JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، ونحن نقدم رقاقة microfluidic والتحكم فيها تلقائيا، ونظام microfluidic التداول عالية الكفاءة التي تلخص البيئة الدقيقة الأولية من neovascularization، مما يسمح الخلايا البطانية (ECs) ليتم تحفيزها من قبل ارتفاع الإجهاد القص الإنارة، والمستوى الفسيولوجي لتدفق عبر الغدد الصماء، ومختلف عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF) التوزيع في وقت واحد.

Abstract

عادة ما يتم تهيئة neovascularization من الأوعية الدموية الطبيعية الموجودة و البيئة الدقيقة الحيوية للخلايا البطانية (ECs) في المرحلة الأولية تختلف بشكل كبير من العملية التالية من neovascularization. على الرغم من أن هناك الكثير من النماذج لمحاكاة مراحل مختلفة من neovascularization، نموذج 3D في المختبر الذي يستسلم العملية الأولية من neovascularization تحت التحفيز المقابلة للأوعية الطبيعية microenvironments لا تزال تفتقر. هنا، قمنا بإعادة بناء نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر يحاكي الحدث الأولي للنيوفاكوسلارية (MIEN). نموذج MIEN يحتوي على رقاقة microfluidic تنبت والتحكم الآلي، ونظام تداول عالية الكفاءة. تم تشكيل قناة صغيرة وظيفية وقابلة للانحناء مغلفة بعمى الغدد الوثناء وتم محاكاة عملية النبتة في رقاقة البراعم الدقيقة. تم تلخيص البيئة الدقيقة الفسيولوجية في البداية من neovascularization مع نظام التحكم microfluidic ، والتي من شأنها أن تتعرض ECs إلى ارتفاع الإجهاد القص الإنارة ، والتدفق الفسيولوجي عبر الندوثيلي ، ومختلف توزيعات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF). ويمكن تطبيق نموذج MIEN بسهولة على دراسة آلية التشكل الذاتي ويحمل وعدا محتملا كمنصة منخفضة التكلفة لفحص الأدوية وتطبيقات السموم.

Introduction

يحدث النيوفاسكلارة في العديد من العمليات الطبيعية والمرضية1،2،3،4، والتي تشمل عمليتين رئيسيتين في البالغين ، تولد الأوعية الدموية وتولد الشرايين5. إلى جانب عوامل النمو الأكثر شهرة، مثل عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF)6، التحفيز الميكانيكي ، ولا سيما تدفق الدم الناجم عن الإجهاد القص ، مهم في تنظيم neovascularization7. كما نعلم، فإن حجم وأشكال التوتر القص تختلف بشكل كبير وديناميكية في أجزاء مختلفة من الأوعية الدموية، مما أدى إلى آثار هامة على خلايا الأوعية الدموية8،9،10،11،12. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الإجهاد القص قد تؤثر على جوانب مختلفة من ECs, بما في ذلك التغيرات الظاهري الخلية, إشارة تحويل, التعبير الجيني, والتواصل مع الخلايا الجدارية13,14,15,16,17,18,19,20; ومن ثم، تنظيم neovascularization21،22،23،24.

ولذلك، لفهم أفضل neovascularization، من المهم إعادة بناء العملية في البيئة الدقيقة الخلوية الطبيعية في المختبر. في الآونة الأخيرة، وقد تم إنشاء العديد من النماذج لإنشاء الأوعية الدقيقة وتوفير مراقبة دقيقة للتقنية الدقيقة25،26،27، والاستفادة من التقدم في microfabrication والتكنولوجيا microfluidic. في هذه النماذج، يمكن أن تولد الأوعية الدقيقة من قبل hydrogel28،29، polydimethylsiloxane (PDMS) رقائق microfluidic30،31،32 أو 3D33،34. بعض جوانب البيئة الدقيقة، مثل الإجهاد القص اللمعان22,23,35,36, التدفق عبر الندخيل37,38,39,40, التدرج البيوكيميائي للعوامل الوعائية41,42, سلالة / تمتد43,44,45, وشارك في الثقافة مع أنواع أخرى من الخلايا32,46 وقد تم تقليدها والتحكم فيها. عادة، تم استخدام خزان كبير أو مضخة حقنة لتوفير المتوسطة المحقة. تم إنشاء التدفق عبر الندوهليلي في هذه النماذج عن طريق انخفاض الضغط بين الخزان و micro-أنبوب22،23،38،40. ومع ذلك ، كان من الصعب الحفاظ على البيئة الدقيقة الميكانيكية باستمرار بهذه الطريقة. سوف يزيد التدفق عبر الندندوهليلي ثم يتجاوز المستوى الفسيولوجي إذا تم استخدام معدل تدفق مرتفع مع إجهاد القص العالي للضخ. أظهرت الدراسة السابقة أنه في الفترة الأولية من النيوفاسكلارية ، فإن سرعة التدفق عبر الغدد الصمية منخفضة للغاية بسبب الغشاء ECs والغشاء السفلي السليم ، وعادة أقل من 0.05 ميكرومتر / س8. وفي الوقت نفسه، على الرغم من الإجهاد القص اللمعان في نظام الأوعية الدموية يختلف اختلافا كبيرا، فهي مرتفعة نسبيا مع متوسط القيم من 5-20 dyn/cm2،11،47. في الوقت الراهن ، تم الاحتفاظ بسرعة التدفق عبر الندوهل في الأعمال السابقة بشكل عام بين 0.5-15 ميكرومتر / س22،38،39،40، وكان الإجهاد القص اللمبوط عادة تحت 10 dyn/cm232. يبقى موضوعًا صعبًا لفضح ECs باستمرار لإجهاد القص العالي ومستوى الفيزيولوجي للتدفق عبر الندوئي في وقت واحد. 

في هذه الدراسة، ونحن وصف نموذج 3D في المختبر لمحاكاة الحدث الأولي من neovascularization (MIEN). قمنا بتطوير رقاقة microfluidic والسيطرة التلقائي، ونظام دوران عالية الكفاءة لتشكيل الأنابيب الدقيقة perfusion ومحاكاة عملية تنبت48. مع نموذج MIEN، يتم أولاً تلخيص البيئة الدقيقة من ECs حفز في الفترة الأولية من neovascularization. يمكن تحفيز ECs من خلال إجهاد القص اللمبّر العالي ، والمستوى الفسيولوجي للتدفق عبر الندوتيوفي وتوزيع VEGF المختلف في وقت واحد. نحن نصف خطوات إنشاء نموذج MIEN بالتفصيل والنقاط الرئيسية التي يجب الانتباه إليها ، على أمل توفير مرجع للباحثين الآخرين.

Protocol

1- إعداد الوافر

ملاحظة: هذا البروتوكول محدد لـ SU-8 2075 الفوتراسرس السلبية المستخدمة أثناء هذا البحث.

  1. تنظيف رقاقة السيليكون 3 إلى 5 مرات مع الميثانول والإيزوبروبانول على معطف تدور على النحو التالي: تدور أولا لمدة 15 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم تدور لمدة 60 ثانية في 3000 دورة في الدقيقة.
  2. نقل رقاقة السيليكون إلى الساخنة، والتي هي محمّى إلى 180 درجة مئوية وخبز رقاقة لمدة 10 دقيقة.
  3. إزالة رقاقة السيليكون من الساخنة وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة. تنظيف رقاقة مرة أخرى مع الهواء المضغوط قبل المضي قدما مع طلاء تدور. تطبيق 4 مل من 2075 8 سو سو 2075 إلى مركز رقاقة.
  4. الحصول على ارتفاع ميزة 70 ميكرومتر على اللفة المغطي على النحو التالي: تدور أولا لمدة 12 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم تدور ل 50 s في 2100 دورة في الدقيقة.
  5. الناعمة خبز رقاقة على الساخن على النحو التالي: أولا خبز لمدة 8 دقائق في 65 درجة مئوية، ثم خبز لمدة 20 دقيقة في 95 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإزالة رقاقة السيليكون من اللوح الساخن وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة قبل الطباعة الحجرية.
  6. وضع قناع ضوئي على الفيلم photoresist. كشف رقاقة مع معدات الطباعة الحجرية لتحقيق التعرض الكلي لل 200 mJ/ cm2.
    ملاحظة: يحتوي قناع ضوئي على تسع مجموعات من أنماط الشريحة ، لذلك يمكن أن يصنع تسعة رقائق microfluidic تنبت في كل مرة.
  7. آخر فضح رقاقة على الساخن على النحو التالي: أولا خبز لمدة 5 دقائق في 65 درجة مئوية، ثم خبز لمدة 20 دقيقة في 95 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإزالة رقاقة السيليكون من اللوح الساخن وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة قبل تطويره.
  8. نقل رقاقة إلى طبق بيتري الزجاج مليئة SU-8 المطور (PGMEA) لبدء النامية.
    تنبيه: المطور هو غضب للعيون والجهاز التنفسي. أداء النامية في غطاء الدخان. ارتداء نظارات البداية، وقفازات النتريل، وقناع شركات الطيران أثناء العملية.
  9. يهز الطبق بلطف على طول اتجاه قناة تدفق وتغيير المطور بعد 10 دقيقة.
  10. كرر الخطوة 1.9 3-5 مرات حتى يمكن ملاحظة الأنماط بوضوح.
    ملاحظة: تأكد من عدم وجود بقايا مُنسخة ضوئية على الرقاقة، وإلا شطف الرقاقة في المطور مرة أخرى.
  11. نقل رقاقة إلى الساخن محمّى تعيين إلى 120 درجة مئوية وخبزه لمدة 30 دقيقة.
  12. Pipet 35 ميكرولتر من السيلاني على غطاء، ثم وضع غطاء مع رقاقة في جهاز افراغ وسحب. ختم desiccator وترك رقاقة تحت فراغ لمدة 4 ح لseanize رقاقة لمنع التصاق PDMS أثناء عمليات الطباعة الحجرية الناعمة.
    تنبيه: السيلاني سام. لمنع التسمم ، قم بإجراء السيلانيون في غطاء الدخان وارتداء قفازات النتريل أثناء المناولة.
  13. الافراج عن الفراغ من مجفف. قم بإزالة الرقاقة السيلانية على لوحة ساخنة محمّاة وخبزها عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  14. تخزين رقاقة في طبق بيتري نظيفة حتى المطلوبة.

2. Microfluidic تنبت رقاقة تلفيق

  1. الجمع بين 20 غرام من وكيل قاعدة و 2 غرام من وكيل علاج (10:1 نسبة) في الكأس البلاستيكية ومزجها جيدا مع قضيب خلط.
  2. وضع منقار في جهاز ادمى وسحب فراغ لمدة 1 ساعة لإزالة فقاعات الهواء في خليط PDMS.
  3. صب خليط PDMS على رقاقة في طبق بيتري ووضع طبق بيتري مرة أخرى في desiccator، degassing لمدة 30 دقيقة أخرى.
    ملاحظة: من المفيد استخدام شريط لاصق مزدوج الجانب للصق الرقاقة على الجزء السفلي من طبق بيتري لضمان الحفاظ على رقاقة الأفقي أثناء إزالة الغازات وعلاج.
  4. إزالة طبق بيتري من مجفف وضعه في فرن جاف 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات لعلاج.
  5. فصل بعناية طبقة PDMS من رقاقة وقطع الطبقة إلى تسعة رقائق مع مشرط وفقا للنمط.
    ملاحظة: حافظ على ميزة الجانب حتى بعد الانفصال.
  6. لكمة اثنين من منافذ حقن هيدروجيل وأربعة منافذ حقن وسائل الإعلام من كل رقاقة باستخدام 1 مم ولكمة خزعة 3.5 ملم، على التوالي.
  7. تنظيف رقائق لكمة مع بقايا خالية من الشريط لإزالة بقايا PDMS. ضع الرقائق وتسعة أغطية زجاجية في منظف البلازما واعالجها بلازما الأكسجين لمدة 30 s لتشكيل الترابط التكافؤ على السطح.
  8. أخرج الرقائق وأغطية الأغطية. إرفاق الجانب ميزة من رقائق على الأغطية.
  9. ضع الرقائق المرفقة في فرن جاف 80 درجة مئوية لمدة ساعة 1 لتكثيف الترابط.
  10. أوتوكلاف الرقائق قبل الاستخدام والاحتفاظ بها معقمة لبقية الإجراء.

3. تعديل السطح وحقن هيدروجيل

  1. لكل رقاقة، pipet 40 ميكرولتر من 1 ملغ/مل بولي-D-ليسين (PDL) وحقنها في قنوات في رقاقة من ميناء حقن هيدروجيل.
    ملاحظة: تأكد من أن PDL تعبئة القنوات، خاصة في القنوات الضيقة بالقرب من المنافذ.
  2. احتضان رقائق في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة لتعديل سطح PDMS .
  3. Pipet 200 ميكرولتر من الماء المعقم وحقنه في قنوات في رقاقة من ميناء حقن هيدروجيل لغسل PDL.
  4. إزالة رقائق في فرن جاف 120 درجة مئوية لمدة 3 ساعات لاستعادة الرهاب المائي.
  5. ضع على الجليد أنبوب معقمة وحساب حجم الكولاجين النوع الأول لاستخدامها على أنها المعادلة التالية.
    الحجم النهائي (50 ميكرولتر) × تركيز الكولاجين النهائي (3 ملغ / مل في هذا البحث) / التركيز في زجاجة = حجم الكولاجين التي ستضاف
  6. حساب حجم NaOH لاستخدامها المعادلة التالية.
    (حجم الكولاجين إلى أن تضاف) × 0.023 = حجم 1 N NaOH
  7. إعداد 50 ميكرولتر من هيدروجيل في الأنبوب كما البروتوكول التالي: إضافة 5 ميكرولتر من 10x PBS، 0.5 ميكرولتر من الفينول الأحمر، وحجم محسوب من 1 N NaOH، 4 ميكرولتر من 1 ملغم / مل فيبيننيكين، حجم محسوب من الكولاجين النوع الأول بدوره. أضف الكمية المناسبة من dH2O بحيث يصل الحجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر. اخلط جميع المحتويات في الأنبوب تمامًا.
    ملاحظة: تنفيذ كافة العمليات على الجليد. استخدام الفينول الأحمر كمؤشر حمض القائم على للمساعدة في تحديد البصرية للhH من الهيدروجيل. وhyhgel النهائي ينتهي البرتقال عندما يكون حوالي 7.4 وصلابة حوالي 15 كيلو باسكال49.
  8. بايبت 2-3 ميكرولتر من الهيدروجيل لكل رقاقة وحقن ببطء في قناة هيدروجيل المركزية من ميناء حقن هيدروجيل.
  9. احتضان رقائق في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح هلام.
    ملاحظة: ختم رقائق في مربع مختومة مع 1 مل من الماء المعقم إذا لم يتم استخدامها على الفور. يمكن تخزين رقائق مختومة في 37 درجة مئوية ل 24 ساعة على الأكثر.

4. بذر الخلية

  1. Pipet 20 ميكرولتر من 125 ميكروغرام/مل فيبيننيكين في منفذ حقن وسائط واحد لقناة ثقافة الخلية.
  2. قطع تلميح ماصة لتناسب ميناء قناة ثقافة الخلية مع مقص.
  3. أدخل طرف الماصات في منفذ حقن الوسائط الآخر لقناة ثقافة الخلية. ثم، pipet من الهواء من قناة ثقافة الخلية لملء مع فيبيننيكين.
  4. احتضان رقائق في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. قبل بذر الخلية، pipet 20 ميكرولتر من وسائط ECM في كل منفذ حقن الوسائط واحتضان الرقائق في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. ثم، pipet من جميع وسائل الإعلام في جميع منافذ حقن وسائل الإعلام.
  7. المقبل، pipet 5 ميكرولتر من تعليق الخلية في منفذ واحد حقن وسائل الإعلام من قناة ثقافة الخلية. ثم، الخلايا البطانية تنتشر بسرعة على القناة بأكملها تحت ضغط هيدروستاتيكي تفاضلي.
    ملاحظة: إعداد تعليق الخلية عن طريق التربسينسيس الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVECs) من قارورة الثقافة وقذفها في 400 x g. ثم، resuspend الخلايا إلى 107 خلايا / مل في أنبوب.
  8. إضافة حوالي 4-6 μL من وسائط ECM إلى المنفذ الآخر لضبط الضغط الهيدروستاتيكي ووقف الخلية تتحرك.
  9. إزالة رقائق إلى حاضنة الخلية. ثم، بدوره على رقائق كل 30 دقيقة حتى البطانية الخلايا معطف حول السطح الداخلي للقناة ثقافة الخلية 2 ح في وقت لاحق (الشكل 1).
    ملاحظة: لجعل رقاقة رأسا على عقب، pipet القليل من الماء على الجزء الخلفي من غطاء. ثم يمكن أن نعلق رقاقة إلى غطاء طبق بيتري.
  10. استخدام تلميح ماصة لإزالة الخلايا المرفقة في منافذ الحقن بعناية فائقة.
  11. ثم، إدراج أربعة محولات Luer الإناث الشائكة في منافذ حقن وسائل الإعلام وملء مع وسائل الإعلام ECM.
    ملاحظة: يمكن أن تعمل المحولات كمكامن السوائل لتوفير العناصر الغذائية للخلايا في القناة.
  12. إزالة رقائق إلى حاضنة الخلية. تغيير وسائط ECM في محولات Luer كل 12 ساعة.

5- قياس نفاذية فيتC-دكستران

ملاحظة: لتقييم وظيفة الحاجز للسفينة الصغرى، يتم تقييم نفاذية الانتشار لقناة ثقافة EC مع أو بدون بطانة الخلية.

  1. إخراج رقاقة تنبت microfluidic مع حقن هيدروجيل.
  2. كرر الخطوات 4.1-4.6.
  3. إزالة جميع محولات Luer و pipet من جميع وسائل الإعلام في أربعة منافذ حقن وسائل الإعلام.
  4. ضع الرقاقة على مجهر المسح الضوئي بالليزر confocal.
  5. Pipet 5μL من وسائط الثقافة التي تحتوي على 500 ميكروغرام/مل 40 كيلو ادا FITC-dextran إلى منفذ واحد من قناة ثقافة الخلية.
    ملاحظة: 40 كيلو ادا FITC-dextran لديه حجم مماثل الجزيئية ل VEGF-165 (39-45 كيلو ادا).
  6. التقاط الصور كل 3 s لمدة 30 s. وهكذا، يتم قياس نفاذية الانتشار دون بطانة الخلية.
  7. إخراج رقاقة تنبت microfluidic بعد HUVECs هي التقاء في قناة ثقافة الخلية.
  8. كرر الخطوات 5.3-5.5.
  9. التقاط الصور كل 3 s لمدة 30 s. وهكذا، يتم قياس نفاذية الانتشار مع بطانة الخلية.
  10. حساب نفاذية الانتشار عن طريق قياس التغيرات في كثافة الفلورسنت مع مرور الوقت باستخدام المعادلة المعدلة التالية50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/د
    حيث ، Pd هو معامل نفاذية الانتشار ، أنا1 هو متوسط كثافة في نقطة زمنية أولية ، I2 هو متوسط الكثافة بعد وقت دلتا (Δt)، Ib هو كثافة الخلفية ، S هي منطقة القناة في الصور الفلورية ، وd هو الفاصل الزمني الكلي للمشاركات الدقيقة في الصور الفلورية. في العمل الحالي، يتم تعيين Δt كـ 9 s.
    ملاحظة: المعادلة الحالية تختلف قليلا عن50الأصلي ، نظرا لاتجاه انتشار الفلوريس في رقاقة هو فقط من قناة الجماعة الأوروبية إلى قناة هيدروجيل ، والتي ليست مثل أنبوب دائري نشر في جميع الاتجاه شعاعي.

6. Microfluidic نظام التحكم الإعداد

ملاحظة: يتكون نظام التحكم الدقيق في هذه الدراسة من مضخة الحقن الدقيقة، وصمام قرصة الكهرومغناطيسية، وشريحة فخ فقاعة، وشريحة microfluidic، ومضخة ال peristaltic الصغرى، وخزان. ويمكن الاستعاضة عن كل جزء من النظام ببدائل قادرة على أداء نفس الوظيفة.

  1. فقاعة فخ رقاقة تلفيق
    ملاحظة: يتم استخدام شريحة فخ الفقاعة لإزالة فقاعات الهواء في التداول. تتكون الشريحة من ثلاث طبقات من نظام إدارة المباني. يتم بناء الطبقة العليا باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة لتشكيل بنية الشبكة كغرفة السائل. كل قناة من هيكل الشبكة هو 100 μm واسعة. الطبقة السفلية هي قطعة PDMS مع ثقب. بين الطبقتين، يتم وضع فيلم PDMS رقيقة 100 ميكرومتر.
    1. كرر الخطوة 1 لإعداد رقاقة لفرقة التراكب الفقاعي.
    2. كرر الخطوات 2.1-2.5 لتلفيق الطبقة العليا والطبقة السفلية من رقاقة فخ الفقاعة.
      ملاحظة: يحتوي الزجاج الضوئي للطبقة العليا على ثلاث مجموعات من الأنماط، لذا قم بقص طبقة PDMS إلى ثلاث رقائق وفقًا للنمط.
    3. لكمة ستة ثقوب على نهاية مدخل وقنوات منفذ الطبقة العليا باستخدام لكمة خزعة 3.5 ملم.
    4. لكمة اثنين من الثقوب على الموقف المقابلة من الطبقة السفلية باستخدام لكمة خزعة 6 مم وفقا للنمط على الطبقة العليا.
    5. كرر الخطوات 2.1-2.2 لإعداد 10 غرام من خليط PDMS وسكبه على مركز رقاقة سيليكون نظيفة.
    6. تصنيع فيلم PDMS 100 ميكرومتر من خلال تطبيق بروتوكول الدوران التالي: تدور لمدة 15 ثانية عند 500 دورة في الدقيقة، قم بزيادة سرعة الدوران إلى 1300 دورة في الدقيقة وعقد هنا لمدة 45 ثانية.
    7. نقل رقاقة إلى الساخن محمّى تعيين إلى 180 درجة مئوية وخبزه لمدة 30 دقيقة.
    8. تنظيف الطبقات لكمات مع بقايا خالية من الشريط لإزالة بقايا PDMS. ضع الطبقات العليا والويفر في منظف البلازما وتعاملها ببلاسامة الأكسجين لمدة 30 s لتشكيل الترابط التكافؤ على السطح.
    9. أخرج الطبقات العليا والوافر. إرفاق الجانب المميز من الطبقات العليا على فيلم PDMS.
    10. قطع الفيلم بعناية على طول حافة الطبقات العليا مع إبرة.
    11. فصل الفيلم ببطء من رقاقة وتسليم رقائق لجعل الجانب الفيلم حتى بعد الانفصال.
    12. ضع الطبقات السفلية ورقائق تعلق في منظف البلازما وعلاجها مع البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية مرة أخرى.
    13. إخراج الطبقات السفلية ورقائق المرفقة. إرفاق الطبقات السفلية على الفيلم PDMS ويتم رقائق فخ فقاعة.
      ملاحظة: محاذاة الثقوب على الطبقة السفلية مع الأنماط على الطبقة العليا عند إرفاق.
    14. ضع الرقاقات في فرن جاف 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتكثيف الترابط.
  2. تجميع نظام التحكم microfluidic
    ملاحظة: يتم استخدام جميع أجزاء النظام، مثل رقاقة فخ فقاعة، والخزان، والأنابيب، والموصلات بعد التعقيم الأوتوكلاف، باستثناء المعدات الإلكترونية. تجميع نظام التحكم microfluidic على مقاعد البدلاء نظيفة.
    1. لتجميع نظام التحكم microfluidic، وإعداد اثنين من أنابيب البوليتيترافلورو الإيثيلين، اثنين من أنابيب السيليكون قصيرة، ثلاثة أنابيب سيليكون طويلة، واحدة محول لور أنثى شائكة، واحد موصل نوع Y، وثلاثة موصلات نوع L.
      ملاحظة: ميزة أنبوب البوليtetrafluoroethylene هو مرونة منخفضة، وبالتالي، هناك حاجة أقل وسائل الإعلام في خط الأنابيب. أنبوب السيليكون، في المقابل، لديه مرونة عالية، وبالتالي، فهو مناسب لصمام قرصة ومضخة ال peristaltic.
    2. ملء حقنة مع 10 مل من محمّى مسبقا (37 درجة مئوية) ECM المتوسطة.
      ملاحظة: يساعد ما قبل التهد الغاز المُنَحّ في إطلاق الغاز المُحلّل المتوسط.
    3. ربط أنبوب البوليتيترافلورو الإيثيلين إلى الحقنة من قبل محول Luer أنثى شائكة. ثم، قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب البوليتيترافلورو إثيلين إلى موصل نوع Y.
    4. المقبل، توصيل اثنين من أنابيب سيليكون طويلة إلى طرفي أخرى من نوع موصل Y مع أنبوب واحد الاتصال الخزان وأنبوب آخر الاتصال رقاقة فخ فقاعة.
    5. قم بتوصيل أنبوب سيليكون طويل آخر بالمخزون.
    6. بعد ذلك، استخدم أنبوبين سيليكون قصيرين لتوصيل جميع فتحات المدخل والمدخل على الطبقة العليا من رقاقة فخ الفقاعة. قم بتوصيل أنبوب البوليتيترافلورو إيثيلين إلى الواجهة الخلفية للرقاقة.
    7. بعد ذلك، إصلاح الحقنة على مضخة الحقنة الدقيقة.
    8. مقطع اثنين من أنابيب السيليكون طويلة في صمام قرصة الكهرومغناطيسية.
    9. بعد ذلك، قم بتبديل صمام قرصة الكهرومغناطيسية لفتح خط الأنابيب بين الحقنة والخزان. حقن وسائل الإعلام في الخزان باستخدام مضخة الحقنة الدقيقة لاستنفاد الهواء في الأنبوب.
    10. ثم، قم بتبديل الصمام مرة أخرى لفتح خط الأنابيب بين الحقنة وشريحة فخ الفقاعة. حقن وسائل الإعلام لملء غرفة السائلة وانبوب الخلفية من رقاقة فخ فقاعة.

7. Endothelial تنبت مقايسة

ملاحظة: يتم استخدام حاضنة المرحلة العليا التي تم تجميعها مع مجهر النقيض من المرحلة في هذه الدراسة لمراقبة عملية الانتفـاء في الوقت الحقيقي. يمكن أن تقوم حاضنة المرحلة العليا بالحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة والتحكم في CO2 على مراحل المجهر ، كونها جيدة لتصوير الخلايا الحية. ولكن المعدات ليست ضرورية للتشايس. ويمكن أيضا أن تعمل البروتوكولات المنصوص عليها هنا في حاضنة الخلية الأساسية.

  1. أخرج رقائق البراعم البطانية من حاضنة الخلايا.
  2. ثم قم بإزالة محولات Luer على جانب ثقافة الخلية. إدراج اثنين من المقابس الأنابيب في منافذ حقن هيدروجيل من رقاقة تنبت microfluidic.
    ملاحظة: يمكن أن تتحول المقابس من الإبر ووظيفتها الرئيسية هي منع وسائل الإعلام من الانسكاب.
  3. قم بتوصيل أنبوب الواجهة الخلفية لشريحة فخ الفقاعة بمنفذ واحد لقناة ثقافة الخلايا.
    ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات في الأنبوب قبل الاتصال.
  4. أدخل موصل نوع T إلى المنفذ الآخر وتوصيله إلى أنبوب سيليكون طويل متصل بالخزان.
  5. قص أنبوب سيليكون طويلة في مضخة الميكروفاتية.
  6. ثم أدخل فلتر هواء إلى الخزان.
  7. المقبل، وتجميع رقاقة تنبت microfluidic إلى مرحلة حاضنة أعلى.
  8. المقبل، توصيل مضخة فراغ إلى الثقوب في الطبقة السفلى من رقاقة فخ فقاعة مع أنبوب TPU.
  9. إعداد حجم الدورة ومعدل التدفق في برنامج مخصص، والذي يتحكم في مضخة الحقن الدقيقة وصمام قرصة الكهرومغناطيسية في وقت واحد (الشكل 2).
    ملاحظة: يتم حساب معدل التدفق عبر قناة ثقافة الخلايا البطانية وفقاً للمعادلة الكلاسيكية.
    τ = 6μQ / Wh2
    حيث، τ هو الإجهاد القص (dyn/cm2)،μ هو لزوجة المتوسطة (8.8 × 10-4 Pa•s)، Q هو معدل التدفق عبر قناة ثقافة الخلايا endothelial (مل / ث)، h هو ارتفاع القناة (70 ميكرومتر)، وW هو عرض القناة (1،000 μm). يتم قياس لزوجة الوسيط باستخدام نوع اسطوانة محورية الدوران فيوجنمتر. ارتفاع وعرض القناة محددة سلفا وتأكيد يدويا باستخدام المجهر النقيض مرحلة في التكبير 4x. حجم التداول هو 5 مل ومعدل التدفق هو 85 ميكرولتر / دقيقة (متوسط 0.2 م / س في قناة ثقافة الخلية) ل15 dyn/cm2 إجهاد القص وفقا للحساب.
  10. المقبل، إعداد معدل تدفق مضخة ال peristaltic الصغرى.
    ملاحظة: معدل تدفق مضخة الميكرات المتقبعة هي أعلى قليلا من مضخة الحقنة الصغيرة، من أجل منع وسائل الإعلام من التسرب.
  11. تشغيل مضخة الحقنة الصغيرة. ثم، يتم إنشاء نظام التحكم في الدورة الدموية.

8 - تحليل البيانات

ملاحظة: لقياس براعم، تم حساب المنطقة تطبيع من تنبت، متوسط طول براعم، وأطول طول براعم. وتمثل النتائج ± التي تم الحصول عليها من ثلاث دراسات مستقلة. يتم تقييم الأهمية الإحصائية (P < 0.05) بواسطة اختبار الطالب t.

  1. إصلاح الخلايا وبراعم في رقاقة microfluidic تنبت بعد التجارب مع 4٪ شبهفورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. نوية وصمة عار مع 4′, 6-diamidino-2-فينيليندول ديهيدروكولي (DAPI; 1: 1000; سيغما ألدريتش) لمدة 10 دقيقة ثم وصمة عار مع هيكل cytoskeleton مع TRITC phalloidin (P5285، 1: 100؛ سيغما - الدريتش) لـ 1 ساعة. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات في فترات 5 دقائق بين كل خطوة.
  2. التقاط صور confocal من رقائق في وضع تبليط وغرزة لهم باستخدام برامج تحرير الصور.
  3. عد عدد البكسل الفلورسنت لصور الإسقاط Z باستخدام رمز مخصص في برامج البرمجة لتحديد المساحة التي تم تطبيعها من النتف (انظر الملف الإضافي).
  4. يدويا تحديد وتسمية كل طرف من براعم في الصور Z الإسقاط وحساب المسافات بين نصائح براعم لغشاء الطابق السفلي ECs باستخدام رمز مخصص آخر لقياس متوسط طول براعم وأطول طول براعم (انظر ملف إضافي).

النتائج

النموذج 3D في المختبر لمحاكاة الحدث الأولي من neovascularization (MIEN) المعروضة هنا تتكون من رقاقة تنبت microfluidic ونظام التحكم microfluidic. تم تحسين رقاقة الزرقة الزهية من المنشورات السابقة22،23،37،40،51،

Discussion

لفترة طويلة، كانت المراقبة في الوقت الحقيقي من neovascularization مشكلة. وقد تم مؤخرا وضع العديد من النهج لإنشاء بطانة الأوعية الم perfused مع ECs ومجاوبة لمصفوفة خارج الخلية لتنبت22،32،40،46،54، ولكن البيئة الدقيقة ا...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية لبحوث العلوم الطبيعية في الصين منح في المعونة (منحة رقمها 11827803، 31971244، 31570947، 11772036، 61533016، U20A20390 و 32071311)، البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (منحة رقم 2016YFC1101101 و 2016YFC102202)، ومشروع 111 (B13003)، ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (4194079).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGenviewGP3108
Collagen I, rat tailCorning354236
DAPISigma-AldrichD9542
Electromagnetic pinch valveWokun TechnologyWK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM)Sciencell1001
Fetal bovine serum (FBS)Every GreenNA
FibronectinCorning354008
FITC-dextranMiragen60842-46-8
Graphical programming environmentLab VIEWNA
Image editing softwarePhotoShopNA
Image processing programImageJNA
IsopropanolSigma-Aldrich91237
Lithography equipmentInstitute of optics and electronics, Chinese academy of sciencesURE-2000/35
MethanolSigma-Aldrich82762
Micro-peristaltic pumpLead FluidBT101L
Micro-syringe pumpLead FluidTYD01
Oxygen plasmaMING HENGPDC-MG
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBS (10x)BeyotimeST448
Permanent epoxy negative photoresistMicrochemSU-8 2075
Phenol Red sodium saltSigma-AldrichP5530
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)Sigma-AldrichP7886
PolytetrafluoroethyleneTeflonNA
Program softwareMATLABNA
Recombinant Human VEGF-165StemImmune LLCHVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich1.06498
Stage top incubatorTokai HitNA
SU-8 developerMicrochemNA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma-Aldrich448931
TRITC PhalloidinSigma-AldrichP5285

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), 188 (1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170 neovascularization microfluidics 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved