JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מספקים שבב microfluidic ומערכת מיקרופלואידית במחזור מבוקרת ויעילה מאוד באופן אוטומטי, כי מסכם את microenvironment הראשונית של neovascularization, המאפשר לתאי אנדותל (ECs) להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial, גורם צמיחה אנדותל כלי דם שונים (VEGF) הפצה בו זמנית.

Abstract

Neovascularization הוא בדרך כלל מאותחל מן כלי הדם הנורמלי הקיים ואת microenvironment biomechanical של תאי אנדותל (ECs) בשלב הראשוני משתנה באופן דרמטי מן התהליך הבא של neovascularization. אמנם יש שפע של מודלים כדי לדמות שלבים שונים של neovascularization, מודל 3D במבחנה כי נכנע את התהליך הראשוני של neovascularization תחת הגירויים המתאימים של microenvironments כלי דם נורמלי עדיין חסר. כאן, שיחזרנו מודל 3D במבחנה המחקה את האירוע הראשוני של neovascularization (MIEN). דגם ה-MIEN מכיל שבב נבט מיקרופלואידי ומערכת מחזור אוטומטית ויעילה ביותר. מיקרוצ'נל פונקציונלי וניתן לחלחל מצופה אנדותל נוצר ותהליך הנבטה היה מדומה בשבב הנבט המיקרופלואידי. המיקרו-ווירוניזציה הפיזיולוגית הראשונית של הניאו-סקולריזציה סוכם מחדש עם מערכת הבקרה המיקרופלואידית, שבאמצעותה ECs ייחשפו ללחץ גזירה לומינלי גבוה, זרימה טרנסנדותליאלית פיזיולוגית, והתפלגויות שונות של גורם גדילה אנדותל בכלי הדם (VEGF) בו זמנית. מודל MIEN יכול להיות מיושם בקלות על המחקר של מנגנון neovascularization ומחזיק הבטחה פוטנציאלית כפלטפורמה בעלות נמוכה עבור סינון תרופות ויישומי טוקסיקולוגיה.

Introduction

Neovascularization קורה בתהליכים נורמליים ופתולוגיים רבים1,2,3,4, הכוללים שני תהליכים עיקריים במבוגרים, אנגיוגנזה ו arteriogenesis5. מלבד גורמי הגדילה הידועים ביותר, כגון גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF)6, גירויים מכניים, במיוחד את זרימת הדם המושרה מתח גזירה, חשוב ברגולציה של neovascularization7. כידוע, סדר הגודל וצורות הלחץ הגזירה משתנים באופן דרמטי ודינמי בחלקים שונים של כלי הדם, וכתוצאה מכך השפעות חשובות על תאי כלי הדם8,9,10,11,12. מחקרים קודמים הראו כי מתח גזירה עשוי להשפיע על היבטים שונים של ECs, כולל שינויים פנוטיפיים של התא, התמרות אותות, ביטוי גנים, ואת התקשורת עם תאים ציורי קיר13,14,15,16,17,18,19,20; לפיכך, לווסת neovascularization21,22,23,24.

