新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

要約

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。

要約

新血管新生は、通常、既存の正常血管系から初期化され、初期段階における内皮細胞(ECs)の生体力学的微小環境は、次の新血管化の過程から劇的に変化する。新血管新生の異なる段階をシミュレートするモデルはたくさんありますが、正常な血管系微小環境の対応する刺激の下で新血管新生の初期プロセスをキャピテーションする in vitro 3Dモデルはまだ欠けています。ここでは、新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣した インビトロ 3Dモデルを再構築しました。MIENモデルはマイクロ流体発芽の破片および自動制御、非常に能率的な循環システムを含んでいる。内皮でコーティングされた機能的で透過性のマイクロチャネルが形成され、マイクロ流体発芽チップで発芽のプロセスをシミュレートした。新血管形成の初期の生理学的微小環境は、マイクロ流体制御システムで再現され、それによって、ECは高い発光せん断応力、生理学的経皮流、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布に同時に曝露されるであろう。MIENモデルは新血管新生メカニズムの研究に容易に適用することができ、薬物スクリーニングおよび毒物学の適用のための低コストのプラットホームとして潜在的な約束を保持する。

概要

新血管新生は、成人における2つの主要なプロセス^、血管新生および動脈新生⁵を含む多くの正常および病理学的プロセス^{1、2、3、4}で起こる。血管内皮成長因子(VEGF)6のような最もよく知られた成長因子のほかに、機械的刺激、特に血流誘発せん断ストレスは、新^血管新生7の調節において重要である。我々が知っているように、せん断応力の大きさと形態は脈管構造の異なる部分で劇的かつ動的に変化し、血管細胞^{8、9、10、11、12}に重要な影響を及ぼす。これまでの研究では、せん断応力が、細胞表現型の変化、シグナル伝達、遺伝子発現、および壁画細胞13、14、15、16、17、18、19、20を含むECsの様々な側面^に影響を及ぼす可能性があることを示している。したがって、新血管新血管化^{21、22、23、24を}調節する。

したがって、新血管新生をよりよく理解するためには、自然細胞微小環境でのプロセスをvitroで再構築することが重要である。近年、マイクロ血管を作り、微細構造とマイクロ流体技術の進歩を生かして、マイクロ環境25、26、27を精密に制御するモデルが確立されています。これらのモデルでは、マイクロ血管は、ヒドロゲル^28、29、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体チップ30、31、32^または3Dバイオプリンティング^33、34によって生成することができる。光性せん断応力22、23、35、36、経内皮流量37、38、39、40、血管新生因子41、42、株/ストレッチ^{43、44、45、}および他のタイプの細胞との共培養など^、微小環境のいくつかの^{側面が模倣}および制御されている。通常、大きな貯留層またはシリンジポンプを用い、浸透媒体を提供した。これらのモデルの経皮流は、リザーバーとマイクロチューブ^{22、23、38、40}の間の圧力降下によって作成された。しかし、機械的な微小環境は、このように絶えず維持するのが難しかった。高い剪断応力を伴う高い流量を灌流に使用すると、経年皮流の流れが増加し、その後生理学的レベルを超える。以前の研究では、新血管新生の初期の時期に、経内皮流の速度は、通常0.05 μm/s 8の下で、無傷のECと基部膜のために非常に低いことが示^{されました}。一方、血管系における発光せん断応力は大きく異なりますが、5-20 dyn/cm^2、11、47の平均値で比較的高い。今のところ、以前の作品における経皮流の速度は、一般的に0.5-15 μm/s^{22、38、39、40}の間に保たれているが、発光せん断応力は通常10 dyn/cm2²³の下にあった。高い発光せん断応力と経経皮流の生理学的レベルに同時にICを常に曝露することは困難な対象です。 

本研究では、新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣する in vitro 3Dモデルについて説明する。マイクロ流体チップと自動制御、高効率循環システムを開発し、灌流マイクロチューブを形成し、発芽プロセスをシミュレートしました^。MIENモデルでは、新血管新生の初期に刺激されたICの微小環境が最初に再現される。高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々なVEGF分布によって同時に、ICを刺激することができます。MIENモデルを確立するステップと注意点を説明し、他の研究者への参考文献を提供することを期待しています。

プロトコル

1. ウエハ準備

注:このプロトコルは、この研究で使用されるSU-8 2075陰性フォトレジストに固有のものです。

1. スピンコーターにメタノールとイソプロパノールを使用してシリコンウエハを3~5回洗浄します:最初に500rpmで15 sスピンし、3,000rpmで60s回転します。
2. シリコンウェーハをホットプレートに移し、180°Cに予熱し、ウエハを10分間焼きます。
3. ホットプレートからシリコンウェーハを取り出し、室温まで冷却します。スピンコーティングを進める前に、圧縮空気でウエハを再び清掃してください。ウエハの中央にSU-8 2075フォトレジストの4 mLを塗布します。
4. スピンコーターの特徴高さ70μmを取得します:最初に500rpmで12 s回転し、次に2,100 rpmで50s回転します。
5. ホットプレートでウエハースを柔らかく焼く:最初に65°Cで8分間焼き、次に95°Cで20分間焼きます。 次に、ホットプレートからシリコンウエハを取り出し、リソグラフィの前に室温まで冷却します。
6. フォトレジストフィルムにフォトマスクを置きます。200 mJ/cm 2 の総露出を達成するためにリソグラフィ装置とウエハを露出します。
   注:フォトマスクにはチップの9セットのパターンが含まれているため、毎回9個のマイクロ流体発芽チップを製造できます。
7. ポストは、ホットプレート上のウエハースを露出させます:最初に65°Cで5分間焼き、次に95°Cで20分間焼きます。 次に、シリコンウェーハをホットプレートから取り出し、現像する前に室温まで冷却します。
8. 開発を開始するためにSU-8開発者(PGMEA)で満たされたガラスペトリ皿にウエハーを転送します。
   注意:開発者は目や気道に刺激を与えています。ヒュームフードで開発を行います。操作中にスプラッシュゴーグル、ニトリル手袋、航空会社のマスクを着用してください。
9. 流路の方向に沿って皿を優しく振り、10分後に開発者を変えます。
10. パターンが明確に観察されるまで、ステップ1.9を3〜5回繰り返します。
    注:ウエハーにフォトレジスト残渣が残っていないか確認し、それ以外の場合は、再び開発者のウエハをすすいでください。
11. ウエハースを予熱ホットプレートセットを120°Cに移し、30分間焼きます。
12. シラン35μLをカバースリップにピペットし、ウエハーと一緒にカバースリップをデシケータに入れ、真空を引っ張ります。デシケータを密封し、柔らかいリソグラフィプロセス中にPDMSの接着を防ぐためにウエハをシラナナイズするために4時間真空下でウエハを残します。
    注意:シランは有毒です。中毒を防ぐために、ヒュームフードでのシナナイゼーションを行い、取り扱い中にニトリル手袋を着用してください。
13. デシケータから真空を放します。シラナイズされたウエハーを予熱したホットプレートに取り出し、65°Cで2時間焼きます。
14. 必要になるまで、ウエハーをきれいなペトリ皿に入れます。

2. マイクロ流体発芽チップの製造

1. プラスチックビーカーに20gの塩基剤と2gの硬化剤(10:1比)を組み合わせ、混合ロッドと十分に混ぜます。
2. ビーカーをデシケーターに入れ、真空を1時間引き、PDMS混合物中の気泡を取り除きます。
3. PDMS混合物をペトリ皿のウエハースに注ぎ、ペトリ皿をデシケーターに戻し、さらに30分間脱気します。
   注:両面粘着テープを使用してウェハをペトリ皿の底に接着し、脱気および硬化時にウェハが水平に保たれるようにするのに役立ちます。
4. デシケータからペトリ皿を取り出し、80°Cの乾燥オーブンに3時間置いて治します。
5. 慎重にウェハからPDMS層を分離し、パターンに従ってメスで9チップに層をカットします。
   注:分離後にフィーチャーの側面を上に置いてください。
6. 1 mm と 3.5 mm のバイオプシー パンチを使用して、各チップから 2 つのヒドロゲル注入ポートと 4 つのメディアインジェクション ポートをそれぞれパンチします。
7. パンチチップを残渣のないテープで洗浄し、PDMS残渣を除去します。チップと9個のガラスカバーリップをプラズマクリーナーに入れ、30 sの酸素プラズマで処理して表面に共有結合を形成します。
8. チップとカバーリップを取り出します。チップのフィーチャー側をカバースリップに取り付けます。
9. 取り付けたチップを80°Cの乾いたオーブンに1時間置き、ボンディングを強めます。
10. 使用前にチップをオートクレーブし、手順の残りの部分のために無菌に保ちます。

3. 表面改質とヒドロゲル注入

1. 各チップに対して、40 μLの40 μLのポリD-リジン(PDL)を1 mg/mL(PDL)に入れ、ヒドロゲル注入口からチップ内のチャネルに注入します。
   注: PDL が、特にポートの近くの狭いチャネルでチャネルを満たしていることを確認してください。
2. チップを37°Cで4時間インキュベートし、PDMSの表面を修正します。
3. 滅菌水のピペット200 μLを、ハイドロゲル注入ポートからチップ内のチャネルに注入してPDLを洗い流します。
4. 120°Cの乾燥したオーブンに3時間取り出し、疎水性を回復させます。
5. 氷の上に滅菌チューブを置き、次の式として使用されるタイプIコラーゲンの体積を計算します。
   最終容積 (50 μL) x 最終コラーゲン濃度 (本研究では 3 mg/mL) / ボトル内濃度 = 添加するボリュームコラーゲン
6. 以下の式として使用するNaOHの体積を計算します。
   (添加するボリュームコラーゲン)x 0.023 =体積1 N NaOH
7. 50 μLのヒドロゲルを次のプロトコルとしてチューブに調製します:10x PBSの5μL、フェノールレッドの0.5 μL、計算された体積の1 N NaOH、4 μLの1 mg/mLフィブロネクチン、タイプIコラーゲンの計算された体積を順番に加えます。dH₂Oの適切な量を加えて、総容積が50μLに達するようにします。
   注:氷上のすべての操作を実行します。酸ベースの指標としてフェノールレッドを使用して、ヒドロゲルのpHの視覚的決定を支援します。最終的なヒドロゲルは、pHが約7.4で、剛性が約15kPa⁴⁹のときにオレンジ色に終わります。
8. 各チップのヒドロゲルのピペット2〜3 μLを、ハイドロゲル注入口から中央ヒドロゲルチャネルにゆっくりと注入します。
9. 37°Cで30分間インキュベートし、ゲル化を可能にします。
   注:すぐに使用されていない場合は、無菌水の1 mLで密封箱にチップを密封します。密閉チップは、37°Cで、せいぜい24時間保存することができます。

4. 細胞の播種

1. 125 μg/mL フィブロネクチンのピペット 20 μL を細胞培養チャネルの 1 つの媒体注入口に入れておく。
2. 細胞培養チャネルのポートにハサミを合わせるようにピペットチップを切ります。
3. ピペットチップを細胞培養チャネルの他の媒体注入口に挿入します。次いで、細胞培養チャネルから空気をパイプアウトし、フィブロネクチンで満たす。
4. チップを37°Cで1時間インキュベートします。
5. 細胞の播種前に、各媒体注入口にECM媒体の20 μLをピペットし、30分間37°Cでチップをインキュベートする。
6. 次に、すべてのメディア インジェクション ポートのすべてのメディアをパイプアウトします。
7. 次に、細胞培養チャネルの1つの培地注入口に細胞懸濁液の5μLをピペットする。その後、内皮細胞は、差動静圧下でチャネル全体に急速に広がった。
   注:培養フラスコからヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をトリプシンして400 x gで遠心分離することによって細胞懸濁液を調製する。その後、チューブ内の細胞を10^個の7 個の細胞/mLに再懸濁させる。
8. 約4~6μLのECMメディアを他のポートに加え、静水圧を調整し、セルの移動を停止します。
9. 細胞インキュベーターにチップを取り出します。次いで、内皮細胞が細胞培養チャネル2時間後の内部表面の周りにコートするまで、30分ごとにチップを裏返す(図1)。
   注:チップを逆さまにするには、カバースリップの背面に少し水を入れます。その後、チップはペトリ皿のカバーに取り付けることができます。
10. ピペットチップを使用して、注入ポートに取り付けられたセルを非常に慎重に取り除きます。
11. 次に、4つの有刺鉄線の女性ルアーアダプターをメディアインジェクションポートに挿入し、ECMメディアで充填します。
    注:アダプターは、流路内の細胞に栄養素を提供するために流体貯留層として機能することができます。
12. 細胞インキュベーターへのチップを取り除きます。Luer アダプタの ECM メディアを 12 時間ごとに変更します。

5. FITC-デキストラン拡散透過性の測定

注:マイクロ血管のバリア機能を評価するために、細胞内層の有無にかかわらずEC培養チャネルの拡散透過性が評価される。

1. ヒドロゲルを注入したマイクロ流体発芽チップを取り出します。
2. 手順 4.1 ~ 4.6 を繰り返します。
3. すべての Luer アダプターを取り外し、4 つのメディアインジェクションポート内のすべてのメディアをパイプアウトします。
4. チップを共焦点レーザー走査顕微鏡に置きます。
5. 500 μg/mL 40 kDa FITC デキストランを含む培養培地のパイプ5 μLを、細胞培養チャネルの1つのポートに入れた。
   注:40 kDa FITCデキストランはVEGF-165(39-45 kDa)と同様の分子サイズを有します。
6. 30 s の場合は 3 s ごとに画像をキャプチャします。これにより、細胞内層を含まない拡散透過率が測定される。
7. HUVECが細胞培養チャネルでコンフルエント化した後、マイクロ流体発芽チップを取り出します。
8. 手順 5.3 ~ 5.5 を繰り返します。
9. 30 s の場合は 3 s ごとに画像をキャプチャします。これにより、細胞内層を用いた拡散透過率が測定される。
10. 次の修正式⁵⁰を用いて経時の蛍光強度の変化を定量することにより、拡散透過性を算出する。
    P_d= (I₂- I₁₎/ (I₁- I_b)·Δt)·S/d
    ここで_、Pdは拡散透過係数_、I1は初期時点での平均強度_、I2はデルタ時間(Δt)後の平均強度(Δt)、Ibはバックグラウンド強度、Sは蛍光画像のチャネルの面積、dは蛍光画像におけるマイクロポストの全間隔である。現在の作業では、Δtは9sに設定されています。
    注:この方程式は、チップ内の蛍光の拡散方向がECチャンネルからヒドロゲルチャネルに対してのみであるため、元の⁵⁰とは若干異なりますが、これはすべての放射方向に拡散する円形のチューブとは異なります。

6. マイクロ流体制御システムのセットアップ

注:本研究のマイクロ流体制御システムは、マイクロシリンジポンプ、電磁ピンチバルブ、バブルトラップチップ、マイクロ流体チップ、マイクロペリスタリックポンプ、およびリザーバで構成されています。システムの各部分は、同じ機能を実行できる代替手段によって置き換えることができます。

1. バブルトラップチップの製造
   注:バブルトラップチップは、循環中の気泡を除去するために使用されます。チップは3つのPDMS層から成っている。最上層は、液体チャンバとしてグリッド構造を形成するためにソフトリソグラフィを使用して構築されます。グリッド構造の各チャンネルは幅100μmです。下層は穴のある PDMS チャンクです。2つの層の間に、100 μmの薄いPDMSフィルムが敷設される。
   1. 手順1を繰り返して、バブルトラップチップ用のウェハを準備します。
   2. 手順 2.1 ~ 2.5 を繰り返して、バブル トラップ チップの最上層と最下層を作成します。
      注:一番上のレイヤーのフォトマスクには3組のパターンが含まれているので、パターンに従ってPDMS層を3つのチップにカットします。
   3. 3.5 mm バイオプシー パンチを使用して、最上層の入口と出口チャネルの端に 6 つの穴をパンチします。
   4. 最上層のパターンに従って6mm生検パンチを使用して、下層の対応する位置に2つの穴を開けます。
   5. ステップ 2.1~2.2 を繰り返して、10 g の PDMS 混合物を調製し、洗浄されたシリコンウエハの中央に注ぎます。
   6. 次のスピンプロトコルを適用して100 μm PDMSフィルムを製造:500 rpmで15 sスピンし、スピン速度を1,300rpmに上げ、45秒保持します。
   7. ウエハースを予熱ホットプレートセットを180°Cに移し、30分間焼きます。
   8. PDMS残基を除去するために残渣のないテープでパンチ層をきれいにします。上層とウエハーをプラズマクリーナーに入れ、30 sの酸素プラズマで処理し、表面に共有結合を形成します。
   9. トップレイヤーとウエハーを取り出します。上部レイヤーのフィーチャ側を PDMS フィルムに取り付けます。
   10. フィルムを針で上の層の端に沿って慎重に切ります。
   11. フィルムをウエハーからゆっくりと分離し、切り屑を裏返して分離後にフィルム側を上にします。
   12. 底の層と取り付けたチップをプラズマクリーナーに入れ、酸素プラズマで30sを再び処理します。
   13. 底の層と取り付けられたチップを取り出します。PDMSフィルムに底層を取り付けると、バブルトラップチップが行われます。
       注: アタッチする際に、最下部レイヤーの穴を上のレイヤーのパターンに合わせます。
   14. チップを80°Cの乾燥オーブンに1時間置き、ボンディングを強めます。
2. マイクロ流体制御システムを組み立てる
   メモ:バブルトラップチップ、リザーバ、チューブ、コネクタなど、システムのすべての部品は、電子機器を除くオートクレーブ滅菌後に使用されます。クリーンベンチでマイクロ流体制御システムを組み立てます。
   1. マイクロ流体制御システムを組み立てるには、2つのポリテトラフルオロエチレンチューブ、2つの短いシリコンチューブ、3つの長いシリコンチューブ、1つの有刺鉄線の女性ルアーアダプター、1つのYタイプコネクタ、および3つのLタイプコネクタを準備します。
      注:ポリテトラフルオロエチレンチューブの利点は、低弾性であり、したがって、より少ないメディアは、パイプラインで必要とされます。これに対してシリコーンチューブは、高い弾性を有し、従って、ピンチバルブおよび蠕動ポンプに適している。
   2. シリンジに予熱(37°C)のECM培地10mLを充填します。
      注意:予熱は、中液放出溶解ガスを助けます。
   3. ポリテトラフルオロエチレンチューブを有刺鉄ブされた女性ルアーアダプターで注射器に接続します。次に、ポリテトラフルオロエチレンチューブの他端をY型コネクタに接続します。
   4. 次に、2本の長いシリコンチューブをY型コネクタの他の2つの端に接続し、一方のチューブをリザーバに接続し、もう一方のチューブをバブルトラップチップに接続します。
   5. 別の長いシリコンチューブをリザーバーに接続します。
   6. 次に、2つの短いシリコンチューブを使用して、バブルトラップチップの最上層にあるすべての入口と出口穴を接続します。ポリテトラフルオロエチレンチューブをチップのバックエンドに接続します。
   7. 次に、注射器をマイクロシリンジポンプに固定します。
   8. 2本の長いシリコンチューブを電磁ピンチバルブにクリップします。
   9. 次に、電磁ピンチバルブを切り替えて、シリンジとリザーバの間のパイプラインを開きます。マイクロシリンジポンプを使用して媒体をリザーバーに注入し、チューブ内の空気を排出します。
   10. 次に、再度バルブを切り替えて、シリンジとバブルトラップチップの間のパイプラインを開きます。液体チャンバーとバブルトラップチップのバックエンドチューブを充填するためにメディアを注入します。

7. 内皮発芽アッセイ

注:位相コントラスト顕微鏡で組み立てられたステージトップインキュベーターを本研究で使用し、リアルタイムで発芽する過程を観察しています。ステージトップインキュベーターは、マイクロスコープステージ上で温度、湿度_、CO2 制御を維持することができ、生細胞イメージングに適しています。しかし、機器はアッセイのために必要ではありません。ここで提供されるプロトコルは、基本的な細胞インキュベーターでも働くことができる。

1. 細胞インキュベーターから内皮発芽チップを取り出す。
2. 次いで、細胞培養側のルアーアダプターを除去する。マイクロ流体発芽チップのハイドロゲル注入口に2つのパイププラグを挿入します。
   メモ:プラグは針から変換することができ、その主な機能は、メディアがこぼれるのを防ぐためです。
3. バブルトラップチップのバックエンドチューブを細胞培養チャネルの1つのポートに接続します。
   注:接続前にチューブに泡がないことを確認してください。
4. T型コネクタを他のポートに挿入し、リザーバに接続された長いシリコンチューブに接続します。
5. 長いシリコンチューブをマイクロペリスタリポンプにクリップします。
6. 次に、エアフィルターを貯留槽に挿入します。
7. 次に、マイクロ流体発芽チップをステージ上のインキュベーターに組み立てます。
8. 次に、真空ポンプをTPUチューブでバブルトラップチップの底層の穴に接続します。
9. マイクロシリンジポンプと電磁ピンチバルブを同時に制御するカスタムプログラムで循環量と流量を設定します(図2)。
   注: 内皮細胞培養チャネル全体の流量は、従来の方程式に従って計算されます。
   τ = 6μQ / Wh²
   ここで、τは剪断応力(dyn/cm2)、μは培地の粘度(8.8 x 10^-4 Pa)、Qは内皮細胞培養チャネル(ml/s)の流量、hはチャネル高さ(70μm)、Wはチャネル幅(1,000μm)である。培地の粘度は、同軸円筒型回転粘度計を用いて測定される。チャネルの高さおよび幅は、4倍の倍率で位相コントラスト顕微鏡を使用してあらかじめ決め、手動で確認する。循環量は5mLで、流量は85μL/分(細胞培養チャネルで平均0.2 m/s)で、計算に従って15 dyn/cm²のせん断応力が生じます。
10. 次に、マイクロペリスタチックポンプの流量を設定します。
    注:マイクロペリスタチックポンプの流量は、マイクロシリンジポンプよりもわずかに高く、メディアがこぼれるのを防ぎます。
11. マイクロシリンジポンプをオンにします。そして、循環制御システムが確立される。

8. データ分析

注: スプラウトを定量化するために、スプラウトの正規化された領域、平均スプラウト長、および最長のスプラウト長が計算されました。結果は、3つの独立した研究から得られた平均±SEMを表す。統計的有意性(P<0.05)は、学生の t-testによって評価されます。

1. PBSで4%パラホルムアルデヒドを15分間実験した後、マイクロ流体発芽チップ内の細胞および芽を修正します。4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール二塩酸塩(DAPI;1:1000;シグマ・アルドリッチ)10分間、そしてトリチウム・ファロイジン(P5285、1:100)で細胞骨格を染色する。シグマ・アルドリッチ) 1時間。各ステップ間の5分間隔で3回PBSで細胞を洗浄する。
2. タイルモードでチップの共焦点画像を撮り、画像編集ソフトウェアを使用してそれらをステッチします。
3. プログラミング ソフトウェアのカスタム コードを使用して Z-projection 画像の蛍光ピクセル数をカウントし、発芽の正規化された領域を定量化します (「 補足ファイル」を参照)。
4. Z投影画像のスプラウトの各先端を手動で識別してラベル付けし、平均スプラウト長と最長スプラウト長を定量化する別のカスタムコードを使用して、ECs基質膜へのスプラウトチップ間の距離を計算 します(補足ファイルを参照)。

結果

ここで提示した新血管新生(MIEN)の初期事象を模倣するin vitro 3Dモデルは、マイクロ流体発芽チップとマイクロ流体制御システムで構成されていました。マイクロ流体発芽チップは、以前の出版物22、23、37、40、51、52、53から最適化されました。

ディスカッション

長い間、新生血管のリアルタイム観察が問題となっていた。最近では^{、22,32,40,46,54}を発芽させるために、ICと並ぶ透過血管を作り出すアプローチが開発されていますが^、機械的微小環境は常に維持するのが難しいです。高い光のせん断応力と経皮流の低速度を受けるICの?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Genview	GP3108
Collagen I, rat tail	Corning	354236
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Electromagnetic pinch valve	Wokun Technology	WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM)	Sciencell	1001
Fetal bovine serum (FBS)	Every Green	NA
Fibronectin	Corning	354008
FITC-dextran	Miragen	60842-46-8
Graphical programming environment	Lab VIEW	NA
Image editing software	PhotoShop	NA
Image processing program	ImageJ	NA
Isopropanol	Sigma-Aldrich	91237
Lithography equipment	Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences	URE-2000/35
Methanol	Sigma-Aldrich	82762
Micro-peristaltic pump	Lead Fluid	BT101L
Micro-syringe pump	Lead Fluid	TYD01
Oxygen plasma	MING HENG	PDC-MG
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS (10x)	Beyotime	ST448
Permanent epoxy negative photoresist	Microchem	SU-8 2075
Phenol Red sodium salt	Sigma-Aldrich	P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Polytetrafluoroethylene	Teflon	NA
Program software	MATLAB	NA
Recombinant Human VEGF-165	StemImmune LLC	HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	1.06498
Stage top incubator	Tokai Hit	NA
SU-8 developer	Microchem	NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	448931
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P5285