanmış çözeltiler elde etmek için CsOH veya NaOH ile 3x 50 mL stok çözeltisi hazırlayın ve CsOH veya NaOH ile titrat hazırlayın. 25 mL aliquots'ı 4 °C'de tutun.
  2. Bir buz banyosundaα 2β2StTS kompleksinin (20-25 mg mL-1)bir örneğini çözün.
  3. Protein agregalarını çıkarmak için 25 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da mikrosantrifüj örneği.
  4. Temizlenmiş süpernatant fraksiyonu temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Tahmini protein konsantrasyonu24 ve seyreltilmiş protein aliquots (150-200 μL) 15 mg mL-1 ile 50 mM bicine-CsOH veya -NaOH, pH 7.8 içeren 50 mM CsCl veya NaCl. Protein örneğini 25 °C'de tutun.
  6. Steril 1,5 mL etiketli mikrosantrifüj tüplerde 3x 24 kuyulu oturma damla plakaları için 500 μL rezervuar çözümlerini hazırlayın. Rezervuar çözeltisi 50 mM bicine-CsOH veya -NaOH, 50 mM CsCl veya NaCl ve PEG 8000 içerir. Plaka kolonlarındaki PEG 8000 (%6-11) konsantrasyonuna ve plaka sıralarına spermin (2-8 mM) konsantrasyonuna göre değişir. Her küme için tampon pH'larını (pH 7.6, 7.8 ve 8.0) değiştirin.
  7. Tüpleri ve girdabı en az 10 saniye kuvvetli bir şekilde kapla. Kabarcıkları çıkarmak için 25 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjtüpleri. Etiketli her rezervuarda 500 μL tamponlu çözelti dağıtin.
  8. Bir P-10 mikropipette kullanın ve her oturma damlası başına 15 mg mL-1'de 5 μL protein çözeltisi dağıtın. Kabarcıklardan kaçının. Protein düşüşüne her bir muhabir rezervuar çözeltisinin 5 μL'sini ekleyin. Karıştırma sırasında kabarcıklardan kaçının ve karışımı homojenize etmek için yukarı ve aşağı pipet yapmayın.
  9. Plakayı şeffaf yapışkan bir bantla bantlayın ve plakayı 25 °C'de saklayın. Kristaller 2-5 gün içinde ortaya çıkar ve iki hafta içinde tam boyutlarına büyür.

4. X-ışını kırınım veri toplama ve α2β2StTS karmaşık yapı çözümü

NOT: X-ışını kırınım verisi toplamadan önce, her kristal için önceden kriyoprotektan çözeltisi hazırlayın. Çözeltide (%10, 20 ve%30 v/v) ve spesifik ligand (lar) artan d imetil sülfit konsantrasyonları içeren 3 aliquots hazırlamak için özel rezervuar çözeltisini kullanın. Dimetil sülfooksitin gliserol, etilen glikol ve PEG 200-300'den daha iyi bir kriyoprotektant olduğu bulunmuştur.

  1. Stereoskopik mikroskop altında bir kriyoloop kullanarak büyük bir tek kristal hasat edin.
  2. Pipet 2 μL her kriyoprotektant çözeltisi içeren çökeltme çözeltisi artı dimetil sülfit ve ligand (lar) daha yüksek konsantrasyonlarda yeni bir kapak kaydırağı üzerine.
  3. Sırayla, crystal'ı her damlaya batırın ve kristalin kriyoprotektant çözeltisinde 30 sn boyunca dengede bekletin.
  4. Kriyoprotekslenmiş kristali -173 °C'de (100 K) gazlı bir azot akışı kullanarak flaş soğutma veya paklarda uzun süreli depolama için sıvı nitrojene daldırma.
    NOT: Bir köpüğü Sıvı nitrojenle doldurun, bir kristal pakı önceden soğutun, kristalleri kriyojenik depolama Dewar'da saklayın ve kristalleri kuru bir gönderici kullanarak senkrotrona sevk edin.
  5. -173 °C'de X-ışını kırınım verisi toplama işlemine devamedin. 0,5-4,0 s pozlama süresi ve 0,5° salınımlar kullanarak X-ışını kırınım verilerini kaydedin. Kristali 180-360° döndürün.
  6. Uygun alan grubunda yansıma dosyası oluşturmak için X-ışını kırınım görüntülerini iMosflm27 ile işleyin. Genellikle, α2β2StTS kristalleri C 121 (C2) uzay grubuna aittir.
  7. CCP4 paketi29'dauygulanan Scala28ile yansımaların birden fazla gözlemini birlikte ölçeklendirin.
  8. MolRep30 ve uygunbir arama modeli kullanarak moleküler değiştirme ile yüksek çözünürlüklü α 2 β2StTS kompleksinin yapısını çözün. Başarılı bir yapı çözümünden sonra Coot31'deki modeli ve elektron yoğunluk haritasını inceleyin.
    NOT: Protein Veri Bankası'nda farklı ligand (lar) ile yatırılan birçok TS kristal yapısı vardır. Daha iyi bir moleküler değiştirme adımı ve daha yeni kristal yapıya sığan zamanın azalması için, ilgi çekici ligand (lar) içeren en iyi arama modelini kullanın. CCP429, 30veya Phenix31'dekristal yapı iyileştirmesi ile devam edin.
  9. Coot32kullanarak modelde manuel ayarlamalar yapın, ardından Refmac29,33 veya phenix.refine 31,34ile otomatik olarak iyileştirme yapın. Coot32'de model oluşturma ve otomatik iyileştirmenin yinelemeli turlarını çalıştırarak son modeli oluşturun ve iyileştirin.
  10. Protein Veri Bankası web sitesinde koordinat ve yapı faktörleri biriktirmeye devam edin.

