إعادة بناء دائرة الدم في نموذج زرع قلب فأر البطن

Summary

يتم عرض تقنية جديدة لإعادة بناء دائرة الدم في نموذج زرع قلب فأر البطن غير النظيري.

Abstract

التقنية الجراحية لزرع القلب البطني النظائري في الفئران هو نموذج قياسي للبحوث في علم المناعة زرع. هنا، يتم تقديم تقنية المنشأة لإعادة بناء دائرة الدم المعدلة في نموذج زرع قلب البطن غير النظائري. تستخدم هذه الطريقة الوريد الأجوف السفلي داخل الصدر (IIVC) بدلا من الشريان الرئوي للقلب المتبرع للتأق إلى الوريد الأجوف السفلي للمستلم. وهو يسهل ويحسن معدلات النجاح لزرع القلب البطني في الفئران.

Introduction

تمثل التقنية الجراحية لزرع قلب البطن النظائري في الفئران نموذجا قياسيا للأبحاث في علم المناعة زرع^1،2،3. ومع ذلك، فإنه من الصعب جدا لأداء وهذا ينطوي على تقييد لاستخدام واسع النطاق لهذا النموذج^4،5.

في زرع قلب الفأر التقليدي (THTx) ، يتم أنستوموستيد الشريان الأورطي المانح والمتلقي الشريان الأورطي البطني بينما الشريان الرئوي هو anastomosed إلى المتلقي السفلي الوريد كافا^6،7،8.

في هذه التقنية المعدلة زرع قلب الفأر، هو anastomosed الشريان الأورطي المانحة إلى الشريان الأورطي البطن المتلقي والمتبرع IIVC هو anastomosed إلى المتلقي السفلي الوريد كافا^(3،4،6) ( الشكل2 والشكل 3).

Protocol

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في التوجيه 2010/63/EU للبرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية (وافقت لجنة الأخلاقيات، #G1071/09).

ملاحظة: التحضير الأولي والتخدير والرعاية بعد الجراحة وأعمال المراقبة هي نفسها التي يتم إجراؤها في الطرق الجراحية التقليدية^1و2و4. عملت فئران BALB/c كمتبرعين بالقلب وC57BL/6J كمتلقيين لزراعة الأعضاء. كانت أعمار الفئران تتراوح بين 8-12 أسبوعا ، وكان وزنها ~ 30 جراما في عملية الزرع وتم إيواؤها في ظل ظروف قياسية.

1. الخطوات التحضيرية

1. للتخدير، وإعطاء الفئران isoflurane استنشاق (2٪) حتى تغفو، تليها الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغم /كجم) + إكسيلازين (10 ملغم/كجم) + أسبرومازين (2 ملغم/كجم). للحصول على مسكن بعد الجراحة، ضعي ميتاميزول (200 ملغم/كغ) ص وكاربروفين (5 ملغم/كغ) ق.c.
   ملاحظة: تم الامتناع عن استخدام المضادات الحيوية عن قصد لأن هذه المواد قد تؤثر على الاستجابات المناعية.
2. لإجراء الجراحة، استخدم مجموعة من الأدوات المجهرية بما في ذلك مقص صغير، ملقط صغير، حامل إبرة والمشابك الهيموستاتيكية الدقيقة. قلم الجراحة الكهربائية ضروري أيضا. إجراء الغرز باستخدام 7/0er، 10/0er و 4/0er أنواع النايلون.
3. ضع الماوس في صندوق لاستنشاق الأيزوفلوران (2٪) لمدة 40-60 ثانية. تحديد عمق التخدير عن طريق الضغط على مخلب مع ملاقط. إذا كان هناك نقص كامل في الاستجابة لهذا التحفيز، انتقل إلى الخطوة التالية.
4. بمجرد أن يسقط الماوس نائما، وزن الماوس.
5. تطبيق حقن داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغ / كغ) + xylazine (10 ملغ / كغ) + acepromazine (2 ملغ / كغ) على الماوس تخدير.
6. قص فرو البطن ووضع الماوس على طاولة العملية. إجراء التطهير باستخدام يوديد بوفيدوني لمدة 3 مرات، ثم الستائر بشكل صحيح الماوس باستخدام منشفة جراحية fenestrated.

2. إجراء عملية المانحين

1. استخدم مقصا لقطع الجلد من الرقبة إلى أسفل البطن، وقشر الطبقة الكاملة من الجلد إلى خط الوسط لكلا المحورين.
2. استخدم مقصا لقطع عضلات جدار البطن وتحريك الأحشاء برفق إلى اليسار (من وجهة نظر المشغل). التفاف بعيدا الأحشاء مع شاش محلول ملحي مبسج لفضح بأمان كافا الوريد السفلي.
3. استخدام حقنة 1 مل لحقن 0.4 مل من محلول الهيبارين (يحتوي على 500 يو الهيبارين) ببطء في كافا فينا أقل وانتظر لمدة 1 دقيقة قبل سحب الإبرة.
4. سحب الإبرة واستخدام مقص صغير لقطع كل من كافا الوريد السفلي والهرطي البطني لتسريع exsanguination.
5. استخدام مقص لفتح تجويف الصدر عن طريق تنفيذ قطع على شكل حرف u; كشف تماما القلب والرئتين وجميع الأوعية الدموية الصدر.
   1. فضح الشريان الأورطي الصدري، وقطع 1/2 من التجويف، ومن ثم قطع الوريد الرئوي لتسهيل الري والصرف الصحي.
   2. أدخل أنبوب الري في افتتاح الشريان الأورطي الصدري، وحقن ما لا يقل عن 2 مل من 4 درجة مئوية الباردة الهستيدين-تريبتوفان-كيتوغلوتارات حل القلب (حل Custodiol HTK)⁹ حتى تدفق الوريد الرئوي واضح تماما والقلب يتوقف تماما عن النبض.
6. سحب أنبوب الري وفصل القص.
7. استخدام مقص صغير لإزالة الغدة الصعترية وتجريد قليلا من الدهون حول القوس الأبهري.
8. استخدام ملقط مستقيم ومنحني لفضح وligate جذع النابض الشرياني (على الجانب الأيمن من القوس الأبهري) مع خياطة 10/0.
9. استخدام ملقط صغير لفصل الدهون والأنسجة الضامة تعلق على IIVC، وفضح وligate الكافا فينا متفوقة (على الجانب الأيسر من القوس الأبهري) مع خياطة 7/0 واستخدام مقص صغير لقطع عليه وراء الربط.
10. جعل خياطة 7/0 حول قاعدة القلب تحت القوس الأبهري، وIIVC، وكلاهما auricles. ثم يلفظ أغصان الشريان الرئوي وأوعية الرئة الوريدية.
11. استخدام مقص صغير لتقطر القوس الأبهري قدر الإمكان، والأوعية الرئة تحت الرباط وIIVC بالقرب من الحجاب الحاجز. أخرج القلب من الصدر.
12. ضع قلب المتبرع المستئصال في محلول HTK القلبي البارد 4 درجات مئوية والحفاظ عليه مؤقتا.

3. إجراء عملية المستلم

ملاحظة: خطوات العملية الأولية مشابهة لتلك التي تم عرضها مسبقا للفأرة المانحة، بما في ذلك التخدير والتطهير.

1. إجراء قطع الجلد البطن بطريقة عرضية، وتغطية أعضاء البطن بالشاش الرطب باستخدام محلول ملحي.
2. استخدام ملقط صغير لفضح كافا الوريد السفلي والبطن الشريان الأورطي وتحريرها من الأنسجة الدهنية المحيطة بها.
3. استخدام ملقط صغير لligate أو electrocauterize الأوعية فرع الجانب (الجانبية أو تحت الوريد / الشريان الأورطي) تحت الأوعية الكلوية.
4. استخدام ملقط قضيب مقطع لوضع اثنين من المشابك الهيموستاتيكية الدقيقة في الجزء البطني من الوريد / الشريان الأورطي القادمة من اليمين ترك مسافة أكثر من 1 سم لكل من الشريان الأورطي / الوريد لضمان مساحة لبناء الأقموس بينهما.
5. استخدام مقص صغير لجعل شق في الشريان الأورطي أقرب قليلا إلى المشبك أقل من المشبك العلوي. بدلا من ذلك، استخدم إبرة 30 G لجعل حفرة صغيرة وفتحه مع مقص صغير.
6. ضع الماوس المستلم بحيث تواجه الشريان الأورطي عامل التشغيل مع كافا vena على الجانب الآخر. ثم ضع القلب في تجويف البطن وتغطيته بوسادة شاش مبللة صغيرة.
7. استخدام خياطة 10/0 لتكييف وغرزة الشريان الأورطي المانحة إلى الشريان الأورطي المتلقي بدءا caudally، وجعل عقدة والمضي قدما مع خياطة تشغيل إلى الجزء العلوي من شق (حوالي 4-5 غرز). بعد ذلك ، قلب القلب إلى اليمين (من وجهة نظر الموضوع) ، وتغطيته مرة أخرى ومواصلة خياطة على الجانب الأيسر حتى الوصول إلى نهاية caudal وعقدة عليه.
8. استخدام أنبوب الري لحقن ما لا يقل عن 0.5 مل من 4 °C HTK حل أمراض القلب لطرد IIVC المانحة.
9. استخدام مقص صغير لقطع حفرة مستديرة على البطن السفلي الوريد كافا من المتلقي، والتي ينبغي أن يكون لها نفس حجم التجويف IIVC المتبرعين. يجب أن يكون الشق فوق فتحة الصمام الأبهري. جعل شق الوريد أكبر من شق الأبهر.
10. استخدام خياطة 10/0 لخياطة IIVC المانحة إلى المتلقي فينا كافا بدءا caudally. ربط عقدة وإجراء خياطة تشغيل حتى يتم التوصل إلى الجزء العلوي من الشق. استخدام خمس غرز ومواصلة خياطة على اليسار. وأخيرا، ربط عقدة في الزاوية الذيل، وتشديد بعناية (يجب الحرص على عدم سحب ضيق جدا).
11. ضع الأجزاء الصغيرة من الإسفنج الهيموستاتيكي حول الوريد و الإنسان الأبهري.
12. استخدام ملقط قضيب مقطع لإزالة أولا المشابك السفلي ثم العلوي الهيموستاتيكية الصغيرة وشطف تجويف البطن مع 38.0 درجة مئوية خفف 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
13. استخدام ملقط صغيرة لاتخاذ بعيدا اسفنجة الهيموستاتيكي.
14. مراقبة ضربات القلب المزروعة.
15. استخدم ملقط لوضع الأمعاء مرة أخرى في تجويف البطن وغرز طبقتين (عضلات البطن تليها الجلد) لإغلاق جرح البطن مع خياطة 4/0.
16. ضع الفئران في غرفة محطة عمل للتحكم في الأكسجين ودرجة الحرارة (على سبيل المثال، INVIVO2-400) لتوفير بيئة دافئة وغنية بالأوكسجين للفئران المزروعة للتعافي، انتظر حتى تستيقظ الفئران.
17. للحصول على مسكن بعد الجراحة، أعطي Metamizol مباشرة 200 ملغم/كغ لكل نظام تشغيل بعد العملية. بعد أربع ساعات و 16 ساعة من العملية إعطاء ميتاميزول 200 ملغم / كغ لكل نظام التشغيل + كاربروفين (5mg /kg) ق.c. في المتابعة الأخرى، امنح كاربروفين (5 ملغم/كغ) ق.c للفئران المزروعة كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام متتالية بعد العملية.

النتائج

هنا، يتم تقديم تقنية معدلة لزرع قلب البطن النظائري في الفئران التي تم تطويرها سابقا في مختبرنا وثبت أنها مفيدة على مدى السنوات ال 16 الماضية. سابقا, أفيد أنه في إجمالي 40 حالات الوريد كافا إلى الوريدا كافا (V-V المجموعة) مقارنة مع 40 حالات الشريان الرئوي التقليدي إلى الوريدا كافا (P-V المجموعة) إج...

Discussion

التقنية الجراحية لزرع القلب البطني النظائري في الفئران صعبة للغاية وهذا ينطوي على تقييد للاستخدام الواسع النطاق لهذا النموذج.

أحد عيوب التقنية التقليدية هو الحد من طول الشريان الرئوي للمتبرع (PA). وعادة ما يكون طوله حوالي 2 مم، في حين أن طول IIVC للقلب المتبرع المستخدم في نموذج...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P
BALB/c AnNCrl mice	Charles River. Germany	no catalog number
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14
Curved forceps	WPI	14114-G
custodiol/HTK	Dr. Franz Köhler Chemie	no catalog numer
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30
Hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820
Ice box	PETZ	No Catalog Number available
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616
insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml
ketamine	Zoetis	no catalog numer
metamizole	WDT	no catalog numer
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06
Microscope	Leica	LEICAMZ6
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED
Saline solution (NaCl 0.9%)	Haus-Apotheke	PZN 06178437
Scissors	Peha Instruments	991083/4
small Petri dish	Sarstedt	833900
Straight forceps	WPI	14113-G
surgical tape	BSN	4120
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H
Syringe (0.3 mL)	BD	324826
Syringe (1 mL)	BD	320801
xylazine	Bayer	Rompun