לכן, כדי להבין טוב יותר neovascularization, חשוב לשחזר את התהליך microenvironment הסלולר הטבעי במבחנה. לאחרונה, מודלים רבים הוקמו כדי ליצור מיקרו כלי ולספק שליטה מדויקת של microenvironment25,26,27, ניצול ההתקדמות microfabrication וטכנולוגיה microfluidic. בדגמים אלה, מיקרו-כלי יכול להיווצר על ידי הידרוג'ל28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) שבבים מיקרופלואידיים30,31,32 או 3D bioprinting33,34. היבטים מסוימים של המיקרו-ווירונימנט, כגון מתח גזירה זוהר22,23,35,36, זרימה transendothelial37,38,39,40, שיפוע ביוכימי של גורמים אנגיוגניים41,42, זן / מתיחה43,44,45, ושיתוף עם סוגים אחרים של תאים32,46 כבר חיקו ונשלטו. בדרך כלל, מאגר גדול או משאבת מזרק שימש לספק מדיום perfused. זרימה טרנסנדותלאלית בדגמים אלה נוצרה על ידי ירידה בלחץ בין המאגר למיקרו צינור22,23,38,40. עם זאת, microenvironment מכני היה קשה לשמור כל הזמן בדרך זו. זרימת Transendothelial יגדל ולאחר מכן יעלה על הרמה הפיזיולוגית אם קצב זרימה גבוה עם מתח גזירה גבוה שימש זלוף. מחקר קודם הראה כי בתקופה הראשונית של neovascularization, המהירות של זרימה transendothelial הוא נמוך מאוד בשל ECs שלמים קרום המרתף, בדרך כלל תחת 0.05 מיקרומטר / s8. בינתיים, למרות מתח גזירה זוהר במערכת כלי הדם משתנה מאוד, הוא גבוה יחסית עם ערכים ממוצעים של 5-20 dyn / cm2,11,47. לעת עתה, המהירות של זרימה transendothelial בעבודות קודמות נשמרו בדרך כלל בין 0.5-15 מיקרומטר / s22,38,39,40, ואת הלחץ גזירה זוהר היה בדרך כלל תחת 10 dyn / cm2 23. זה נשאר נושא קשה כל הזמן לחשוף ECs ללחץ גזירה זוהר גבוה ורמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial בו זמנית.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים מודל 3D במבחנה לחקות את האירוע הראשוני של neovascularization (MIEN). פיתחנו שבב מיקרופלואידי ומערכת שליטה אוטומטית ויעילה ביותר ליצירת מיקרו-צינורות זלוף ולדמות את תהליך הנבטה48. עם מודל MIEN, microenvironment של ECs מגורה בתקופה הראשונית של neovascularization הם תחילה recapitulated. ECs יכול להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial והתפלגות VEGF שונים בו זמנית. אנו מתארים את השלבים של ביסוס מודל MIEN בפירוט ואת נקודות המפתח שיש לשים לב אליהן, בתקווה לספק התייחסות לחוקרים אחרים.

Protocol

1. הכנת וופל

הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור SU-8 2075 פוטורסיסט שלילי בשימוש במהלך מחקר זה.

  1. נקה את רקיק הסיליקון 3 עד 5 פעמים עם מתנול ואיזופרופנול על מעיל ספין כדלקמן: ספין ראשון במשך 15 שניות ב 500 סל"ד, ולאחר מכן להסתובב במשך 60 s ב 3,000 סל"ד.
  2. מעבירים את רקיק הסיליקון לפירה, שחומם מראש ל-180 מעלות ואופים את הוופל במשך 10 דקות.
  3. מוציאים את רקיק הסיליקון מהפלטה ומצננים אותו לטמפרטורת החדר. לנקות את הוופל שוב עם אוויר דחוס לפני שתמשיך עם ציפוי ספין. החל 4 מ"ל של SU-8 2075 photoresist למרכז הוופל.
  4. השג גובה תכונה של 70 מיקרומטר על מעיל ספין כדלקמן: ספין הראשון עבור 12 s ב 500 סל"ד, ולאחר מכן להסתובב במשך 50 שניות ב 2,100 סל"ד.
  5. אופים את הוופל על כיריים כדלקמן: אופים תחילה במשך 8 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן אופים במשך 20 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מוציאים את רקיק הסיליקון מהפלטה ומקררים אותו לטמפרטורת החדר לפני הליתוגרפיה.
  6. הנח מסכת פוטומסק על הסרט הפוטורסיסטי. לחשוף את הוופל עם ציוד ליתוגרפיה כדי להשיג חשיפה כוללת של 200 mJ / cm2.
    הערה: הפוטומסק מכיל תשעה סטים של דפוסים של השבב, כך שהוא יכול לפברק תשעה שבבי נבטים מיקרופלואידיים בכל פעם.
  7. פוסט לחשוף את הוופל על כיריים כדלקמן: ראשית לאפות במשך 5 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאפות במשך 20 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את רקיק סיליקון מן כיריים לקרר אותו לטמפרטורת החדר לפני הפיתוח.
  8. מעבירים את הוופל לצלחת פטרי מזכוכית מלאה במפתח SU-8 (PGMEA) כדי להתחיל בפיתוח.
    התראה: המפתח מעצבן את העיניים ואת דרכי הנשימה. בצע פיתוח במכסה המנוע אדים. לבש משקפי התזה, כפפות ניטריל ומסכת חברת תעופה במהלך המבצע.
  9. לנער את המנה בעדינות לאורך הכיוון של ערוץ הזרימה ולשנות את המפתח לאחר 10 דקות.
  10. חזור על שלב 1.9 3-5 פעמים עד הדפוסים ניתן לראות בבירור.
    הערה: ודא שלא נשארו שאריות פוטורסיסטיות על הוופל, אחרת שטף שוב את הוופל במפתח.
  11. מעבירים את הוופל לפיתה שחוממה מראש ל-120 מעלות ואופים אותה במשך 30 דקות.
  12. פיפט 35 μL של סילאן על כיסוי, ולאחר מכן לשים את הכיסוי יחד עם הוופל לתוך יבוש ולמשוך ואקום. לאטום את התייבש ולהשאיר את הוופל תחת ואקום במשך 4 שעות כדי silanize את הוופל כדי למנוע הידבקות של PDMS במהלך תהליכי ליטוגרפיה רכה.
    הסילאן רעיל. כדי למנוע הרעלה, לבצע silanization במכסה המנוע אדים ללבוש כפפות ניטריל תוך כדי טיפול.
  13. שחרר את הוואקום מהמתייבש. מוציאים את הוופל הסילאני על כיריים שחוממו מראש ואופים אותו ב-65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  14. יש לאחסן את הוופל בצלחת פטרי נקייה עד לצורך.