Sonuçlar

Triptofan sintazının αve β-alt birliğinin arındırılması
Modifiye pET SUMO vektörüne Salmonella tiphimurium triptofan sintazının α -altbölümü(αStTS) ve β-alt bölümü(β StTS) alt kavunludur. Şekil 1A, His6-SUMO-αStTS (lane αON) ve His6-SUMO-βStTS (lane βON) füzyon proteinine karşılık gelen iki güçlü ban...

Tartışmalar

Yapı fonksiyonu korelasyon çalışmaları için2β 2 βQ114A,2 β2 βK167Tα ve2 α β2βS377A StTS kompleksleri α mutant formunu başarıyla tasarladık. Başlangıçta, mutantları daha önceki bir saflaştırma protokolü22kullanarak arındırmaya çalıştık , bu da α2β2StTS karmaşık kristalizasyonu PEG 8000 ve spermin ile saflaştırma sırasında gerektirir. Kristalleşme hızı ...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak ve beyan edecek hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (GM097569) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL 10 kDa filterMilliporeSigmaUFC901024centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filterMilliporeSigmaUFC910024centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vialsCorningCLS430489Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-141microcentrifuge tubes
24-well Cryschem PlateHampton ResearchHR3-15824-well sitting drop plates
2-mercaptoethanolFisher ScientificO3446I-100Chemical
50 mL centrifuge conical tubesThermo Scientific12-565-270centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET BasicFisher Scientific13-636-AB15pH meter
AgaroseFisher ScientificBP1356-100Agarose gel
ammonium sulfateFisher ScientificA702-500Chemical
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5Antibiotic
Bacterial incubatorFisher ScientificS35836incubator.
BamHINew England BiolabsR0136SRestriction enzyme
bicineFisher ScientificBP2646100Chemical
Branson 450 Digital SonifierBrasonB450Cell disruptor
Cesium chlorideFisher ScientificBP210-100Chemical
Cesium hydroxideAcros OrganicsAC213601000Chemical
ChloramphenicolFisher ScientificBP904-100Antibiotic
dimethyl sulfoxideFisher ScientificD1391Chemical
dithiothreitolFisher ScientificBP172-5Chemical
DNA PolymeraseThermo ScientificF530SHF polymerase
dNTP SetInvitrogen10-297-018dNTPs set
EcoRINew England BiolabsR0101SRestriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acidFisher ScientificS311-100Chemical
Excella E25R Orbital ShakerEppendorf New BrunswickM1353-0004Orbital incubator
GE AKTA Prime PlusGE Healthcare8149-30-0004FPLC
Gel Extraction KitInvitrogenK210012DNA purification kit
GlycerolFisher ScientificG33-500Chemical
HindIIINew England BiolabsR0104SRestriction enzyme
His-Trap columnsGE HealthcareGE17-5255-015 mL Histrap column
imidazoleFisher ScientificO3196-500Chemical
IPTGThermo Fisher ScientificR0392Inducer
KanamycinFisher ScientificBP906-5Antibiotic
Kelvinator Series-100KelvinatordiscontinuedUltra low freezer
LB brothFisher ScientificBP1426-500Liquid broth
Luria Bertani agarFisher ScientificBP1425-2Solid broth
NaClFisher ScientificS271-500Chemical
NcoINew England BiolabsR0193SRestriction enzyme
Ni-NTA affinity beadsThermo Fisher ScientificR90115Ni-NTA agarose beads
PEG 8000Fisher ScientificBP233-100Chemical
phenylmethylsulfonyl fluorideFisher Scientific44-865-0Chemical
pyridoxal phosphateAcros OrganicsAC228170010Chemical
S-200 HRCytiva45-000-196Size exclusion column
SacINew England BiolabsR0156SRestriction enzyme
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100Chemical
Sorvall RC-5B centrifugeSorvall8327-30-1004Floor cetrifuge
SpermineAcros OrganicsAC132750010Chemical
Superdex 200 prep gradeCytiva45-002-491Size exclusion column
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202SDNA liagse
TrisFisher ScientificBP152-500Chemical
Ubl-specific protease 1Thermo Scientific12588018SUMO Protease

Referanslar

  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
  3. Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
  4. Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
  5. Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
  6. Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
  7. Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
  8. Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
  9. Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
  10. Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
  11. Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
  12. Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
  13. Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
  14. Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
  15. Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
  16. Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
  17. Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
  18. Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
  19. Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
  20. Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
  21. Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
  22. Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
  24. Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
  27. Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, 271-281 (2011).
  28. Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 72-82 (2006).
  29. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  30. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 213-221 (2010).
  32. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 486-501 (2010).
  33. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, 240-255 (1997).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, 352-367 (2012).
  35. Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
  36. Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 163Triptofan sintazrekombinant proteinmutant proteinprotein ekspresyonuprotein safla t rmaamonyum s lfat keltmeboyut d lama kromatografisiprotein kristalizasyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır