PCR 突变体、克隆、表达、快速蛋白质纯化协议和色氨酸合成酶野生类型和突变形式的结晶

摘要

本文介绍了一系列连续的方法来表达和净化 沙门氏菌色氨酸 合成酶，使该协议成为一天中净化蛋白质复合物的快速系统。覆盖的方法包括现场定向突变、 大肠杆菌中的蛋白质表达、亲和色谱、凝胶过滤色谱和结晶。

摘要

对来自沙门氏菌的色氨酸合成酶（TS）双酶复合物（α 2 β 2 TS）进行了结构研究，以更好地了解其催化机制、同位素行为以及PPLP依赖酶中基质向产品酶转化的细节。在这项工作中，一种新的表达系统，以产生孤立的α和孤立的β子单位允许净化大量的纯子单位和α 2 β 2圣TS综合体从孤立的亚单位在2天内。净化由亲和度色谱进行，然后是亲和力标记的、硫酸铵沉淀和大小排除色谱（ SEC ）。为了更好地了解酶β部位的关键残留物的作用，在以前的结构研究中进行了现场直接突变。另一个协议被创建，以净化野生类型和突变体α 2 β 2圣TS综合体。使用硫酸铵分馏和 SEC 的简单、快速和高效的协议允许在一天内净化α₂β₂StTS 复合物。与之前使用 PEG 8000 和精氨酸沿净化协议对同一复合物进行净化的先前协议相比，本文中描述的两种净化协议都具有相当大的优势，使α₂β₂StTS 复合体结晶。野生类型和某些突变形式的结晶发生在略有不同的条件下，损害了使用PEG 8000和精子的一些突变体的净化。为准备适合X射线晶体学研究的晶体，我们努力优化结晶、晶体质量和低温保护。这里提出的方法通常应适用于净化色氨酸合成酶亚单位和野生类型和突变α₂β₂圣TS复合物。

引言

色氨酸合成酶（TS）双酶复合物（α 2 β 2）是一种异体酶，催化了细菌、植物和真菌^1、2、3中氨基酸L-色氨酸生物合成的最后两步。沙门氏菌肠血清病毒血清素（圣）引起人类和其他动物的严重胃肠道感染。由于人类和高等动物没有 TS（EC 4.2.1.20），S 的抑制。 二甲苯甲酸酯α 2 β 2 TS复合物（α 2 β 2StTS）已被探索为治疗隐孢子虫病和结核病^4，生殖器和眼部感染^5，以及农业中潜在的除草剂使用的潜在药物目标^6。 α - 亚单位通过形成一种氨基苯丙胺陶托默中间体，随后产生 GAP 和^{内脏3 ， 6}的碳碳粘结，促进甘油三磷酸盐（ GAP ）和内脏的碱性。β催化剂位点含有一种通过希夫碱与β-Lys87结合的磷酸杆菌（PLP）共因子分子，在酶β-子单位^3、7的反应过程中充当电子汇。β部位通过用惰性剂促进L-Serine侧链羟基的替代，使L-色氨酸和水分子在PLP依赖反应中。圣TS是研究多酶复合物^2、3中基质导流和同位素通信的长期模型。TS 的α和β子单元之间的双向同体通信对于同步催化步骤和防止 L-色氨酸合成³期间的内多尔释放是必要的。为了扩大这一努力，我们准备了几个突变体（β-Gln114Ala、β-Lys167Thr和β-Ser377Ala），用于进一步探索圣TS β子单位催化部位酶结构、机制和功能之间的关系。

伊迪丝·迈尔斯研究小组对α 2 β 2圣TS的催化机理进行了详细的研究。早期研究与本地大肠杆菌α 2 β 2TS复合体，重点是净化和定性孤立的α子单元^8，9，孤立的β子单元^10，11和重组α 2 β 2TS综合体从孤立的子单元^12。净化是通过硫酸铵沉淀、样品透析、DEAE-Sephadex色谱、透析和DEAE-Sephadex列¹²上的第二个色谱圆进行的。在另一个协议中，通过将澄清的细胞裂解物加载到DEAE-Sephadex柱上，然后在Sepharose 4B柱上加载色谱步骤、硫酸铵沉淀和透析^13，改进了同一复合物的净化。两种净化协议持续 4-5 天。大肠杆菌α 2 β 2TS复合结晶，但晶体当时不适合X射线衍射。

在一项新的研究中，重组和野生类型的S.型甲基_βα甲基重组α 2 β 2圣TS复合体在携带pEBA-10表达载体的大肠杆菌株CB149中过度表达。初步结晶和X射线衍射数据收集和分析的α 2 β 2圣TS综合体报告^14。然而，像_{α 2 β 2}圣TS晶体的长而细的针头损害了结构研究。为了收集更好的X射线衍射数据，另一个净化协议被描述为净化野生类型和突变形式的α 2 β 2圣TS复合^体15。净化是使用精氨酸和PEG 8，000进入澄清细胞解剖进行初始降水，并通过离心去除一个大的散沉淀物。含有大量_{α 2 β 2}StTS复合物的超高分数在4°C下储存了16-48小时，直到黄色晶体沉淀。晶体被洗净，并广泛透析对不同的缓冲。蛋白质复合物在含有硫酸铵的缓冲器中重新装覆，并透析^15。虽然蛋白质结晶取决于溶液中的蛋白质和沉淀物浓度，但很难监测、预测和繁殖溶液中其他突变形式的α₂β₂StTS 复合物的纯化。此协议具有不使用任何色谱方法的优势:然而，缺点是结晶、透析和重新装覆所需的较长的净化时间，通常需要 5-7 天。为了获得适合X射线数据采集的晶体，使用蛋白质浓度、温度、沉淀剂（PEG 4，000、6，000和8，000）和添加剂（CaCl 2、MnCl_2、ZnCl2、尸体、普氏精氨酸、精子或精氨酸）^的组合和变异对600多个结晶条件进行了评估。晶体具有更好的晶体形式，在含有 12% PEG 8，000 和 2mM 精子的条件下生长得更快。结晶在 25 °C 时比在 4、30 或 42 °C 更有利，并在¹⁵天内增长到最大尺寸。据报道，当时（1996-1999_{年）16、17、18、19、20、21}和许多其他结构已公布α 2 β 2个圣TS晶体结构。

在这里，主要目的是提出替代协议，以净化色氨酸合成酶和优化蛋白质结晶。目前的工作表明，在净化野生类型孤立的α子单元（α圣TS），孤立的β子单位（β圣TS），重建α 2 β 2圣TS综合体从孤立的亚单位，野生类型和突变形式的α 2 β 2圣TS综合体。 由于净化时间显著缩短，结晶和低温保护得到优化，与以往协议相比，其优势相当大。在这项工作中设计的α 2 β 2StTS复合体的突变形式已经结晶，接近野生类型形式所用的条件。然而，为了获得质量足够的大单晶，在接近原子分辨率的结构确定方面，必须进行精细的结晶优化。迄今为止，蛋白质数据库（PDB）中存存的色氨酸合成酶晶体结构有134个，分别占细菌、古生物和真核生物晶体结构的101个、31个和2个晶体结构。不错的是，73个结构属于S.肠血清石，5个晶体结构的α 2 β 2圣TS综合体有分辨率限制高于1.50安格斯特罗姆。毫不奇怪，我们的研究小组准备了 4 分 5 秒（PDB ID:5CGQ 在 1.18 + ， 4HT3 在 1.30 +， 4HPJ 在 1.45 +， 6DZ4 在 1.45 + 分辨率）。_{α 2 β 2}圣TS 复合体的突变形式的精炼晶体结构预计将为了解 L-色氨酸合成中所涉及的基本氨基酸残留物所起的机制和作用提供新的见解。

研究方案

1. 快速协议，以净化α和β子和重组α 2 β 2圣TS 综合体

1. 脱氧核糖核酸分包成 pETSUMO 表达载体
   1. 获得翻译耦合基因（trpA和trpB）编码 α-和 β- 从 细菌沙门氏菌肠 血清石 血清石 克隆在pEBA-10表达载体²²的色氨酸合成酶的亚单位。使用 pEBA-10 载体作为 DNA 模板。
      注:或者，下面列出的引物可用于放大 来自沙门氏菌肠 血清素 血清素血清素 基因组的两个基因。所有分子生物学步骤都遵循分子克隆:实验室手册²³中描述。
   2. 使用聚合酶链反应 （PCR） 单独放大α子联盟（αStTS） 的全长多核苷酸序列，并αStTS-FW-Bam 和α入门α圣TS-Rev-Eco 和全长序列的β子联盟 （β圣TS） 与引物β圣TS-FW-Bam 和β圣TS-Rev-欣德。使用约 55 °C 的熔化温度和 2 分钟的聚合酶延长时间。
      1. 使用高保真DNA聚合酶（例如 Phusion）和制造商的协议来放大 DNA 序列。对于 50 μL PCR 反应添加 34 μL 无核糖酶水，10 μL 的 5 倍反应缓冲， 1 μL 的 10 mM dNTP， 1 μL 的 10 μM 前进引物， 1 μL 的 10 μM 反向引物， 1 μL 的模板 DNA （200 ng）， 1.5 μL 的 DMSO， 0.5 μL 的 Phusion DNA 聚合酶。
      2. 对于 PCR 程序，请使用热启动（98 °C 时为 180 秒），然后是 30 个放大周期（30 秒在 98 °C，30 秒在 55 °C 时为 120 秒，在 72 °C 处为 120 秒），最后一个扩展（300 秒在 72 °C）。
         注:迭形序列分别对应于 BamHI、Eco RI、BamHI 和欣德III 限制站点。通过添加额外的碱基（小写序列），增强了接近 PCR 片段术语的酶效率。
         α圣茨 - 弗 - 巴姆: 5 + cgcggatcc阿特加查塔卡 - 3+
         α圣茨 - 雷夫 - 生态: 5 + ccg加特克塔格格特克 - 3 +
         β圣茨 - Fw - bam: 5 + cgcggatcc阿特加卡actctcaac - 3+
         β圣茨 - 雷夫 - 欣德: 5 + - ccc阿格特· 塔加特克 - 3+
   3. 将PCR产品装载在6 V/cm的1x TAE缓冲器（40 mM Tris、20mM醋酸和1m EDTA）中0.8%的玫瑰凝胶上，凝胶提取感兴趣的DNA带，并根据制造商的指示使用硅珠套件净化PCR片段。
      1. 在37°C下，将每个DNA片段中至少200 ng与制造商推荐的适当限制酶和条件一起消化2小时。
      2. 要设置 50 μL 限制消化反应，请添加 34 μL 无核糖水、10 μL DNA （200 ng）、5 μL 10 倍反应缓冲器、0.5 μL 限制酶 1 和 0.5 μL 限制酶 2。
      3. 将消化产品加载到 6 V/cm 的 1x TAE 上的 0.8% 的玫瑰凝胶上，使用商业套件将凝胶提取物和凝胶净化消化片段。
   4. 将每个片段单独分入 大肠杆菌 表达改性载体 pET SUMO 中，以前用适当的酶和凝胶净化消化。
      注:此矢量是商业 pET SUMO 的修改版本。该载体已优化为限制酶克隆。pET28b 载体（ Bam HI 、 EcoRI 、 萨克 I 、 SalI 、 欣德三世、 不是我和 XhoI ）的多克隆站点（ MCS ）入 pET 相扑克隆站点。该载体包含一个N-终端6x-Histidine标签在框架与小育碧素样修饰蛋白（SUMO）和多个克隆位点。
   5. 在 25 °C 下，用 T4 DNA 韧带将 100 ng 的改性 pET SUMO 和 50 ng 的 PCR 片段配上 2 小时。
   6. 将构建的质粒转化为大肠杆菌株DH10B α细胞的称职细胞。含有 35 μg/mL卡纳霉素的LB 阿加板上的板细胞。在 37 °C 下将板倒置过夜。
   7. 从每个转化中选择一个单一的菌落，准备超纯质粒DNA，并执行DNA测序，以验证 α圣TS 或β圣TS 是用 N 端 His6-SUMO 标签在框架中克隆的。
      注:准备细胞培养的甘油库存（将细胞悬浮在无菌甘油最终浓度的16%）中转动细胞悬浮，并长期储存在-80°C。
   8. 将表达质粒SUMO-α圣TS 或相扑β圣TS 单独转换为大肠杆菌表达应变罗塞塔 （DE3） plysS的称职细胞，并采用基于 T7 的促进器系统。将重组细胞镀在卢里亚·贝尔塔尼（LB）的茄板上，含有35微克/mL卡纳米辛和氯霉素。在 37 °C 下将板倒置过夜。
   9. 成功形成殖民地后，选择一个单一的殖民地（没有任何卫星殖民地），并分散在5兆L的LB介质与两种抗生素。培养细胞在 37 °C 下以 200 rpm 的速度摇晃过夜。
      注:准备细胞培养的甘油库存，长期储存在-80°C或立即用于重组蛋白质表达。
2. 苏莫 -α圣Ts 和相扑 - β圣Ts 子单位的表达
   1. 接种新鲜 大肠杆菌 菌株罗塞塔 （DE3） plysS 细胞窝藏苏莫- α圣TS 或相扑 - β圣TS 构建或刮一些冷冻甘油库存到 50 mL 培养 LB 包含 35 μg/mL 卡纳霉素和氯霉素。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度在夜间生长细胞。
   2. 第二天早上，在新鲜无菌的 2x 1000 mL LB 中接种 5 mL 的隔夜细胞培养物，其中含有 2% 甘油外加卡纳霉素和氯霉素（2.8 L Fernbach 烧瓶）。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度进行摇晃，培养细胞培养。
      注:在LB汤中表达SUMO-α圣TS或相扑-β圣TS每升产生125-150毫克标签蛋白。考虑上下扩展协议以满足特定需求。
   3. 当OD₆₀₀ 达到0.6-0.8时，通过添加异丙基β-D-1硫高非他明（IPTG），在0.4mM的最终浓度下诱导重组蛋白表达，然后在30°C的夜间孵化，在200转/分处摇晃。
   4. 在 4 °C 下以 4，000 x g 离心收集细胞，20 分钟。取出超高分子，用冷裂解缓冲器1（50 mM Tris-Cl，pH 8.0，含500m NaCl，5%甘油，10mM 2-甲醇，和40mM imidazole-Cl）重新悬浮细胞颗粒，最终体积为60mL。
      注:细胞可长期储存在-80°C或立即用于蛋白质纯化。要储存细胞，将细胞悬浮物拆分成 2 x 50 mL 一次性离心机锥形管，并将细胞颗粒保持在 -80 °C，直到蛋白质净化步骤。
3. 净化 α- 和色氨酸合成酶的β子单位
   注:除非另有说明，否则所有程序均应在 4 °C 下执行。为了减少纯化时间，在蛋白质纯化之前或重组蛋白表达过程中，将Ni-NTA的镍电压亲和力柱和大小排除列等于缓冲。
   1. 使用带有 1/2"喇叭探头（或类似设备）的数字声震器进行声波，从而破坏细胞颗粒。使用 10s 脉冲和 20s 休息或直到完全细胞中断，在冰水浴上以 80% 振幅值班周期执行 20 个循环。
   2. 将细胞以 30，000 x g 离心，30 分钟。吸气超高，确保颗粒不会从管子中脱落。在冰上用 0.45 μm 过滤装置过滤超高纳坦，并将其流过 15 mL Ni-NTA 的镍电荷亲和力柱，在裂解缓冲器 1 中预先平衡。
      注:每个Ni-NTA阿加罗斯柱将用于净化相扑-α圣TS或相扑-β圣TS重组蛋白。净化可以在连接到快速蛋白质液相色谱系统的 2x 5 mL Ni-NiTA 列中执行。一次纯化一种蛋白质。
   3. 在 100 mL 裂解缓冲 1 中清洗 Ni-NTA 阿加罗斯柱。
   4. 继续一个80mL单步洗礼与缓冲E1（25 mM特里斯-Cl缓冲器，pH 7.8，包含200 mM NaCl，5%甘油，和400mM imidazole-Cl）。
      注:SUMO 蛋白酶耐受高达 300 mM 的 imidazole，离心滤芯装置的膜耐受性高达 100 mM imidazole。我们建议进行硫酸铵降水，以去除大量的伊米达佐尔，减少净化时间，而不是稀释蛋白质样品和浪费时间与蛋白质浓度。
   5. 评估超高分数的初始体积。一次慢慢加入少量硫酸铵，直到达到 25 °C 的 60% 饱和度（39.48 克/100 mL）。轻轻搅拌溶液 30 分钟，避免冒泡。离心机在 10，000 x g 为 15 分钟。
   6. 小心地吸气并丢弃超高分。将颗粒分数重新消耗在 20 mL 的样品缓冲区（20 mM Tris-Cl、pH 8.0、300 mM NaCl 和 5% 甘油）中。
   7. 对于使用 SUMO 蛋白酶的 SUMO 标签，请以 1 : 1000 的比例从 糖核酸酯e 中加入 Ubl 特异性蛋白酶 e 的重组片段，并在 4 °C下孵育混合物 2 小时。
   8. 在 25 °C 下以 10，000 x g 的速度将消化产品离心 20 分钟，以在通过亲和色谱柱加载样品之前去除蛋白质聚合物。
   9. 删除通过 15 mL Ni-NTA agarose 柱上的 20 mL 重悬样品的 His6-SUMO 标签的痕迹，该列以前在裂解缓冲 1 中平衡。
   10. 收集包含未标记的圣 TS或β圣TS α的直通样本。
   11. 在缓冲 1 的 20 mL 中清洗 Ni-NTA 列，收集未标记 的α圣TS 或β圣TS 的剩余部分。
   12. 在 4 °C 下以 3，000 x g 的速度旋转，将每个子单元分别集中到 15 mL 10 kDa 切断离心滤芯单元中。 将浓缩蛋白转移到新鲜的 2.0 mL 管和微中心（10，000 x g，10 分钟，4 °C）以去除聚合物。确定蛋白质浓度^24，准备1mL的aliquot在20-25毫克^mL-1，标签，闪存冻结在液氮，并储存在-80°C。
       注:预纯蛋白样品可长期储存在-80 °C下，或立即用于大小排除色谱柱（SEC）上的蛋白质纯化。
   13. 以蛋白质阿利奎特（20毫克）和微中心在10，000 x g 10分钟删除聚合之前SEC。
   14. 在尺寸排除色谱柱（例如 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR）上加载样品，以 0.5 mL^min-1的流动速率连接到快速蛋白质液相色谱，以前在 SEC 缓冲区（10 m M Tris-Cl） 中均等化， pH 7.8， 100 m M NaCl， 5% 甘油， 0.1 m 磷酸二醇）。
       注:为了净化更多的孤立α圣TS 或β圣TS 子组，并减少 SEC 轮数，请在尺寸排除色谱柱上以 20-25 毫克 mL^-1在 5 mL 样品上加载 5 mL 样品，流量为 1.5 mL 最小^-1。
   15. 评估α圣TS 或β圣TS 在峰值分数的质量使用 12% 或 15% 的硫酸钠硫酸盐凝胶电泳 （SDS-PAGE）， 分别沾染库马西辉煌的蓝色污渍²⁵.
   16. 用新鲜的15mL 10 kDa切断离心滤芯单元浓缩蛋白质，确定蛋白质浓度^24，在20-25毫克^mL-1下制备0.5mL的alquot，标签，液氮中的闪光冻结，并储存在-80°C。
4. 从α_和β单位净化α 2 β ₂圣TS 综合体
   注:在 SEC 缓冲区（10 mM Tris-Cl，pH 7.8，100 mM NaCl，5% 甘油，0.1 m M 磷酸 pyridoxal）中等价大小排除色谱列（Sephadex S-200 HR 或 Superdex 200 pg）。
   1. 为了从α和β单位中净化_野生型α 2 β ₂StTS 复合体，在 4 °C 下解冻α圣TS 和β圣TS 子单位的浓缩样品。
   2. 结合异丙酸（1.2 α圣TS: 1.0 β圣TS 摩尔比率），并在 4 °C 下孵育 1 小时。
      注:为了确保大多数β圣TS将纳入α 2 β 2圣TS综合体，需要超额的*ST+
   3. 通过微浓缩去除蛋白质聚合物（10，000 x g，10 分钟，4 °C）。
   4. 将已澄清的超纳特加载到大小排除列中。
   5. 评估α圣TS 或β圣TS 在峰值分数的质量使用 12% 或 15% 的硫酸钠硫酸盐凝胶电泳 （SDS-PAGE）， 分别沾染库马西辉煌的蓝色污渍²⁵.
   6. 确定蛋白质浓度^24，在 15-20 毫克 mL -1 中准备 250-1000 微升的 aliquot，在液氮中闪冻结，并储存在 -80 °C 下。

2. 净化_{α 2 β 2}圣TS复合体的野生类型或突变形式

1. 现场定向突变， 准备突变β圣Ts
   1. 在聚合酶链反应的两步过程中，使用结构pEBA-10表达载体²² 作为DNA模板，在 β链TS多核苷酸序列中引入特定点突变。
      注:此协议可用于从沙门氏菌色氨酸合成酶中引入α或β子单位中的单点突变。对于额外的，新的寡核苷酸引物包含理想的突变必须适当设计。在本工作中，列出了 Q114A、βK167T、β S377A β突变。
   2. 使用一对核苷酸引物 TS-FW-NcoI/Q114A-Rev、TS-FW-NcoI/K167T-Rev 和 TS-FW-NcoI/S377A-Rev 执行 PCR 反应，分别生成片段 A1、B1 和 C1。
      注:寡核苷酸 TS-NcoI-FW 和 TS-SacI-Rev 分别在 pEBA-10 载体中克隆的 *StTS 多核苷酸序列的上游和下游退火。
      1. 使用高保真DNA聚合酶（例如 Phusion）和制造商的协议来放大 DNA 序列。对于 50 μL PCR 反应，添加 34 μL 无核糖酶水， 10 μL 的 5 倍反应缓冲，1 μL 的 10 mM dNTP，1 μL 的 10 μM 前引物，1 μL 的 10 μM 反向引物，1 μL 的模板 DNA （200 ng），1.5 μL 的 DMSO，0.5 μL 的 DNA 聚合酶。
      2. 对于 PCR 程序，请使用热启动（98 °C 时为 180 秒），然后是 30 个放大周期（30 秒在 98 °C，30 秒在 55 °C 时为 120 秒，在 72 °C 处为 120 秒），最后在 72°C 处使用 300 秒。
         注:所有分子生物学步骤都遵循分子克隆:实验室手册^23。虽然小写序列对应于限制位点，但粗体序列和通要序列对应于突变。
         Ts - fw - ncoi: 5 '- 卡 · 特特 · 卡卡 · 阿卡 · 阿加 · 阿加 · 卡 · 塔格- 3'
         Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
         K167t - Rev: 5 '- Ctc Gtt 阿卡 Ggc Atc Tgt 标签 Cgt Agc Gga Gcc - 3'
         S377a - Rev: 5 '- c Ttt Atc Tcc Gcc Gcc AgAg G ga g att Gac CAC CAG - 3'
   3. 使用一对核苷酸引物 TS-Rev-SacI/Q114A-FF、TS-Rev-Saci/K167T-FF 和 TS-Rev-Saci/S377A-FF 执行 PCR 反应，以生成片段 A2、B2 和 C2。
      Ts - Rev - saci （5'- tta tgc gct Ggc Ggc Ttt 猫 Ggc Tga G - 3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167t - ff 5 '- Ggc Tcc Gct Acg Cta 阿卡 加特 Gcc t agt Aac gag - 3'
      S377A-FF 5'-CTG GTGCT AAT CTC GCT GGC GGA GAT AA G-3'
   4. 使用聚合酶链反应单独放大部分片段。使用 55 °C 的熔化温度和 2 分钟的聚合酶延长时间。
   5. 要执行第二轮PCR反应，请将上述PCR产品加载在 1x TAE 上的 0.8% 的玫瑰凝胶上，以 6 V/cm 的速度加载凝胶，凝胶提取物和凝胶净化感兴趣的片段。
      1. 将片段 A1/A2、B1/B2 和 C1/C2 分别混合在等量下，在 96 °C 下加热混合物 10 分钟，在 25 °C 下将退火。 根据制造商的协议，用高保真聚合酶和脱氧核糖核苷酸延长重组链。
   6. 要生成全长突变DNA片段的高拷贝数，添加寡头底漆 TS-FW-NcoI 和 TS-Rev-SacI 以执行第二个 PCR。
   7. 在 6 V/cm 的 1x TAE 缓冲器中装载 0.8% 的 PCR 产品，凝胶提取感兴趣的 DNA 带，凝胶净化 PCR 片段，并在制造商建议的适当缓冲和条件下，在 37 °C 下进行适当的限制消化 2 小时。
      1. 在37°C下，将每个DNA片段中至少200 ng与制造商推荐的适当限制酶和条件一起消化2小时。 要设置 50 μL 限制消化反应，请添加 34 μL 无核糖水、10 μL DNA （200 ng）、5 μL 10 倍反应缓冲器、0.5 μL 限制酶 1 和 0.5 μL 限制酶 2。在 6 V/cm 的 1x TAE 缓冲器中，在 0.8% 的气化物上加载消化产品，并净化消化的 PCR 片段。
   8. 根据制造商的建议，文摘 200 ng pEBA-10 结构与限制酶 NcoI 和 SacI。将消化产品加载在 6 V/cm 的 1x TAE 缓冲器中，将消化产品加载到 0.8% 的藻糖凝胶上，将带通讯员切除到载体上，并凝胶净化消化的载体。
   9. 利盖特100ng的载体与50ng的PCR片段，以前消化和纯化，与T4DNA韧带2小时在25°C。 将构建的质粒转化为称职细胞 大肠杆菌 株DH10B 细胞。LB Agar 板上的板细胞含有 50 μg/mL 安培素。 在 37 °C 下将板倒置过夜。
   10. 从每个细胞转化中挑选一个菌落（没有任何卫星菌落），并将其分散在含有安培林的 5 mL LB 介质中。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度在夜间生长细胞。 从每个工程结构中准备 10 μg 的超纯质粒 DNA。准备细胞培养的甘油库存（将细胞悬浮在无菌甘油最终浓度的16%）中转动细胞悬浮，并长期储存在-80°C。
   11. 执行DNA测序，以确认编码色氨酸合成酶的α和β子单位的全长序列。确认每个单个突变，并丢弃任何含有不良随机突变的质粒结构。本研究中使用的寡核苷酸引物如下所列。
       TS-1F: 5'-阿特加卡ACTCCAC-3'
       TS-1R: 5'-加特加卡卡塔克-3'
       TS-2F: 5'-卡格特克加加克-3'
       TS-3F: 5'-加特加特卡-3'
       TS-4F: 5'-CTG卡特加查克-3'
       TS-5F: 5'-CGTTGCATCATTG-3'
       注:β子线多核苷酸序列上的寡核苷酸引物 TS-1F、TS-1R、TS-2F 和 TS-3F 退火剂（GenBank 加入代码:CP051286.1）。引物 TS-4F 和 TS-5F 退火剂对α子的多核苷酸序列（GenBank 加入代码:CP053865.1）。
   12. 使用每个质粒结构的200 ng（pEBA-10-β Q114A，pEBA-10-β K167T，和pEBA-10-β S377A）来改造大肠杆菌表达菌株CB149的称职细胞，缺乏trp operon^26。成功形成菌落后，选择一个单一的菌落，在含有50μg/mL安皮西林的LB介质的5ml中生长细胞。细菌孵化器中的培养在37°C过夜。准备细胞培养的甘油库存，长期储存在-80°C或立即用于重组蛋白质表达。
       注:单点突变在α或β子单位从 沙门氏菌硫化物 色氨酸合成酶可能会损害酶功能或低合成L-色氨酸在 大肠杆 菌菌株CB149。请考虑使用 大肠杆菌 菌株 BL21 （DE）plys-S 或罗塞塔 （DE3）plys-S，如果没有表达或较低的重组量α₂β₂圣TS 复合体在 SDS-PAGE 凝胶中检测到。
2. 大肠杆菌中野生类型和变异形式的表达α₂β₂圣TS 复合体
   1. 生长 大肠杆菌 表达应变窝藏在新鲜和无菌的50mLLB介质含有50微克/mL安培素的理想结构。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度在夜间生长细胞。
   2. 在新鲜无菌的 2x 1000 mL LB 中加入 5 mL 的隔夜细胞培养物，其中含有 2% 甘油加安培素（2.8 L Fernbach 烧瓶）。在 37 °C 下以 200 rpm 的速度进行摇晃，培养细胞培养。
   3. 当OD₆₀₀ 达到0.6-0.8时，通过在0.4 mM的最终浓度添加IPTG，然后在30°C的夜间孵化，在200 rpm处摇晃，诱导重组蛋白表达。
   4. 在 4 °C 下以 4，000 x g 离心的方式收集细胞，20 分钟。取出超高分子，用冷裂解缓冲器 2（50 mM Tris-Cl、pH 7.80、包含 100 mM NaCl、5 mM 二甲酸酯、1 mM EDTA 和 1 mM PMSF）重新悬挂细胞颗粒，最终体积为 50 mL 缓冲器。
      注:细胞可长期储存在-80°C或立即用于蛋白质纯化。要储存细胞，将细胞悬浮物拆分成 2 x 50 mL 一次性离心机锥形管，并将细胞颗粒保持在 -80 °C，直到蛋白质净化步骤。LB肉汤中2α β 2圣TS复合物的突变和野生类型形式的表达每升产生125-150毫克蛋白质。考虑向上或向下扩展协议以满足特定需求。
3. 净化野生类型或突变形式的α₂β₂圣TS 复合物
   注:以下协议旨在净化重组α的非标记重组野生类型或突变形式₂β₂StTS 综合体在 1 天内，取决于技能组合和努力。为了减少纯化时间，在缓冲器中平衡大小排除列，以缓冲先前的蛋白质纯化/表达。纯化野生类型或突变α₂β₂StTS 复合物通过两步净化进行，包括硫酸铵分馏和大小排除色谱。该协议从 LB 介质的 1 L 中产生 60-100 毫克纯复合物。
   1. 使用带有 1/2"喇叭探头（或类似设备）的数字声震器进行声波，从而破坏细胞颗粒。使用 10s 脉冲和 20s 休息或直到完全细胞中断，在冰水浴上以 80% 振幅值班周期执行 20 个循环。
   2. 在 25 °C 下将细胞以 30，000 x g 为离心解剖 30 分钟。 吸气超高，确保颗粒不会从管子中脱落。在室温下用 0.45 μm 过滤器过滤已澄清的超高分数。
   3. 评估澄清的超高分数的初始体积。一次慢慢加入少量硫酸铵，直到达到20%饱和度（11.51克/100ml）。在 25 °C 下进行硫酸铵分馏。 轻轻搅拌溶液 10 分钟，避免冒泡。
   4. 离心机在 30，000 x g 10 分钟在 25 °C. 将 20% 的超高分数转移到干净的烧瓶中。在 20 mL 的样品缓冲器 2（50 mM Tris-Cl，pH 7.80，包含 100 mM NaCl、1 mM EDTA 和 2 mM 二甲基三醇）中轻轻重复 20% 颗粒分数），并准备样品以运行 SDS-PAGE 凝胶。丢弃 20% 颗粒分数。
   5. 评估 20% 超高分数的初始体积。加入硫酸铵达到30%饱和度（5.94克/100ml），搅拌溶液，避免气泡，和离心机一样。将 30% 的超高素分数转移到干净的烧瓶中。轻轻地在 20 mL 的样品缓冲 2 中重复 30% 的颗粒分数，并准备样品以运行 SDS-PAGE 凝胶。丢弃 30% 颗粒分数。
   6. 评估 30% 超高分数的初始体积。在达到 40% 饱和度时加入硫酸铵（6.14 克 / 100 mL），搅拌溶液，避免气泡，像以前一样离心机。将 40% 的超高素分数转移到干净的烧瓶中。轻轻地在 10 mL 的样品缓冲器 2 中重复 40% 颗粒分数，并准备样品以运行 SDS-PAGE 凝胶。丢弃 40% 的超高分数。
      注:使用 12% SDS-PAGE 凝胶 25 中的 30% 和 40% 超纳坦和颗粒分数样本，评估+StTS 复合物的质量。如果您验证任何其他突变+stTS 复合物处于 40% 超高值分数，则继续执行硫酸铵 60% 饱和度（13.0 g / 100 mL）。预纯化α 2 β₂ StTS 复合物的预纯蛋白小品可长期储存在 -80 °C 下，或立即用于大小排除色谱柱 （SEC） 上的蛋白质纯化。
   7. 微浓缩蛋白质样品在10，000 x g，20分钟， 4 °C，将超高分子分数加载到 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 列上，该柱以 0.5 mL^min-1的流速连接到快速蛋白质液相色谱，以前在 SEC 缓冲区（10 mM Tris-Cl，pH 7.8， 100 mM NaCl， 5% 甘油， 0.1 m 磷酸酯）。
      注:要净化大量复杂，请在 HiLoad 26/600 Superdex 200 pg 列上以 20-25 毫克 mL^-1 的流量将 5 mL 样品加载到 1.5 mL 最小^-1上。
   8. 评估沿硫酸铵分馏和峰值分数从SEC列收集的样本在12%SDS-PAGE凝胶沾染库马西辉煌的蓝色污渍^25。
   9. 将 野生类型或突变体 α₂β₂StTS 复合体集中，在 4 °C 下旋转 3，000 x g， 配备 15 mL 100 kDa 切断离心滤芯单元。 将浓缩蛋白转移到新鲜的 2.0 mL 管和微中心（10，000 x g，10 分钟，4 °C）以去除聚合物。
   10. 确定蛋白质浓度^24，准备0.5mL的aliquots在20-25毫克^mL-1，标签，液氮的闪光冻结，并储存在-80°C。

3.α 2 β 2StTS复合体野生类型和突变形态的优化结晶

注_{:α 2 β 2}圣TS综合体的初始结晶条件之前报告的条件包含12%PEG 8，000和2mM精子^22。

1. 在结晶检测之前准备库存解决方案，以实现更好的结晶可重复性。要与 TS 进行结构研究，在双酶复合物的金属协调部位用 Na⁺ 或^{Cs +} 离子结晶蛋白质。
   1. 在水中准备 200 mM 精氨酸的 5 mL 库存溶液，并将 500 μL 的 aliquot 保持在 -20 °C。
   2. 在水中准备 30% （w/v） PEG 8000 的 50 mL 库存溶液，并在 25 °C 下将 25 mL 的 aliquot 放到 50 mL 一次性离心机锥形烧瓶中。
   3. 在水中准备 1 M CSCl 的 25 mL 库存溶液，并保持在 25 °C。
   4. 准备 25 mL 库存溶液 1 M NaCl 在水中，并保持在 25 °C。
   5. 准备 1 M Bicine 的 3x 50 mL 库存解决方案，并与 CsOH 或 NaOH 一起点缀，以 pH 7.6、7.8 和 8.0 获得缓冲解决方案。将 25 mL 的阿利报价保持在 4 °C。
2. 在冰浴中解冻α₂β₂圣TS 综合体 （20-25 毫克 mL^-1）的样本。
3. 微中心样品在 10，000 x g 10 分钟在 25 °C 下去除蛋白质聚合物。
4. 将清除的超高位分数转移到干净的微中心管中。
5. 估计蛋白质浓度²⁴ 和稀释蛋白质 aliquot （150-200 μL） 在 15 毫克 mL^-1 与 50 mM bicine-CsOH 或 -NaOH， pH 7.8 包含 50 mM CsCl 或 NaCl.将蛋白质样本保持在 25 °C。
6. 在无菌 1.5 mL 标记的微中心管中为 3x 24 井坐落板准备 500 μL 储液池解决方案。储层溶液包含 50 mM 二甲基辛-CsOH 或 -NAOH、50 mM CsCl 或 NaCl 以及 PEG 8000。改变板柱上 PEG 8000（6-11%）的浓度和板行上的精子 （2-8 mM） 浓度。每套更换缓冲 pH 值（pH 7.6、7.8 和 8.0）。
7. 将管子和漩涡大力封顶至少 10 秒。离心管在10，000 x g 为10分钟在25°C去除气泡。 在每个标记的储层中分配 500 μL 缓冲溶液。
8. 使用P-10微管，以每坐一滴15毫克^-1 微管分配5微升蛋白质溶液。避免冒泡。在蛋白质滴中加入每个通讯员储液的 5 μL。在混合过程中避免气泡，不要上下移液器使混合物均质化。
9. 用透明胶带胶带粘合盘子，并将板材存放在 25 °C 下。 晶体在2-5天内出现，并在两周内长到其全部尺寸。

4. X 射线衍射数据收集和α₂β₂StTS 复杂结构解决方案

注:在X射线衍射数据收集之前，请提前为每个晶体准备冷冻保护液。使用特定的储液库溶液制备 3 个含有溶液中含增加浓度的二甲基硫氧化物（10、20 和 30% v/v）和特定配体 （s）。发现二甲基硫氧化物比甘油、乙二醇和PEG 200-300更好的低温保护剂。

1. 在立体显微镜下使用低温收集一个大的单晶。
2. Pipette 2 μL 的每个低温保护溶液包含降水溶液加上更高浓度的二甲基硫氧化物和配体 （s） 到一个新的封面幻灯片。
3. 依次浸泡在每滴中 ，让晶体在低温保护液中均等于 30s。
4. 在 -173 °C （100 K） 下使用气态氮流闪冷低温保护晶体，或浸入液氮中，以便长期储存在冰球中。
   注:用液氮填充泡沫德瓦尔，预冷水晶冰球，将晶体储存在低温存储德瓦尔，并使用干托运器将晶体运送到同步器。
5. 在-173 °C下进行X射线衍射数据收集。 使用 0.5-4.0 的曝光时间和 0.5° 振荡记录 X 射线衍射数据。旋转晶体 180-360°。
6. 使用 iMosflm²⁷处理 X 射线衍射图像，以在适当的空间组中生成反射文件。一般来说，α 2 β 2圣TS晶体属于空间组C121（C2）。
7. 将与 Scala²⁸的多个反射观测值一起缩放，在 CCP4 包²⁹中实施。
8. 使用 MolRep³⁰和适当的搜索模型进行分子替换，解决高分辨率α 2 β₂StTS 复合体的结构。在成功的结构解决方案后，检查 Coot³¹中的模型和电子密度图。
   注:有许多 TS 晶体结构沉积在蛋白质数据库中，具有不同的配体。为了更好的分子替换步骤和缩短时间适合较新的晶体结构，请使用包含感兴趣配体的最佳搜索模型。进行CCP4^29、30或Phenix³¹的晶体结构精炼。
9. 使用 Coot³²对模型进行手动调整，然后自动改进与参考^29，33或 phenix.精炼^31，34。通过在 Coot³²中运行迭次模型构建和自动改进，构建和改进最终模型。
10. 继续蛋白质数据库网站上的坐标和结构因素沉积。

结果

色氨酸合成酶的α和β子单位的净化
沙门氏菌斑马素合成酶的α子联盟（+StTS） 和β子联盟 （βStTS） 在修改后的 pET SUMO 载体中进行了分克隆。图1A显示了两个强频段的代表性SDS-PAGE结果，对应于他的6-SUMO-α圣TS（车道+ON）和他的6-SUMO-β圣TS（车道+ON）融合蛋?...

讨论

我们成功设计了变异体形式α₂β₂ β114A、α₂β₂ 0+K167T 和α₂β₂ S377A + StTS 复合体，用于结构功能相关性研究。最初，我们尝试用以前的纯化协议²²净化突变体，这需要α 2 β 2圣TS复合结晶与PEG 8000和精子在净化过程中。虽然结晶率取决于突变形式和复杂物在溶液中的浓度，但很难预测晶体何时以大溶液体积...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL 10 kDa filter	MilliporeSigma	UFC901024	centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter	MilliporeSigma	UFC910024	centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials	Corning	CLS430489	Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-141	microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate	Hampton Research	HR3-158	24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100	Chemical
50 mL centrifuge conical tubes	Thermo Scientific	12-565-270	centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15	pH meter
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Agarose gel
ammonium sulfate	Fisher Scientific	A702-500	Chemical
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5	Antibiotic
Bacterial incubator	Fisher Scientific	S35836	incubator.
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
bicine	Fisher Scientific	BP2646100	Chemical
Branson 450 Digital Sonifier	Brason	B450	Cell disruptor
Cesium chloride	Fisher Scientific	BP210-100	Chemical
Cesium hydroxide	Acros Organics	AC213601000	Chemical
Chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	Antibiotic
dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	D1391	Chemical
dithiothreitol	Fisher Scientific	BP172-5	Chemical
DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	HF polymerase
dNTP Set	Invitrogen	10-297-018	dNTPs set
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chemical
Excella E25R Orbital Shaker	Eppendorf New Brunswick	M1353-0004	Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004	FPLC
Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012	DNA purification kit
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500	Chemical
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Restriction enzyme
His-Trap columns	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL Histrap column
imidazole	Fisher Scientific	O3196-500	Chemical
IPTG	Thermo Fisher Scientific	R0392	Inducer
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Antibiotic
Kelvinator Series-100	Kelvinator	discontinued	Ultra low freezer
LB broth	Fisher Scientific	BP1426-500	Liquid broth
Luria Bertani agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Solid broth
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Chemical
NcoI	New England Biolabs	R0193S	Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads	Thermo Fisher Scientific	R90115	Ni-NTA agarose beads
PEG 8000	Fisher Scientific	BP233-100	Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride	Fisher Scientific	44-865-0	Chemical
pyridoxal phosphate	Acros Organics	AC228170010	Chemical
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	Size exclusion column
SacI	New England Biolabs	R0156S	Restriction enzyme
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-100	Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge	Sorvall	8327-30-1004	Floor cetrifuge
Spermine	Acros Organics	AC132750010	Chemical
Superdex 200 prep grade	Cytiva	45-002-491	Size exclusion column
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S	DNA liagse
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Chemical
Ubl-specific protease 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO Protease