2. ייצור שבב נבטי מיקרופלואידי

  1. ערבבו 20 גרם של חומר בסיס ו-2 גרם של חומר ריפוי (יחס של 10:1) ב פלסטיק וערבבו אותם היטב עם מוט ערבוב.
  2. מניחים את הכומתה לתוך יבוש ולמשוך ואקום במשך 1 שעות כדי להסיר בועות אוויר בתערובת PDMS.
  3. יוצקים את תערובת PDMS על הוופל בצלחת פטרי ומניחים את צלחת פטרי בחזרה לתוך התייבש, degassing עוד 30 דקות.
    הערה: מומלץ להשתמש בסרט הדבקה דו-צדדי כדי להדביק את הוופל לתחתית צלחת הפטרי כדי להבטיח שהוופל יישמר אופקי במהלך פירוק וריפוי.
  4. מוציאים את צלחת הפטרי מהמתייבש ומניחים אותה בתנור יבש של 80 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לריפוי.
  5. בזהירות להפריד את שכבת PDMS מן הוופל לחתוך את השכבה לתשעה שבבים עם אזמל על פי התבנית.
    הערה: השאר את צד התכונה למעלה לאחר ההפרדה.
  6. אגרוף שתי יציאות הזרקת הידרוג'ל וארבע יציאות הזרקת מדיה מכל שבב באמצעות ניקוב ביופסיה 1 מ"מ ו 3.5 מ"מ, בהתאמה.
  7. נקה את השבבים המנוקבים עם סרט ללא שאריות כדי להסיר שאריות PDMS. מניחים את השבבים ותשעה כיסויי זכוכית לתוך מנקה פלזמה ולטפל בהם עם פלזמת חמצן במשך 30 s כדי ליצור מליטה covalent על פני השטח.
  8. תוציא את השבבים והכיסויים. חבר את הצד תכונה של השבבים על כיסויים.
  9. מניחים את השבבים המצורפים לתנור יבש של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להעצים את ההתחברות.
  10. מובלעת אוטומטית את השבבים לפני השימוש ולשמור אותם סטריליים לשארית ההליך.

3. שינוי פני השטח והזרקת הידרוג'ל

  1. עבור כל שבב, צינור 40 μL של 1 מ"ג / מ"ל פולי-D-ליצין (PDL) ולהזריק אותו לתעלות בשבב מיציאת הזרקת הידרוג'ל.
    הערה: ודא שה- PDL ממלא ערוצים, במיוחד בערוצים צרים ליד היציאות.
  2. דגירה השבבים ב 37 °C (69 °F) עבור 4 שעות כדי לשנות את פני השטח של PDMS .
  3. צינור 200 μL של מים סטריליים ולהזריק אותו לתוך ערוצים בשבב מיציאת הזרקת הידרוג'ל לשטוף את PDL.
  4. מוציאים את השבבים לתנור יבש של 120 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות להשבת ההידרופוביות.
  5. מניחים על קרח צינור סטרילי ולחשב את הנפח של קולגן מסוג I שישמש כמשוואה הבאה.
    נפח סופי (50 μL) x ריכוז קולגן סופי (3 מ"ג / מ"ל במחקר זה) / ריכוז בבקבוק = קולגן נפח שיתווסף
  6. חשב את הנפח של NaOH שישמש כמשוואה הבאה.
    (קולגן רב משתמשים שיש להוסיף) x 0.023 = אמצעי אחסון 1 N NaOH
  7. הכן 50 μL של הידרוג'ל בצינור כפרוטוקול הבא: להוסיף 5 μL של 10x PBS, 0.5 μL של פנול אדום, נפח מחושב של 1 N NaOH, 4 μL של 1 מ"ג / מ"ל פיברונקטין, נפח מחושב של קולגן מסוג I בתורו. הוסף את הכמות הנכונה של dH 2 Oכךנפח הכולל מגיע 50 μL. מערבבים את כל התוכן בצינור ביסודיות.
    הערה: בצע את כל הפעולות על קרח. השתמש פנול אדום כאינדיקטור מבוסס חומצה כדי לסייע בקביעה חזותית של ה- pH של הידרוג'ל. הידרוג'ל הסופי בסופו של דבר כתום כאשר ה- pH הוא כ 7.4 ואת הנוקשות היא כ 15 kPa49.
  8. פיפט 2-3 μL של הידרוג'ל עבור כל שבב ולהזריק אותו לאט לתוך ערוץ הידרוג'ל המרכזי מיציאת הזרקת הידרוג'ל.
  9. דגירה את השבבים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לאפשר ג'לציה.
    הערה: לאטום את השבבים לתוך קופסה אטומה עם 1 מ"ל של מים סטריליים אם הם לא משמשים מיד. ניתן לאחסן שבבים אטומים ב-37 מעלות צלזיוס לכל היותר 24 שעות.

4. זריעת תאים

  1. Pipet 20 μL של 125 מיקרוגרם / מ"ל Fibronectin לתוך יציאת הזרקת מדיה אחת של ערוץ תרבות התא.
  2. חותכים קצה פיפטה כדי להתאים את היציאה של ערוץ תרבות התא עם מספריים.
  3. הכנס את קצה הפיפט ליציאת הזרקת המדיה האחרת של ערוץ תרבות התאים. לאחר מכן, פלט את האוויר מערוץ תרבות התא כדי למלא אותו עם Fibronectin.
  4. דגירה השבבים ב 37 °C (69 °F) עבור 1 שעה.
  5. לפני זריעת תאים, צינור 20 μL של מדיה ECM לתוך כל יציאת הזרקת מדיה לדגר את השבבים ב 37 °C (69 °F) במשך 30 דקות.
  6. לאחר מכן, הוצא את כל המדיה בכל יציאות הזרקת המדיה.
  7. הבא, pipet 5 μL של השעיית תא לתוך יציאת הזרקת מדיה אחת של ערוץ תרבות התא. לאחר מכן, תאי אנדותל התפשטו במהירות על פני התעלה כולה תחת לחץ הידרוסטטי דיפרנציאלי.
    הערה: הכן את השעיית התא על ידי מנסה תאי אנדותל וריד טבור אנושי (HUVECs) מבקבוק התרבות וצנטריפוגה אותם ב 400 x g. לאחר מכן, resuspend את התאים ל 107 תאים / מ"ל בצינור.
  8. הוסף כ 4-6 μL של מדיה ECM ליציאה השנייה כדי להתאים את הלחץ ההידרוסטטי ולהפסיק את נעת התא.
  9. הסר את השבבים לאינקובטור התא. לאחר מכן, להפוך את השבבים כל 30 דקות עד תאי אנדותל מעיל סביב פני השטח הפנימיים של ערוץ תרבות התא 2 שעות מאוחר יותר (איור 1).
    הערה: כדי להפוך את השבב במהופך, צינור קצת מים על הגב של כיסוי. ואז השבב יכול להיצמד לכיסוי של צלחת פטרי.
  10. השתמש בקצה פיפטה כדי להסיר את התאים המצורפים ביציאות ההזרקה בזהירות רבה.
  11. לאחר מכן, הכנס ארבעה מתאמי Luer נקבה דוקרני לתוך יציאות הזרקת מדיה ולמלא עם מדיה ECM.
    הערה: המתאמים יכולים לתפקד כמאגרי נוזלים כדי לספק חומרים מזינים לתאים בתעלה.
  12. הסר את השבבים לאינקובטור התא. שנה את מדיית ECM במתאמי Luer כל 12 שעות.

5. מדידה של חדירות דיפוזיונאלית FITC-dextran

הערה: כדי להעריך את תפקוד המחסום של המיקרו-כלי, חדירות דיפוזיה של ערוץ התרבות EC עם או בלי בטנה התא מוערך.

  1. מוציאים שבב נבטי מיקרופלואידי עם הידרוג'ל מוזרק.
  2. חזור על שלבים 4.1-4.6.
  3. הסר את כל מתאמי Luer והוצא את כל המדיה בארבע יציאות הזרקת מדיה.
  4. הנח את השבב על מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקל.
  5. Pipet 5 μL של מדיה תרבות המכיל 500 מיקרוגרם / מ"ל 40 kDa FITC-dextran ליציאה אחת של ערוץ תרבות התא.
    הערה: 40 kDa FITC-dextran יש גודל מולקולרי דומה VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. לכוד תמונות כל 3 שניות במשך 30 שניות. לכן, חדירות דיפוזיה ללא רירית התא נמדדת.
  7. מוציאים את שבב הנבט המיקרופלואידי לאחר ש-HUVECs משתלבים בערוץ תרבות התאים.
  8. חזור על שלבים 5.3-5.5.
  9. לכוד תמונות כל 3 שניות במשך 30 שניות. לכן, חדירות דיפוזיה עם רירית התא נמדדת.
  10. חשב את החדירות הדיפוזיונית על-ידי כימות שינויים בעוצמת הפלואורסצנט לאורך זמן באמצעות המשוואה הבאה ששונתה50.
    Pd= (I2- I1)/(אני1-i b)· Δt) · S/d
    כאשר Pd הוא מקדם החדירות הדיפוזינלי, I1 הוא העוצמה הממוצעת בנקודת זמן ראשונית, I2 הוא העוצמה הממוצעת לאחר זמן הדלתא(Δt), Ib הוא עוצמת הרקע, S הוא אזור הערוץ בתמונות פלואורסצנטיות, ו- d הוא המרווח הכולל של מיקרו-פוסטים בתמונות פלואורסצנטיות. בעבודה הנוכחית, Δt מוגדר כ- 9 שניות.
    הערה: המשוואה הנוכחית שונה במקצתמה-50המקורית , בשל כיוון הדיפוזיה של הפלואורסצנטיות בשבב היא רק מערוץ EC לערוץ הידרוג'ל, שאינו דומה לצינור המעגלי המתפזר בכל הכיוון הרדיאלי.

6. הגדרת מערכת בקרה מיקרופלואידית

הערה: מערכת הבקרה המיקרופלואידית במחקר הנוכחי מורכבת ממשאבת מיקרו-מזרק, שסתום קמצוץ אלקטרומגנטי, שבב מלכודת בועות, שבב מיקרופלואידי, משאבה מיקרו-פריסטלית ומאגר. כל חלק של המערכת יכול להיות מוחלף על ידי חלופות מסוגל לבצע את אותה פונקציה.

  1. ייצור שבב מלכודת בועה
    הערה: שבב מלכודת הבועה משמש להסרת בועות אוויר במחזור. השבב מורכב משלוש שכבות PDMS. השכבה העליונה בנויה באמצעות ליטוגרפיה רכה ליצירת מבנה רשת כתא הנוזלי. רוחבו של כל ערוץ של מבנה הרשת הוא 100 מיקרומטר. השכבה התחתונה היא נתח PDMS עם חור. בין שתי השכבות מונח סרט PDMS בעובי 100 מיקרומטר.
    1. חזור על שלב 1 כדי להכין את הוופל עבור שבב מלכודת בועה.
    2. חזור על שלבים 2.1-2.5 כדי ליצור את השכבה העליונה ואת השכבה התחתונה של שבב מלכודת הבועה.
      הערה: הפוטומסק של השכבה העליונה מכיל שלוש ערכות של דוגמאות מילוי, לכן חותכים את שכבת ה- PDMS לשלושה שבבים בהתאם לתבנית.
    3. ניקוב שישה חורים בקצה תעלות הכניסה והשקע של השכבה העליונה באמצעות ניקוב ביופסיה של 3.5 מ"מ.
    4. ניקוב שני חורים במיקום המתאים של השכבה התחתונה באמצעות אגרוף ביופסיה 6 מ"מ בהתאם לתבנית בשכבה העליונה.
    5. חזור על שלבים 2.1-2.2 כדי להכין 10 גרם של תערובת PDMS ויוצקים אותו על מרכז רקיק סיליקון ניקה.
    6. פברק סרט PDMS 100 מיקרומטר על ידי החלת פרוטוקול ספין הבא: ספין עבור 15 s ב 500 סל"ד, להגדיל את מהירות הסיבוב ל 1,300 סל"ד ולהחזיק כאן במשך 45 s.
    7. מעבירים את הוופל לפיתה שחוממה מראש ל-180 מעלות ואופים אותה במשך 30 דקות.
    8. נקו את השכבות המנוקבות בעזרת סרט ללא שאריות להסרת שאריות PDMS. מניחים את השכבות העליונות ואת הוופל לתוך מנקה פלזמה ולטפל בהם עם פלזמת חמצן במשך 30 s כדי ליצור מליטה covalent על פני השטח.
    9. מוציאים את השכבות העליונות ואת הוופל. חברו את צד התכונה של השכבות העליונות לסרט PDMS.
    10. חותכים את הסרט בזהירות לאורך קצה השכבות העליונות עם מחט.
    11. לאט לאט להפריד את הסרט מן הוופל ולהפוך את השבבים כדי להפוך את הסרט בצד למעלה לאחר ההפרדה.
    12. מניחים את השכבות התחתונות ואת השבבים המצורפים לתוך מנקה פלזמה ולטפל בהם עם פלזמת חמצן במשך 30 s שוב.
    13. מוציאים את השכבות התחתונות ואת השבבים המחוברים. חבר את השכבות התחתונות לסרט PDMS ושבבי מלכודת הבועה נעשים.
      הערה: יישר/י את החורים בשכבה התחתונה עם התבניות בשכבה העליונה בשעת ההצמדה.
    14. מניחים את השבבים לתנור יבש 80 מעלות צלזיוס במשך שעה כדי להגביר את מליטה.
  2. הרכבת מערכת הבקרה המיקרופלואידית
    הערה: כל חלקי המערכת, כגון שבב מלכודת בועה, מאגר, צינורות ומחברים משמשים לאחר עיקור אוטוקלאב, למעט ציוד אלקטרוני. להרכיב את מערכת הבקרה microfluidic על ספסל נקי.
    1. כדי להרכיב את מערכת הבקרה המיקרופלואידית, הכינו שני צינורות פוליטרה-פלואורותילן, שני צינורות סיליקון קצרים, שלושה צינורות סיליקון ארוכים, מתאם לואר נקבה דוקרני אחד, מחבר אחד מסוג Y ושלושה מחברים מסוג L.
      הערה: היתרון של צינור polytetrafluoroethylene הוא גמישות נמוכה, ולכן, פחות מדיה נדרשת בצנרת. צינור סיליקון, לעומת זאת, יש גמישות גבוהה, ולכן, הוא מתאים שסתום קמצוץ משאבה פריאסטלית.
    2. מלאו את המזרק ב-10 מ"ל של מדיום ECM שחומם מראש (37°C).
      הערה: חימום מראש מסייע לגז המומס בשחרור בינוני.
    3. חבר צינור פוליטרפלואורותילן למזרק על ידי מתאם לואר נקבה דוקרני. לאחר מכן, חבר את הקצה השני של צינור פוליטרה-פלואוראתילן למחבר מסוג Y.
    4. לאחר מכן, חבר שני צינורות סיליקון ארוכים לשני הקצוות האחרים של מחבר מסוג Y עם צינור אחד המתחבר למאגר והצינור השני מתחבר לשבב מלכודת הבועה.
    5. חבר צינור סיליקון ארוך נוסף למאגר.
    6. לאחר מכן, השתמש בשני צינורות סיליקון קצרים כדי לחבר את כל חורי המפרצון והשקע בשכבה העליונה של שבב מלכודת הבועה. חבר צינור פוליטרה-פלואורותילן לחלק האחורי של השבב.
    7. לאחר מכן, לתקן את המזרק על משאבת מזרק מיקרו.
    8. תקצץ שני צינורות סיליקון ארוכים לתוך שסתום הצביטה האלקטרומגנטית.
    9. לאחר מכן, החלף את שסתום הצביטה האלקטרומגנטית כדי לפתוח את הצינור בין המזרק למאגר. להזריק את המדיה למאגר באמצעות משאבת מזרק מיקרו כדי למצות את האוויר בצינור.
    10. לאחר מכן, החלף שוב את השסתום כדי לפתוח את הצינור בין המזרק לשבב מלכודת הבועה. להזריק את המדיה כדי למלא את התא הנוזלי ואת הצינור האחורי של שבב מלכודת הבועה.

7. מבחני נבטי אנדותל

הערה: חממה עליונה בשלב המורכבת עם מיקרוסקופ ניגודיות פאזה משמשת במחקר הנוכחי כדי לבחון את תהליך הנבטה בזמן אמת. החממה העליונה של הבמה יכולה לשמור על הטמפרטורה, הלחות ובקרת CO2 על שלבי מיקרוסקופ, להיות טוב להדמיית תאים חיים. אבל הציוד אינו נחוץ לבדיקה. הפרוטוקולים המסופקים כאן ניתן לעבוד גם באינקובטור תא בסיסי.

  1. מוציאים שבבי נבטי אנדותל מאינקובטור התאים.
  2. לאחר מכן, הסר מתאמי Luer בצד תרבות התא. הכנס שני תקעי צינור ליציאות הזרקת הידרוג'ל של שבב הנבט המיקרופלואידי.
    הערה: התקעים יכולים להפוך ממחטים ותפקידם העיקרי הוא למנוע שפיכת מדיה.
  3. חבר את הצינור העורפי של שבב מלכודת בועה ליציאה אחת של ערוץ תרבות התא.
    הערה: ודא שאין בועות בצינור לפני החיבור.
  4. הכנס מחבר מסוג T ליציאה האחרת וחבר אותו לצינור סיליקון ארוך המחובר למאגר.
  5. חותכים את צינור הסיליקון הארוך לתוך המשאבה המיקרו-פריסטלית.
  6. לאחר מכן, הכנס מסנן אוויר למאגר.
  7. לאחר מכן, להרכיב את שבב נבטי מיקרופלואידי לחממה העליונה הבמה.
  8. לאחר מכן, חבר את משאבת הוואקום לחורים בשכבה התחתונה של שבב מלכודת בועה עם צינור TPU.
  9. הגדר את נפח זרימת הדם ואת קצב הזרימה בתוכנית המותאמת אישית, השולטת במשאבת המזרק המיקרו ושסתום הצביטה האלקטרומגנטי בו-זמנית (איור 2).
    הערה: קצב הזרימה לאורך ערוץ תרבות התא האנדותל מחושב לפי המשוואה הקלאסית.
    τ = 6μQ / Wh2
    כאשר, τ הוא מתח גזירה (dyn / cm2), μ צמיגות של המדיום (8.8 x 10-4 Pa•s), Q הוא קצב הזרימה על פני ערוץ תרבות התא האנדותל (מיליליטר / s), h הוא גובה הערוץ (70 מיקרומטר), ו- W הוא רוחב ערוץ (1,000 מיקרומטר). הצמיגות של המדיום נמדדת באמצעות צמיגות סיבובית מסוג צילינדר קואקסיאלי. הגובה והרוחב של הערוץ נקבעים מראש ומאשרים ידנית שימוש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 4. נפח זרימת הדם הוא 5 מ"ל וקצב הזרימה הוא 85 μL / min (ממוצע 0.2 מ '/s בערוץ תרבות התא) עבור 15 dyn / cm2 לחץ גזירה על פי חישוב.
  10. לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה של משאבה מיקרו-פריסטלית.
    הערה: קצב הזרימה של משאבה מיקרו-פריסטלית גבוה במקצת ממשאבת מיקרו-מזרק, על מנת למנוע מהתקשורת לשפוך.
  11. הפעל את משאבת המיקרו-מזרק. לאחר מכן, מערכת בקרת זרימת הדם הוקמה.

8. ניתוח נתונים

הערה: כדי לכמת את הנבטים, חושבו האזור המנורמל של הנבטים, אורך הנבט הממוצע ואורך הנבט הארוך ביותר. התוצאות מייצגות ממוצע ± SEM המתקבל משלושה מחקרים עצמאיים. מובהקות סטטיסטית (P < 0.05) נבחנת על ידי מבחן tשל סטודנט.

  1. לתקן תאים ונבטים בשבב נבטי microfluidic לאחר ניסויים עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 15 דקות. גרעיני כתם עם 4′,6-diamidino-2-פנילינדול דיהידרוכלוריד (DAPI; 1: 1000; סיגמא-אולדריץ') במשך 10 דקות ולאחר מכן כתם ציטוסקלטון עם פאלודין TRITC (P5285, 1: 100; סיגמא-אולדריץ') למשך שעה. לשטוף תאים עם PBS שלוש פעמים במרווחים של 5 דקות בין כל שלב.
  2. קח תמונות confocal של השבבים במצב ריצוף ולתפור אותם באמצעות תוכנת עריכת תמונה.
  3. ספור את מספר הפיקסלים הפלואורסצנטיים של תמונות הקרנת Z באמצעות קוד מותאם אישית בתוכנת תיכנות כדי לכמת אזור נבטיה מנורמל (ראה קובץ משלים).
  4. זהה ותייג באופן ידני כל קצה של נבטים בתמונות הקרנת Z וחשב מרחקים בין קצות נבטים לקרום המרתף של ECs באמצעות קוד מותאם אישית אחר לכימות אורך הנבט הממוצע ואורך הנבט הארוך ביותר (ראה קובץ משלים).

תוצאות

מודל 3D במבחנה לחקות את האירוע הראשוני של neovascularization (MIEN) המוצג כאן כלל שבב נבטי מיקרופלואידי ומערכת בקרה מיקרופלואידית. שבב הנבט המיקרופלואידי היה אופטימיזציה מפרסומיםקודמים 22,23,37,40,51,

Discussion

במשך זמן רב, התבוננות בזמן אמת של neovascularization כבר בעיה. מספר גישות פותחו לאחרונה כדי ליצור רירית כלי perfused עם ECs וצמוד מטריצה חוץ תאית עבורנבטים 22,32,40,46,54, אבל microenvironment מכני עדיין קשה לשמור כל הזמן. זה נשאר ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית לחקר מדעי הטבע של סין מענקים בסיוע (מענק מס ' 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 ו- 32071311), תוכנית מחקר ופיתוח מפתח לאומית של סין (מענק מס ' 2016YFC110110101 ו- 2016YFC102202), פרויקט 111 (B13003) והקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (4194079).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGenviewGP3108
Collagen I, rat tailCorning354236
DAPISigma-AldrichD9542
Electromagnetic pinch valveWokun TechnologyWK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM)Sciencell1001
Fetal bovine serum (FBS)Every GreenNA
FibronectinCorning354008
FITC-dextranMiragen60842-46-8
Graphical programming environmentLab VIEWNA
Image editing softwarePhotoShopNA
Image processing programImageJNA
IsopropanolSigma-Aldrich91237
Lithography equipmentInstitute of optics and electronics, Chinese academy of sciencesURE-2000/35
MethanolSigma-Aldrich82762
Micro-peristaltic pumpLead FluidBT101L
Micro-syringe pumpLead FluidTYD01
Oxygen plasmaMING HENGPDC-MG
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBS (10x)BeyotimeST448
Permanent epoxy negative photoresistMicrochemSU-8 2075
Phenol Red sodium saltSigma-AldrichP5530
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)Sigma-AldrichP7886
PolytetrafluoroethyleneTeflonNA
Program softwareMATLABNA
Recombinant Human VEGF-165StemImmune LLCHVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich1.06498
Stage top incubatorTokai HitNA
SU-8 developerMicrochemNA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma-Aldrich448931
TRITC PhalloidinSigma-AldrichP5285

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), 188 (1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved