Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג סדרה של שיטות רצופות לביטוי וטיהור של סלמונלה טיפוס סינתאז comp פרוטוקול זה מערכת מהירה כדי לטהר את קומפלקס החלבון ביום. שיטות מכוסות הן מוטאגנסיס מכוונת אתר, ביטוי חלבון ב Escherichia coli, כרומטוגרפיה זיקה, כרומטוגרפיה סינון ג'ל, והתגבשות.

Abstract

מחקרים מבניים עם קומפלקס ביאנזים טריפטופן (TS) (α2β 2 TS) מ טיפוס סלמונלה בוצעו כדי להבין טוב יותר את המנגנון הקטליטי שלה, התנהגות אלוסטרית, ופרטים על הטרנספורמציה אנזימטית של מצע למוצר באנזימים תלויי PLP. בעבודה זו, מערכת ביטוי חדשנית לייצור α המבודדת והמבודדת β-subunit אפשרה טיהור של כמויות גבוהות של תת-קהילות טהורות ו-α2β2מתחם סנטTS ממתחם התת-קרקעי המבודד תוך יומיים. הטיהור בוצע על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ואחריו מחשוף של תג הזיקה, משקעים אמוניום גופרתי, כרומטוגרפיה אי הכללת גודל (SEC). כדי להבין טוב יותר את התפקיד של שאריות מפתח באנזים β-אתר, מוטגנזה ישירה באתר בוצעה במחקרים מבניים קודמים. פרוטוקול נוסף נוצר כדי לטהר את הסוג הפראי ואת המוטציה α2β2מתחמי סנטTS. פרוטוקול פשוט, מהיר ויעיל באמצעות שבר אמוניום גופרתי ו- SEC אפשרטיהורשל מתחם α 2 β2StTS ביום אחד. שני פרוטוקולי הטיהור המתוארים בעבודה זו יש יתרונות ניכרים בהשוואה לפרוטוקולים קודמים כדי לטהר את אותו קומפלקס באמצעות PEG 8000 ו spermine כדי לגבש את α2β2StTS מורכב לאורך פרוטוקול הטיהור. התגבשות של סוג פראי וכמה צורות מוטנטיות מתרחשת בתנאים שונים במקצת, ופוגעת בטיהור של כמה מוטציות באמצעות PEG 8000 וזרעון. כדי להכין גבישים המתאימים למחקרי קריסטלוגרפיה רנטגן נעשו מספר מאמצים כדי לייעל התגבשות, איכות קריסטל ו cryoprotection. השיטות המוצגות כאן צריכות להיות ישימות בדרך כלל לטיהור של תת-units טריפטופן סינתאז וסוג פראי ומוטנטים α2β2מתחמיסנטTS.

Introduction

קומפלקס הדו-אנזים (TS) (α2β2)הוא אנזים אלוסטרית, המזרז את שני השלבים האחרונים בביוסינתזה של חומצת האמינו L-טריפטופן בחיידקים, צמחים ופטריות1,2,3. חיידק סלמונלה אנטטיקה שרף שרף ( St) גורם לזיהום חמור במערכת העיכול בבני אדם ובבעלי חיים אחרים. מאז בני אדם ובעלי חיים גבוהים אין TS (EC 4.2.1.20), עיכוב של S. טיפוס α2β2 תסביך TS (α2β2StTS) נחקר כיעד תרופה פוטנציאלי לטיפול cryptosporidiosis ושחפת4, זיהומים באברי המין והעיקולים5, ועל ניצול פוטנציאלי של קוטלי עשבים בחקלאות6. α-subunit מזרז את המחשוף האלדוליטי של אינדול-3-גלייצרול-פוספט (IGP) כדי הגליצרלדהיד-3-פוספט (GAP) והאינדול, באמצעות היווצרות של טאוטומר אינדולנין ביניים ולאחר מכן מחשוף קשר פחמן-פחמן כדי לייצר GAP ו indole3,6. האתר β-קטליטי מכיל מולקולת קופקטור פירידוקסלית 5′-פוספט (PLP) הקשורה β-Lys87 דרך בסיס שיף, המתפקד ככיור אלקטרונים במהלך התגובות באנזים β-subunit3,7. האתר β מזרז את החלפת ההידרוקסיל בצד L-Serine על ידי אינדול כדי לתת L-טריפטופן ומולקולת מים בתגובה תלויה PLP. סנט TS משמש מודל ארוך שנים לחקירת תקשור מצע ותקשורת אלוסטרה בתוך מתחמים מרובי אנזימים2,3. תקשורת אלוסטרית דו-כיוונית בין α ואיחודי המשנה β של TS נחוצה כדי לסנכרן את השלבים הקטליטיים ולמנוע שחרור אינודול במהלך סינתזה L-טריפטופן3. כדי להאריך את המאמץ הזה, הכנו מספר מוטציות (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr, ו- β-Ser377Ala) על ידי מוטציה של נקודה אחת שישמשו לחקר נוסף של הקשר בין מבנה האנזים, המנגנון והתפקוד באתר הקטליטי של stTS β-subunit.

מחקר מפורט על המנגנון הקטליטי של α2β2סנטTS יזם על ידי קבוצת המחקר של אדית וו מיילס. מחקרים מוקדמים עם ילידי Escherichia coli α2β2 TS מורכבים התמקדו בטיהור ואפיון של α-subunit מבודד8,9, מבודד β-subunit10,11 ואת השבת α2β2 מתחם TS מן subunits מבודד12. הטיהור בוצע על ידי משקעים אמוניום גופרתי, דיאליזה לדוגמה, כרומטוגרפיה DEAE-Sephadex, דיאליזה, וסיבוב כרומטוגרפי שני על טור DEAE-Sephadex12. בפרוטוקול אחר, הטיהור של אותו קומפלקס שופר על ידי טעינת lysate התא המובהר על עמוד DEAE-Sephadex ואחריו צעד כרומטוגרפי על עמוד Sepharose 4B, משקעים אמוניום גופרתי ודיאליזה13. שני פרוטוקולי הטיהור נמשכים 4-5 ימים. Escherichia coli α2β2 TS מורכב מגובש אבל גבישים לא היו מתאימים עקיפה רנטגן באותו זמן.

במחקר חדשני, צורות רקומביננטיות ופראיות של S. typhimurium α2β2 תסביך TS טוהרו וגובשו14,15. מתחם ה-CB149 של α רקומביננטי2β 2StTS הובע יתר עלהמידהבזן E. coli CB149 הנושא את וקטור הביטוי pEBA-10. התגבשות ראשונית ואיסוף וניתוח נתוני עקיפה של קרני רנטגן של מתחם α2β2StTS דווחו14. עם זאת, מחט ארוכה ודקה כמו α2β2גבישיסנטTS לקוי מחקרים מבניים. בניסיון לאסוף נתוני עקיפה טובים יותר של קרני רנטגן, תואר פרוטוקול טיהור נוסף כדי לטהר את הסוג הפראי ואת צורות המוטציה של α2β2StTSמתחם 15. הטיהור בוצע עם משקעים ראשוניים באמצעות זרע ו PEG 8,000 לתוך ליסאט התא המובהק ומצרף גדול מגושם הוסר על ידי צנטריפוגה. השבר העל-טבעי המכיל כמויות גבוהות של α2β2StTS מתחם אוחסנו במשך 16-48 שעות ב 4 °C (70 °F) עד גבישים צהובים מזורם. גבישים נשטפו ודיאליגו בהרחבה כנגד מאגרים שונים. קומפלקס החלבון היה recrystallized במאגר המכיל אמוניום גופרתי וחיוג15. אמנם, התגבשות חלבון תלויה בחלבון ובריכוזים מזרזים בתמיסה, קשה לפקח, לחזות ולהתרבות טיהור לצורות מוטנטיות אחרות של α2β2StTS תסביך. לפרוטוקול זה יש יתרון בכך שהוא אינו משתמש בשיטות כרומטוגרפיות כלשהן; עם זאת, החסרונות הם זמן הטיהור הארוך הדרוש כדי להתגבש, לחייג ולבטל, הדורש בדרך כלל 5-7 ימים. כדי להשיג גבישים המתאימים לאיסוף נתוני רנטגן, יותר מ -600 תנאי התגבשות הוערכו באמצעות שילוב וריאציה של ריכוז חלבון, טמפרטורה, משקעים (PEG 4,000, 6,000, ו 8,000), ותוספים (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, cadaverine, putrescine, זרע, או זרע)15. גבישים היו בצורת גבישית טובה יותר וגדלו מהר יותר בתנאים המכילים 12% PEG 8,000 ו 2 mM זרעון. ההתגבשות הייתה חיובית יותר ב 25 °C (75 °F) ולא ב 4, 30, או 42 °C (5 °F) גדל לממדים מקסימליים בתוך 3 ימים15. כמה α2βשנימבני גבישסנטTS דווחו באותה תקופה (1996-1999)16,17,18,19,20,21 ומבנים רבים אחרים פורסמו עד כה.

כאן, המטרה העיקרית היא להציג פרוטוקולים חלופיים כדי לטהר סינתאז טריפטופן ולמטב את התגבשות חלבון. העבודה הנוכחית מציגה שיפורים משמעותיים כדי לטהר את סוג הפרא מבודד α-subunit (αStTS), מבודד β-subunit (βStTS), מחדש α2β2סנטTS המתחם מן subunits מבודד, וסוג פראי וצורות מוטציה של α2β2מתחם סנטTS. היתרונות על פני פרוטוקולים קודמים ניכרים שכן זמן הטיהור צומצם באופן משמעותי והתגבשות והגנה קריו-הגנתית היו מותאמים. צורות מוטנטיות של α2β2 מתחםסנטTS מהונדס בעבודה זו התגבשו ליד אותו מצב המשמש עבור צורת סוג הבר. עם זאת, אופטימיזציה התגבשות בסדר היה צורך להשיג גבישים יחיד גדול באיכות מספקת לקביעת מבנה ברזולוציה אטומית קרובה. עד כה, ישנם 134 מבני קריסטל סינתאז טריפטופן שהופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB), חשבונאות 101, 31 ו -2 מבני קריסטל, בהתאמה, עבור חיידקים, ארכאי ואאוקריוטה. יפה, 73 מבנים שייכים S. enterica serovar typhimurium ו 5 מבני קריסטל של α2β2סנטTS מתחם יש מגבלות רזולוציה גבוהות יותר מ 1.50 אנגסטרום. באופן לא מפתיע, 4 מתוך 5 הוכנו בקבוצת המחקר שלנו (מזהי PDB:5CGQ ב 1.18 Å, 4HT3 ב 1.30 Å, 4HPJ ב 1.45 Å, 6DZ4 ברזולוציה 1.45 Å). מבני הגביש המעודנים של צורה מוטנטית של α2β2StTS קומפלקס צפויים לספק תובנות חדשות על המנגנון והתפקידים שיחקו שאריות חומצת אמינו חיונית המעורבים בסינתזה L-טריפטופן.

Protocol

1. פרוטוקול מהיר לטיהור מתחם α β וה-α המחודש2β2StTS

  1. החלפת דנ"א לווקטור הביטוי pETSUMO
    1. השג את הגן המצמד התרגומי (trpA ו- trpB) המקודד את α- ואת β-subunits של סינתאז טריפטופן מחיידק סלמונלה אנטטיקה ספירובה טיפימוריום משובט בווקטור הביטוי pEBA-1022. השתמש בווקטור pEBA-10 כתבנית DNA.
      הערה: לחלופין, פריימרים המפורטים להלן ניתן להשתמש כדי להגביר את שני הגנים מן סלמונלה נצרת שרף גנום erovar. כל צעדי הביולוגיה המולקולרית בוצעו כמתואר בשיבוט מולקולרי: מדריךמעבדה 23.
    2. השתמש בתגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר בנפרד את רצף הפולינוקלאוטידים באורך מלא של α-subunit (αStTS) עם פריימרים αStTS-FW-Bamו- stTS-Rev-Eco αורצף באורךמלא של β -subunit (βStTS) עם פריימרים βStTS-FW-Bamו- stTS-Rev-Hind β St TS-Rev-Hind. השתמש בטמפרטורת התכה של כ 55 °C (55 °F) וזמן הארכת פולימראז של 2 דקות.
      1. השתמש ב- DNA פולימראז בעל אמינות גבוהה (למשל, Phusion) ובפרוטוקול היצרן כדי להגביר את רצפי הדנ"א. עבור תגובה 50 μL PCR להוסיף 34 μL של מים ללא גרעין, 10 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של 10 μM פריימר קדימה, 1 μL של 10 μM פריימר הפוך, 1 μL של DNA תבנית (200 ng), 1.5 μL של DMSO, 0.5 μL של Phusion DNA פולימראז.
      2. עבור תוכנית PCR, השתמש בהתחלה חמה (180 שניות ב 98 °C (78 °C) ואחריו 30 מחזורי הגברה (30 שניות ב 98 °C (55 °C (55 °C (55 °C) ו 120 שניות ב 72 °C (72 °C), והארכה סופית (300 שניות ב 72 °C (72 °C ).C).
        הערה: הרצפים הנואטיים תואמים לאתרי ההגבלה של באםHI, EcoRI, באםHI ו- HindIII, בהתאמה. יעילות מחשוף האנזים קרוב termini של שברי PCR שופרו על ידי הוספת בסיסים נוספים (רצפי אותיות נמוכות).
        αStTS-FW-Bam: 5′-CGCGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-CGCGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. טען מוצר PCR על ג'ל אגרוז 0.8% במאגר 1x TAE (40 mM Tris, 20 mM חומצה אצטית ו 1 mM EDTA) ב 6 V / ס"מ, ג'ל לחלץ את רצועת ה- DNA של עניין, ג'ל לטהר את שבר PCR באמצעות ערכת חרוז סיליקה בעקבות ההוראות של היצרן.
      1. תעיכול לפחות 200 ננוגרם של כל שבר DNA עם אנזימי הגבלה מתאימים ותנאים המומלצים על ידי היצרן במשך 2 שעות ב 37 °C (70 °F).
      2. כדי להגדיר 50 μL הגבלת תגובה העיכול להוסיף 34 μL של מים ללא נוקלאז, 10 μL של DNA (200 ng), 5 μL של 10x חיץ תגובה, 0.5 μL של אנזים הגבלה 1, ו 0.5 μL של אנזים הגבלה 2.
      3. העמיסו את מוצר העיכול על ג'ל אגרוז 0.8% על ת"א 1x במחיר של 6 V/ס"מ, תמצית ג'ל, וג'ל לטהר את השבר מתעכל באמצעות ערכה מסחרית.
    4. תת-קלון בנפרד כל שבר לתוך ביטוי E. coli שונה וקטור pET SUMO, מתעכל בעבר עם אנזימים מתאימים ג'ל מטוהר.
      הערה: וקטור זה הוא גירסה שונה של ה- pET SUMO המסחרי. וקטור זה עבר אופטימיזציה לשיבוט אנזימי הגבלה. האתר הרב-שיבוט (MCS) של וקטור pET28b(באםHI, EcoRI, שקI, סאלI, HindIII, NotI ו- XhoI) הוכנס לאתר השיבוט של pET SUMO. וקטור זה מכיל תג N-terminal 6x-Histidine במסגרת עם חלבון משנה קטן דמוי יוביקוויטין (SUMO) ואתרי שיבוט מרובים.
    5. Ligate 100 ננוגרם של pET SUMO שונה ו 50 ננוגרם של שבר PCR עם ligase DNA T4 במשך 2 שעות ב 25 °C (70 °F).
    6. להפוך את plasmid בנוי לתאים מוסמכים של E. coli זן DH10Bα תאים. תאי צלחת על לוחות אגר LB המכילים 35 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin. לדגור את הצלחת הפוכה לילה ב 37 °C (50 °F).
    7. בחר מושבה אחת מכל טרנספורמציה, הכין DNA פלסמיד טהור במיוחד ובצע ריצוף DNA כדי לוודא αStTS או βStTS שוכפלו במסגרת עם תג N-terminal His6-SUMO.
      הערה: הכן מלאי גליצל של תרבית התא (להפוך השעיית תא בריכוז הסופי של 16% של גליצריל סטרילי) ולאחסן אותם לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F).
    8. הפוך את הביטוי plasmid SUMO-αStTS או SUMO-βStTS בנפרד לתאים מוסמכים של זן ביטוי E. coli רוזטה (DE3) pLysS עם מערכת מבוססת מקדם T7. צלחת התאים רקומביננטיים על לוריא ברטאני (LB) צלחות אגר המכיל 35 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin וכלורמפניקול. לדגור את הצלחת הפוכה לילה ב 37 °C (50 °F).
    9. לאחר היווצרות מושבה מוצלחת, לבחור מושבה אחת בודדת (ללא כל מושבות לווין) ולפזר אותו ב 5 מ"ל של מדיום LB עם שתי אנטיביוטיקה. תאי תרבות לילה עם רועד ב 200 סל"ד ב 37 °C (50 °F).
      הערה: הכן מלאי גליסול של תרבית תאים, לאחסן לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F) או להשתמש מיד עבור ביטוי חלבון רקומביננטי.
  2. ביטוי של SUMO-αStTS ו- SUMO-βStTS
    1. לחסן זן E. coli טרי רוזטה (DE3) תאי pLysS מחסה SUMO-αStTS או SUMO-βStTS בונה או לגרד חלק ממלאי הגליצריל הקפוא לתוך תרבות 50 מ"ל של LB המכיל 35 מיקרוגרם / מ"ל קנאמיצין וכלורמפניקול. לגדל תאים לילה עם רועד ב 200 סל"ד ב 37 °C (50 °F).
    2. למחרת בבוקר, לחסן 5 מ"ל של תרבות התא לילה בבקבוק 2X 1000 מ"ל טרי וסטרילי המכיל 2% גליצל בתוספת kanamycin וכלורמפניקול (בקבוק פרנבך 2.8 L). הגדל את תרבית התאים עם רעידות ב 200 סל"ד ב 37 °C (50 °F).
      הערה: הביטוי של SUMO-αStTS או SUMO-βStTS במרק LB מניב 125-150 מ"ג חלבון מתויג לליטר. שקול לשנות את קנה המידה של הפרוטוקול למעלה או למטה כדי למלא דרישות ספציפיות.
    3. גרים ביטוי חלבון רקומביננטי כאשר OD600 מגיע 0.6-0.8 על ידי תוספת של איזופרופיל β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) בריכוז סופי של 0.4 מ"ר ואחריו דגירה ב 30 °C בלילה עם רועד ב 200 סל"ד.
    4. לקצור את התאים על ידי centrifuging ב 4,000 x גרם ב 4 °C (50 °F) במשך 20 דקות. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את כדורי התא עם חיץ תמוגה קר 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, המכיל 500 mM NaCl, 5% גליצל, 10 mM 2-mercaptoethanol, ו 40 mM imidazole-Cl) לנפח סופי של 60 מ"ל.
      הערה: תאים יכולים להיות מאוחסנים לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F) או לשמש באופן מיידי לטיהור חלבון. כדי לאחסן תאים, לפצל את ההשעיה התא לתוך 2 x 50 מ"ל צינורות חרוטיים חד פעמיים ולשמור על כדורי התא ב -80 °C (80 °F) עד שלב טיהור החלבון.
  3. טיהור של α- ואיחודי משנה β של סינתאז טריפטופן
    הערה: כל ההליכים צריכים להתבצע בשעה 4 °C (70 °F) אלא אם צוין אחרת. כדי לקצר את זמן הטיהור, יש לכלול עמודות זיקה טעונות ניקל Ni-NTA ועמודת אי-הכללת גודל במאגר לפני טיהור החלבון או במהלך ביטוי חלבון רקומביננטי.
    1. לשבש את גלולה התא על ידי sonication באמצעות sonifier דיגיטלי עם 1/2 "קרן בדיקה (או ציוד דומה). בצע 20 מחזורים ב 80% מחזור החובה משרעת על אמבט מי קרח באמצעות דופק 10 ו 20 s מנוחה או עד הפרעה מלאה בתא.
    2. צנטריפוגות התא ליסייט ב 30,000 x g במשך 30 דקות. שאפו סופר-טבעי, והבטיחו שהכדור לא יפלט מהצינור. סנן את supernatant עם יחידת מסנן 0.45 מיקרומטר על קרח ולהזרים אותו דרך 15 מ"ל Ni-NTA agarose ניקל טעון עמודת זיקה טעון ניקל מראש שפל במאגר תמוגה 1.
      הערה: כל עמודת אגרוז Ni-NTA תשמש לטיהור חלבון רקומביננטי של SUMO-αStTS אוβ SUMO-β StTS. טיהור יכול להתבצע בעמוד Ni-NiTA 2x 5 מ"ל המחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה. לטהר חלבון אחד בכל פעם.
    3. לשטוף Ni-NTA agarose עמודה ב 100 מ"ל של חיץ תמוגה 1.
    4. המשך עם 80 מ"ל elution שלב אחד עם חוצץ E1 (25 mM חוצץ Tris-Cl, pH 7.8, המכיל 200 mM NaCl, 5% גליצלול, ו 400 mM imidazole-Cl).
      הערה: SUMO-protease סובל עד 300 mM imidazole ואת הממברנה של מכשירי מסנן צנטריפוגלי סובל עד 100 mM imidazole. אנו ממליצים לבצע משקעים אמוניום גופרתי כדי להסיר כמויות גבוהות של imidazole ולהקטין את זמן הטיהור במקום לדלל את דגימת החלבון ולבזבז זמן עם ריכוז חלבון.
    5. להעריך את הנפח ההתחלתי של שבר על טבעי. לאט להוסיף כמויות קטנות של אמוניום גופרתי בכל פעם, עד 60% רוויה (39.48 גרם / 100 מ"ל) ב 25 °C (5 °F). מערבבים בעדינות את הפתרון במשך 30 דקות ולהימנע בועות. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 15 דקות.
    6. שאפו והשליכו את השבר העל-טבעי בזהירות. resuspend שבר הכדור ב 20 מ"ל של חוצץ מדגם (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300 mM NaCl ו 5% גליסול).
    7. עבור מחשוף שלו-SUMO-תג עם SUMO-protease, להוסיף את הקטע רקומביננטי של פרוטאז ספציפי Ubl 1 מ Saccharomyces cerevisiae ביחס 1:1000 ולדגירה את התערובת במשך 2 שעות ב 4 °C (50 °F).
    8. צנטריפוגה מוצר העיכול ב 10,000 x גרם ב 25 °C (25 °C) במשך 20 דקות כדי להסיר אגרגטים חלבון לפני טעינת המדגם באמצעות עמוד כרומטוגרפיה זיקה.
    9. הסר עקבות של תג His6-SUMO עובר את המדגם resuspended 20 מ"ל על עמודת אגרוז Ni-NTA 15 מ"ל, בעבר שוקל במאגר תמוגה 1.
    10. לאסוף את מדגם המעבר המכיל לאמתויג αStTS או βStTS.
    11. לשטוף את עמודת Ni-NTA ב 20 מ"ל של חוצץ 1 כדי לאסוף שאריות של αלא מתויגסנטTS או βStTS.
    12. מרכז כל תת-יחידה בנפרד עם יחידת מסנן צנטריפוגלית 15 מ"ל 10 kDa על ידי ספינינג ב 3,000 x g ב 4 °C (7 °F). העבר את החלבון המרוכז לצינור 2.0 מ"ל טרי ומיקרוצנטריפוגה (10,000 x גרם, 10 דקות, 4 °C (4 °F) כדי להסיר אגרגטים. לקבוע ריכוז חלבון24, להכין 1 mL aliquots ב 20-25 מ"ג מ"ל-1,תווית, פלאש-להקפיא חנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 °C (80 °F).
      הערה: ניתן לאחסן דגימות חלבון מטוהרות מראש לטווח ארוך ב- -80 °C (80 °F) או לשמש באופן מיידי לטיהור חלבונים בעמודת כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC).
    13. קח עליקוט חלבון (20 מ"ג) ומיקרוצנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות כדי להסיר אגרגטים לפני SEC.
    14. דגימת עומס על עמודת כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (לדוגמה, HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) המצורפת לכרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהירה בקצב זרימה של 0.5 מ"ל לדקה-1, ששוקל בעבר במאגר SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, 5% גליצל, 0.1 mM פוספט פירידוקסלי).
      הערה: כדי לטהר כמויות גבוהות יותר של מבודד αStTS או βStTS subunit ולהקטין את מספר סיבובי SEC, לטעון מדגם 5 מ"ל ב 20-25 מ"ג מ"ל-1 בעמודת כרומטוגרפיה אי הכללת גודל בקצב זרימה של 1.5 מ"ל min-1.
    15. להעריך את האיכות של αStTS או βStTS בשבר השיא באמצעות 12% או 15% נתרן דודסיל סולפט-ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), בהתאמה, מוכתם עם כתם כחול מבריק Coomassie25.
    16. חלבון מרוכז עם 15 מ"ל טרי 10 kDa ניתוק יחידות מסנן צנטריפוגלי, לקבוע ריכוז חלבון24, להכין 0.5 מ"ל aliquots ב 20-25 מ"ג מ"ל-1,תווית, פלאש-להקפיא בחנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 °C (50 °F).
  4. טיהור מתחם 2β2סנטTS α מאוני המשנה α β
    הערה: שיווי משקל עמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל (Sephadex S-200 HR או Superdex 200 pg) במאגר SEC (10 מ"מ טריס-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, 5% גליצל, 0.1 mM פוספט פירידוקסלי).
    1. כדי לטהר את מתחם α2β2StTS α ו-β, הפשירו דגימות תרכיז של αStTSו-stTS β ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. שלב aliquots (1.2 αStTS: 1.0 β יחס טוחנתStTS) ודגורה ב 4 °C (50 °F) עבור 1 שעה.
      הערה: עודף של αStTS יש צורך להבטיח כי רוב βסנטTS ישולבו במתחם α2β2StTS.
    3. הסר אגרגטים של חלבונים על ידי מיקרוצנטריפוגה (10,000 x גרם, 10 דקות, 4 °C (4 °F).
    4. טען את סופר-טבעי המובהק לעמודת אי-הכללת הגודל.
    5. להעריך את האיכות של αStTS או βStTS בשבר השיא באמצעות 12% או 15% נתרן דודסיל סולפט-ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), בהתאמה, מוכתם עם כתם כחול מבריק Coomassie25.
    6. לקבוע ריכוז חלבון24, להכין 250-1000 עליקוטים μL ב 15-20 מ"ג מ"ל-1,פלאש-להקפיא בחנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 °C (80 °F).

2. טיהור הסוג הפראי או הצורה המוטנטית של מתחם α2β2StTS

  1. מוטגנזה מכוונת אתר להכנת מוטציה βStTS
    1. השתמש בווקטור ביטוי pEBA-10 מבנה22 כתבנית DNA במהלך שני שלבים של תגובת שרשרת פולימראז כדי להציג מוטציות נקודתיות ספציפיות ברצף הפוינוקלוטידים של TS βשרשרת.
      הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להציג מוטציה נקודה אחת α או β-subunit מ סלמונלה טיפוס טריפטופן סינתאז. עבור פריימרים אוליגונוקלאוטיד חדשים נוספים המכילים את המוטציה הרצויה חייבים להיות מעוצבים כראוי. בעבודה זו מפורטים מוטציות βQ114A, βK167T, βS377A.
    2. בצע תגובות PCR באמצעות זוגות של פריימרים נוקלאוטיד TS-FW-NcoI / Q114A-Rev, TS-FW-NcoI / K167T-Rev, ו- TS-FW-NcoI / S377A-Rev ליצירת שברים A1, B1 ו- C1, בהתאמה.
      הערה: Oligonucleotide TS-NcoI-FW ו- TS-SacI-Rev, בהתאמה, חישול במעלה הזרם ובמורד הזרם של αβ StTS רצף פולינוקלאוטידים משובט בווקטור pEBA-10.
      1. השתמש ב- DNA פולימראז בעל אמינות גבוהה (למשל, Phusion) ובפרוטוקול היצרן כדי להגביר את רצפי הדנ"א. לתגובת PCR של 50 μL, הוסף 34 μL של מים ללא נוקלאז, 10 μL של מאגר תגובה 5x, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של פריימר קדמי 10 מיקרומטר, 1 μL של 10 μM פריימר הפוך, 1 μL של DNA תבנית (200 ng), 1.5 μL של DMSO, 0.5 μL של DNA פולימראז.
      2. עבור תוכנית PCR, השתמש בהפעלה חמה (180 שניות ב 98 °C (78 °C) ואחריו 30 מחזורי הגברה (30 שניות ב 98 °C (55 °C) ו 120 שניות ב 72 °C (72 °C), והארכה סופית (300 שניות ב 72 °C).
        הערה: כל שלבי הביולוגיה המולקולרית היו אחריו כמתואר בשיבוט מולקולרי: מדריךמעבדה 23. בעוד שרצף אותיות תחתונים מתאים לאתר הגבלה, רצף מודגש וטיאלי מתאים למוטציה.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. בצע תגובות PCR באמצעות זוגות של פריימרים נוקלאוטיד TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF, ו- TS-Rev-SacI/S377A-FF ליצירת שברים A2, B2 ו- C2, בהתאמה.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. השתמש בתגובת שרשרת פולימראז כדי להגביר בנפרד את השברים החלקיים. השתמש בטמפרטורת התכה של 55 °C (55 °F) וזמן הארכה פולימראז של 2 דקות.
    5. כדי לבצע את הסיבוב השני של תגובות PCR, לטעון את מוצר PCR לעיל על 0.8% אגרוז ג'ל על 1x TAE ב 6 V / ס"מ תמצית ג'ל ג'ל לטהר את שברי העניין.
      1. מערבבים שברים A1/A2, B1/B2 ו- C1/C2 בנפרד בכמויות שווימולריות, מחממים את התערובת במשך 10 דקות ב-96 מעלות צלזיוס, וחין ב-25 מעלות צלזיוס. להרחיב את גדילים רקומביננטיים עם פולימראז אמינות גבוהה ו deoxyribonucleotides על פי פרוטוקול היצרן.
    6. כדי ליצור מספר העתק גבוה של שבר ה-DNA המוטנטי באורך מלא, הוסף פריימרים אוליגו TS-FW-NcoI ו- TS-Rev-SacI כדי לבצע PCR שני.
    7. טען מוצר PCR על 0.8% agarose ב 1x TAE חוצץ ב 6 V / ס"מ, ג'ל לחלץ את רצועת ה- DNA של עניין, ג'ל לטהר את שבר PCR, ולהמשיך עם עיכול הגבלה מתאימה במשך 37 °C בעקבות החיץ המתאים והתנאים המומלצים על ידי היצרן.
      1. תעיכול לפחות 200 ננוגרם של כל שבר DNA עם אנזימי הגבלה מתאימים ותנאים המומלצים על ידי היצרן במשך 2 שעות ב 37 °C (70 °F). כדי להגדיר 50 μL הגבלת תגובה העיכול להוסיף 34 μL של מים ללא נוקלאז, 10 μL של DNA (200 ng), 5 μL של 10x חיץ תגובה, 0.5 μL של אנזים הגבלה 1, ו 0.5 μL של אנזים הגבלה 2. טען מוצר עיכול על אגרוז 0.8% במאגר ת"א 1x ב 6 V / ס"מ לטהר את שבר PCR מעוכל.
    8. תקציר 200 ננוגרם של מבנה pEBA-10 עם אנזימי הגבלה NcoI ו- SacI בעקבות המלצת היצרן. טען את מוצר העיכול על ג'ל אגרוז 0.8% במאגר ת"א 1x ב 6 V / ס"מ, excise את הלהקה כתב הווקטור, וג'ל לטהר את הווקטור מתעכל.
    9. Ligate 100 ננוגרם של וקטור עם 50 ננוגרם של שבר PCR, מתעכל בעבר מטוהר, עם ligase DNA T4 במשך 2 שעות ב 25 °C (70 °F). להפוך את plasmid בנוי לתאים מוסמכים E. coli זן DH10B תאים. תאי צלחת על לוחות אגר LB המכילים 50 מיקרוגרם / mL אמפיצ'ילין. לדגור את הצלחת הפוכה לילה ב 37 °C (50 °F).
    10. בחר מושבה אחת (ללא מושבות לווין) מכל טרנספורמציה תא ולפזר אותו ב 5 מ"ל של בינוני LB המכיל אמפיצלין. לגדל תאים לילה עם רועד ב 200 סל"ד ב 37 °C (50 °F). הכן 10 מיקרוגרם של DNA פלסמיד טהור במיוחד מכל מבנה מהונדס. הכן מלאי גליסול של תרבית התא (להפוך השעיית תא בריכוז הסופי 16% של גליצל סטרילי) ולאחסן לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F).
    11. בצע ריצוף דנ"א כדי לאשר את רצף באורך מלא המקפיד את α ו-β-subunits של סינתאז טריפטופן. אשר כל מוטציה בודדת בודדת והשלך כל מבנה פלסמיד המכיל מוטציה אקראית בלתי רצויה. פריימרים אוליגונוקלאוטיד המשמשים במחקר זה מפורטים להלן.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCATCTCTTG-3'
      הערה: פריימרים אוליגונוקלאוטיד TS-1F, TS-1R, TS-2F, ו- TS-3F anneal על רצף פולינוקלאוטיד של β-subunit (קוד גישה GenBank: CP051286.1). פריימרים TS-4F ו- TS-5F anneal על רצף הפולינוקלאוטידים של α-subunit (קוד גישה GenBank: CP053865.1).
    12. השתמש 200 ננוגרם של כל מבנה plasmid (pEBA-10-β Q114A, pEBA-10-βK167T, ו pEBA-10-βS377A) כדי להפוך תאים מוסמכים של זן ביטוי E. coli CB149, חסר אופרון trp 26. לאחר היווצרות מושבה מוצלחת, לבחור מושבה אחת אחת ולהגדיל את התאים ב 5 מ"ל של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / mL אמפיצלין. תרבית באינקובטור החיידקי ב 37 °C (50 °F) לילה. הכן מלאי גליסול של תרבית התא, לאחסן לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F) או להשתמש מיד עבור ביטוי חלבון רקומביננטי.
      הערה: מוטציה בודדת של נקודה אחת α או β-subunit מ סלמונלה טיפוס טריפטופן סינתאז עלול לפגוע בתפקוד האנזים או סינתזה נמוכה יותר של L-טריפטופן בזן E. coli CB149. אנא שקול להשתמש בזן E. coli BL21(DE)pLys-S או Rosetta (DE3)pLys-S אם לא זוהה ביטוי או כמויות נמוכות יותר של קומקומביננטי α2β2StTS מורכבים בג'ל SDS-PAGE.
  2. ביטוי של סוג פראי וצורה מוטנטית של α2β 2סנטTSמתחםב E. coli
    1. לגדל E. coli ביטוי זן מחסה המבנה הרצוי טרי סטרילי 50 מ"ל של מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם / mL אמפצילין. לגדל תאים לילה עם רועד ב 200 סל"ד ב 37 °C (50 °F).
    2. הוסיפו 5 מ"ל מתרבות התאים הליליים בבקבוק 2X 1000 מ"ל טרי וסטרילי המכיל 2% גליצל בתוספת אמפצילין (בקבוקון פרנבך 2.8 ליטר). הגדל את תרבית התאים עם רעידות ב 200 סל"ד ב 37 °C (50 °F).
    3. גרים ביטוי חלבון רקומביננטי כאשר OD600 מגיע 0.6-0.8 על ידי תוספת של IPTG בריכוז סופי של 0.4 mM ואחריו דגירה ב 30 °C בלילה עם רועד ב 200 סל"ד.
    4. לקצור את התאים על ידי centrifuging ב 4,000 x גרם ב 4 °C (50 °F) במשך 20 דקות. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את כדורי התא עם חיץ תמוגה קרה 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, המכיל 100 mM NaCl, 5 mM dith EDTA, ו 1 mM PMSF) לנפח סופי של 50 מ"ל חוצץ.
      הערה: תאים יכולים להיות מאוחסנים לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F) או לשמש באופן מיידי לטיהור חלבון. כדי לאחסן תאים, לפצל את ההשעיה התא לתוך 2 x 50 מ"ל צינורות חרוטיים חד פעמיים ולשמור על כדורי התא ב -80 °C (80 °F) עד שלב טיהור החלבון. הביטוי של צורה מוטנטית וסוג בר של α2β2StTS קומפלקס במרק LB מניב 125-150 מ"ג חלבון לליטר. שקול לשנות את קנה המידה של הפרוטוקול למעלה או למטה כדי למלא דרישות ספציפיות.
  3. טיהור של סוג פראי או צורה מוטנטית של α2β2StTS קומפלקס
    הערה: הפרוטוקול הבא נועד לטהר את הסוג הפראי או הצורה המוטנטית של α2β2Stמתחם TS תוך יום אחד, בהתאם לכישורים ולמאמצים. כדי לקצר את זמן הטיהור, יש לכלול את עמודת אי-הכללת הגודל במאגר לפני טיהור/ביטוי של חלבונים. טיהור של סוג פראי או מוטציה α2β2Stקומפלקס TS מתבצע על ידי טיהור דו-שלבי הכולל שבר אמוניום גופרתי וכרמומטוגרפיה של אי הכללת גודל. פרוטוקול זה מניב 60-100 מ"ג של קומפלקס טהור מ 1 ליטר של LB בינוני.
    1. לשבש את גלולה התא על ידי sonication באמצעות sonifier דיגיטלי עם 1/2 "קרן בדיקה (או ציוד דומה). בצע 20 מחזורים ב 80% מחזור החובה משרעת על אמבט מי קרח באמצעות דופק 10 ו 20 s מנוחה או עד הפרעה מלאה בתא.
    2. צנטריפוגות התא ליסייט ב 30,000 x גרם במשך 30 דקות ב 25 °C (5 °F). שאפו סופר-טבעי, והבטיחו שהכדור לא יפלט מהצינור. סנן את שבר העל המובהק עם מסנן 0.45 מיקרומטר בטמפרטורת החדר.
    3. להעריך את הנפח ההתחלתי של שבר supernatant המובהר. לאט להוסיף כמויות קטנות של אמוניום גופרתי בכל פעם, עד 20% רוויה הוא הגיע (11.51 גרם / 100 מ"ל). בצע את שבר אמוניום גופרתי ב 25 °C (5 °F). מערבבים בעדינות את הפתרון במשך 10 דקות ולהימנע בועות.
    4. צנטריפוגה ב 30,000 x g במשך 10 דקות ב 25 °C (70 °F). מעבירים את השבר 20% על-טבעי לבקבוקון נקי. בעדינות respend 20% שבר גלולה ב 20 מ"ל של חוצץ מדגם 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, המכיל 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, ו 2 mM dithiothreitol) ולהכין מדגם כדי להפעיל ג'ל SDS-PAGE. השלך את שבר 20% הכדור.
    5. להעריך את הנפח ההתחלתי של שבר 20% על-טבעי. מוסיפים אמוניום גופרתי ל-30% רוויה (5.94 גרם / 100 מ"ל), מערבבים תמיסה, נמנעים מבועות וצנטריפוגה כבעבר. מעבירים את השבר 30% supernatant לתוך בקבוקון נקי. יש תפחית בעדינות שבר גלולה של 30% ב-20 מ"ל של מאגר מדגם 2 והכן דגימה להפעלת ג'ל SDS-PAGE. השלך את שבר 30% הכדור.
    6. להעריך את הנפח ההתחלתי של שבר 30% על-טבעי. מוסיפים אמוניום גופרתי ב-40% רוויה (6.14 גרם / 100 מ"ל), מערבבים תמיסה, נמנעים מבועות וצנטריפוגה כבעבר. מעבירים את השבר 40% על-טבעי לבקבוקון נקי. יש צורך ב-40% חלקי גלולה ב-10 מ"ל של מאגר מדגם 2 והכן דגימה להפעלת ג'ל SDS-PAGE. זרוק את השבר 40% על-טבעי.
      הערה: להעריך את האיכות של αβStTS מורכב באמצעות דגימות של 30% ו 40% שברי supernatant וכדור בג'ל SDS-PAGE 25 12%. אם אתה מוודא כי כל מוטציה אחרת αβStTS קומפלקס הוא בשבר 40% supernatant, להמשיך עם 60% רוויה של אמוניום גופרתי (13.0 גרם / 100 מ"ל). עליקוט חלבון מטוהר מראש של α מטוהר מראש2β2 StTS קומפלקס ניתן לאחסן לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F) או לשמש באופן מיידי לטיהור חלבון על עמודת כרומטוגרפיה אי הכללת גודל (SEC).
    7. Microcentrifuge דגימת החלבון ב 10,000 x גרם, 20 דקות, 4 °C ולטעון את שבר supernatant על HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR טור מחובר כרומטוגרפיה נוזלי חלבון מהיר בקצב זרימה של 0.5 מ"ל min-1, בעבר שויעבד במאגר SEC (10 mM טריס-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, 5% גליצרול, 0.1 מ"מ פוספט פירידוקסלי).
      הערה: כדי לטהר כמויות גדולות של מורכב, לטעון מדגם 5 מ"ל ב 20-25 מ"ג מ"ל-1 על HiLoad 26/600 Superdex 200 pg עמודה בקצב זרימה של 1.5 מ"ל מינימום-1.
    8. להעריך דגימות שנאספו לאורך שבר אמוניום גופרתי ושברים שיא מהעמודה SEC על ג'ל SDS-PAGE 12% מוכתם עם כתם כחול מבריק קומאסי25.
    9. מרכז את הסוג הפראי או מוטציה α2β2StTS קומפלקס עם 15 מ"ל 100 kDa ניתוק יחידת מסנן צנטריפוגלי על ידי ספינינג ב 3,000 x גרם ב 4 °C (5 °F). העבר את החלבון המרוכז לצינור 2.0 מ"ל טרי ומיקרוצנטריפוגה (10,000 x גרם, 10 דקות, 4 °C (4 °F) כדי להסיר אגרגטים.
    10. לקבוע ריכוז חלבון24, להכין 0.5 מ"ל aliquots ב 20-25 מ"ג מ"ל-1,תווית, פלאש-להקפיא בחנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 °C (70 °F).

3. התגבשות אופטימלית לסוג פראי ולצורת מוטציה של מתחם α2β2StTS

הערה: מצב ההתגבשות הראשוני עבור α2β2StTS קומפלקס דווח בעבר בתנאים המכילים 12% PEG 8,000 ו 2 mM זרע22.

  1. הכן פתרונות מלאי לפני גיוס התגבשות כדי להשיג רבייה התגבשות טובה יותר. כדי לבצע מחקרים מבניים עם TS, לגבש חלבון עם Na+ או Cs+ יון באתר תיאום המתכת של קומפלקס הביאנזימה.
    1. הכן פתרון מלאי 5 מ"ל של זרע 200 mM במים ולשמור 500 aliquots μL ב -20 °C (50 °F).
    2. הכן פתרון מלאי 50 מ"ל של 30% (w / v) PEG 8000 במים ולשמור 25 mL aliquots בצנטריפוגה 50 מ"ל צלפתיות קונריפוגה חד פעמית ב 25 °C (70 °F).
    3. הכן פתרון מלאי 25 מ"ל של 1 M CSCl במים ולשמור על 25 °C (70 °F).
    4. הכן פתרון מלאי 25 מ"ל של 1 M NaCl במים ולשמור על 25 °C (70 °F).
    5. הכן פתרון מלאי 3x 50 מ"ל של 1 Bicine ו titrate עם CsOH או NaOH כדי לקבל פתרונות חוצצים ב pH 7.6, 7.8, ו 8.0. שמור 25 מ"ל aliquots ב 4 °C (70 °F).
  2. להפשיר מדגם של α2β2מתחם סנטTS (20-25 מ"ג מ"ל-1)על אמבט קרח.
  3. דגימת Microcentrifuge ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 25 °C (70 °F) כדי להסיר אגרגטים חלבון.
  4. מעבירים את השבר העל-טבעי המנוקה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי.
  5. ריכוז חלבון משוער24 ודלל עליקוט חלבון (150-200 μL) ב 15 מ"ג מ"ל-1 עם 50 mM bicine-CsOH או -NaOH, pH 7.8 המכיל 50 mM CSCl או NaCl. שמור על דגימת חלבון ב 25 °C (5 °F).
  6. הכן את פתרונות מאגר 500 μL עבור 3x 24-טוב יושב טיפה צלחות בצינורות microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל שכותרתו. פתרון המאגר מכיל 50 מ"מ ביצין-CsOH או -NaOH, 50 mM CSCl או NaCl, ו PEG 8000. לשנות את הריכוז של PEG 8000 (6-11%) על עמודות הצלחת ואת הריכוז של זרע (2-8 מ"מ) בשורות הצלחת. שנה pH של מאגר (pH 7.6, 7.8 ו- 8.0) עבור כל ערכה.
  7. כובע הצינורות והמערבולת במרץ לפחות 10 שניות. צינורות צנטריפוגות ב 10,000 x g במשך 10 דקות ב 25 °C (70 °F) כדי להסיר בועות. חלק פתרון חוצץ 500 μL בכל מאגר עם תווית.
  8. השתמש P-10 micropipette ולחלק 5 μL של פתרון חלבון ב 15 מ"ג מ"ל-1 לכל טיפה יושב היטב. הימנע בועות. הוסיפו 5 מיקרו-אל של כל תמיסה של מאגר הכתבים לטיפת החלבון. הימנע בועות במהלך ערבוב ולא pipette למעלה ולמטה כדי הומוגניזציה התערובת.
  9. מדביק את הצלחת עם סרט דבק שקוף ולאחסן את הצלחת ב 25 °C (5 °F). גבישים מופיעים תוך 2-5 ימים וגדלים לממדים המלאים שלהם תוך שבועיים.

4. איסוף נתוני עקיפה של קרני רנטגן ופתרון מבנה מורכב α2β2StTS

הערה: לפני איסוף נתוני עקיפה של קרני רנטגן, הכינו מראש פתרון קריו-הגנה לכל גביש. השתמש בתמיסת המאגר הספציפית להכנת 3 aliquots המכיל ריכוזים גוברים של dimethyl גופרתי בפתרון (10, 20, ו 30% v / v) ולידנד ספציפי (ים). דימתיל סולפוקסיד נמצאה כקריו-הגנה טובה יותר מאשר גליצריל, אתילן גליקול ו PEG 200-300.

  1. לקצור גביש יחיד גדול באמצעות cryoloop תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
  2. Pipette 2 μL של כל פתרון cryoprotectant המכיל את פתרון המשקעים בתוספת ריכוזים גבוהים יותר של dimethyl גופרתי וליגנד (s) על שקופית כיסוי חדשה.
  3. ברצף, להשרות crystal בכל טיפה ולתת את הקריסטל להשתוות במשך 30 s בתמיסה cryoprotectant.
  4. קירור פלאש של הגביש המוכה באמצעות זרם חנקן גזי ב-100 אלף -173 מעלות צלזיוס או טבילה בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך בדסקיות.
    הערה: מלאו דיואר קצף בחנקן נוזלי, קררו מראש דיסקית קריסטל, אחסנו גבישים באחסון הקריוגני דיואר, ושלחו גבישים לסנכרון באמצעות שולח יבש.
  5. המשך עם איסוף נתוני עקיפה של קרני רנטגן ב- -173 °C (70°F). הקלט נתוני עקיפה של קרני רנטגן באמצעות זמן חשיפה של 0.5-4.0 ו-0.5° תנודות. לסובב קריסטל 180-360°.
  6. עבדו את תמונות עקיפה של קרני הרנטגן עם iMosflm27 כדי ליצור קובץ השתקפות בקבוצת החלל המתאימה. בדרך כלל, α2β2גבישיסנטTS שייכים לקבוצת החלל C 121 (C2).
  7. הגדל יחד תצפיות מרובות של השתקפויות עםסקאלה 28, מיושם בחבילת המק"ס429.
  8. לפתור את המבנה של הרזולוציה הגבוהה α2β2StTS מורכב על ידי החלפה מולקולרית באמצעות MolRep30 ומודל חיפוש מתאים. בדוק את המודל ואת מפת צפיפות האלקטרונים בקוט31 לאחר פתרון מבנה מוצלח.
    הערה: ישנם מבנים גבישי TS רבים שהופקדו בבנק נתוני חלבון עם ליגנד (ים) שונים. לקבלת שלב החלפה מולקולרית טוב יותר וירידה בזמן המתאים למבנה הגביש החדש יותר, השתמש במודל החיפוש הטוב ביותר המכיל ליגנד (ים) של עניין. המשך עם עידון מבנה הגביש ב- CCP429,30 או פניקס31.
  9. לבצע התאמות ידניות לדגם באמצעות Coot32, ואחריו עידון אוטומטי עם Refmac29,33 או phenix.refine31,34. בנה ושכלל את הדגם הסופי על-ידי הפעלת סבבים איטרטיביים של בניית דגמים בקוקוט 32 ועידון אוטומטי.
  10. המשך עם תיאום ומבנה גורמי תצהיר באתר האינטרנט של מאגר נתוני החלבון.

תוצאות

טיהור α- ואיחודי המשנה βשלסינתאז טריפטופן
α-subunit (αstTS) ואת β-subunit (βStTS) של סלמונלה טיפוס טריפטופן סינתאז היו subcloned בווקטור PET SUMO שונה. איור 1A מציג תוצאות מייצגות של SDS-PAGE של שתי רצועות חזקות המתאימות ?...

Discussion

תכננו בהצלחה צורת מוטציה α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, ו- α2β2 מתחמי βS377A StTS למחקרי מתאם פונקציית מבנה. בתחילה, ניסינו לטהר את המוטציות באמצעות פרוטוקולטיהור קודם 22, אשר דורש α2β2סנטTS התגבשות מורכבת עם PEG 8000 וזרע במהלך הטיהור. למרות ש?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף ולהצהיר שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (GM097569).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL 10 kDa filterMilliporeSigmaUFC901024centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filterMilliporeSigmaUFC910024centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vialsCorningCLS430489Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-141microcentrifuge tubes
24-well Cryschem PlateHampton ResearchHR3-15824-well sitting drop plates
2-mercaptoethanolFisher ScientificO3446I-100Chemical
50 mL centrifuge conical tubesThermo Scientific12-565-270centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET BasicFisher Scientific13-636-AB15pH meter
AgaroseFisher ScientificBP1356-100Agarose gel
ammonium sulfateFisher ScientificA702-500Chemical
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5Antibiotic
Bacterial incubatorFisher ScientificS35836incubator.
BamHINew England BiolabsR0136SRestriction enzyme
bicineFisher ScientificBP2646100Chemical
Branson 450 Digital SonifierBrasonB450Cell disruptor
Cesium chlorideFisher ScientificBP210-100Chemical
Cesium hydroxideAcros OrganicsAC213601000Chemical
ChloramphenicolFisher ScientificBP904-100Antibiotic
dimethyl sulfoxideFisher ScientificD1391Chemical
dithiothreitolFisher ScientificBP172-5Chemical
DNA PolymeraseThermo ScientificF530SHF polymerase
dNTP SetInvitrogen10-297-018dNTPs set
EcoRINew England BiolabsR0101SRestriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acidFisher ScientificS311-100Chemical
Excella E25R Orbital ShakerEppendorf New BrunswickM1353-0004Orbital incubator
GE AKTA Prime PlusGE Healthcare8149-30-0004FPLC
Gel Extraction KitInvitrogenK210012DNA purification kit
GlycerolFisher ScientificG33-500Chemical
HindIIINew England BiolabsR0104SRestriction enzyme
His-Trap columnsGE HealthcareGE17-5255-015 mL Histrap column
imidazoleFisher ScientificO3196-500Chemical
IPTGThermo Fisher ScientificR0392Inducer
KanamycinFisher ScientificBP906-5Antibiotic
Kelvinator Series-100KelvinatordiscontinuedUltra low freezer
LB brothFisher ScientificBP1426-500Liquid broth
Luria Bertani agarFisher ScientificBP1425-2Solid broth
NaClFisher ScientificS271-500Chemical
NcoINew England BiolabsR0193SRestriction enzyme
Ni-NTA affinity beadsThermo Fisher ScientificR90115Ni-NTA agarose beads
PEG 8000Fisher ScientificBP233-100Chemical
phenylmethylsulfonyl fluorideFisher Scientific44-865-0Chemical
pyridoxal phosphateAcros OrganicsAC228170010Chemical
S-200 HRCytiva45-000-196Size exclusion column
SacINew England BiolabsR0156SRestriction enzyme
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-100Chemical
Sorvall RC-5B centrifugeSorvall8327-30-1004Floor cetrifuge
SpermineAcros OrganicsAC132750010Chemical
Superdex 200 prep gradeCytiva45-002-491Size exclusion column
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202SDNA liagse
TrisFisher ScientificBP152-500Chemical
Ubl-specific protease 1Thermo Scientific12588018SUMO Protease

References

  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
  3. Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
  4. Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
  5. Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
  6. Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
  7. Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
  8. Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
  9. Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
  10. Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
  11. Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
  12. Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
  13. Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
  14. Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
  15. Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
  16. Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
  17. Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
  18. Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
  19. Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
  20. Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
  21. Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
  22. Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
  24. Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
  27. Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, 271-281 (2011).
  28. Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 72-82 (2006).
  29. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  30. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 22-25 (2010).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 213-221 (2010).
  32. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, 486-501 (2010).
  33. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, 240-255 (1997).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, 352-367 (2012).
  35. Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
  36. Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved